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摘要：【目的】明确江浙地区秀珍菇双翅目害虫的种类、发生规律及其生物防治方法，为秀珍菇双翅目害虫防控提供科学依据。【方法】在江苏灌南、高淳和浙江淳安、江山的7个秀珍菇栽培基地采集双翅目害虫虫样，采用形态学特征和分子生物学方法对虫样进行分类鉴定;采用黄板诱虫法监测秀珍菇出菇棚害虫全年动态消长规律，绘制双翅目害虫消长动态曲线;在秀珍菇出菇期，采用喷雾法测定1%印楝素水分散粒剂1000倍稀释液和1200 ITU/mg苏云金芽孢杆菌以色列变种（Bti）可湿性粉剂500倍稀释液对双翅目害虫的防治效果。【结果】在江浙地区7个秀珍菇栽培基地采集虫样70份，通过形态学和分子生物学鉴定发现当地秀珍菇栽培中受到4科[眼蕈蚊科（Sciaridae）、蚤蝇科（Phoridae）、果蝇科（Drosophilidae）和瘿蚊科（Cecidomyiidae）]5属[迟眼蕈蚊属（Bradysia impatiens）、厉眼蕈蚊属（Lycoriella ingenua）、异蚤蝇属（Megaselia tamilncduensis）、果蝇属（Drosophila glabriapex）和瘿蚊科未知属]双翅目虫害的危害，其中迟眼蕈蚊属的异迟眼蕈蚊发生范围最广、样本数最多;黄板监测结果显示，江浙地区秀珍菇双翅目害虫全年在 5—7月和9—10月出现两个高峰;对害虫的防治试验结果表明，印楝素和Bti对秀珍菇上的双翅目害虫均有明显的杀虫活性，第2次用药15 d后黄板上的平均成虫数分别只有89.73和101.27只/板，明显少于对照虫数（281.23只/板），印楝素防治效果略优于Bti，但差异不显著（P>0.05）。【结论】迟眼蕈蚊属的异迟眼蕈蚊是江浙地区秀珍菇栽培中害虫种类的优势种群;在江浙地区秀珍菇出菇棚中雙翅目害虫全年有两个发生高峰，分别为5—7月和9—10月;印楝素和Bti两种生物药剂对秀珍菇上的双翅目害虫均有明显的杀虫效果，可作为防治秀珍菇双翅目害虫的药剂在生产上推广使用。
关键词： 秀珍菇;双翅目;害虫;鉴定;生物药剂;防治效果
中图分类号： S436.46 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）01-0068-06
0 引言
【研究意义】秀珍菇学名肺形侧耳（Pleurotus pulmonarius），隶属于担子菌纲（Basidiomycetes）伞菌目（Agaricales）侧耳科（Pleurotaceae）侧耳属（Pleurotus）（陈躬国等，2017）。秀珍菇属变温结实性菌类，子实体生长温度5～30 ℃，最适生长温度8～20 ℃（刘跃钧等，2003）。国内秀珍菇栽培模式以反季节设施栽培为主，根据秀珍菇变温结实的特性，江苏、浙江等地秀珍菇出菇期集中在5～10月全年气温较高时期，栽培过程中常受到多种害虫的危害，以双翅目害虫的危害尤为严重，害虫咬食菌丝体和子实体，使秀珍菇的产量和品质受到严重影响。据不完全统计，虫害引起的食用菌产量损失一般为总产量的20%～30%，严重时甚至绝收（温志强和边广，2011）。因此，明确江浙地区危害秀珍菇的害虫种类和发生规律，为害虫综合防控提供准确的用药时间、方式和种类，减少害虫对秀珍菇产量的影响及乱用药导致的药害农残等食品安全问题，对保障江浙地区秀珍菇产业健康发展具有重要意义。【前人研究进展】目前我国食用菌上双翅目害虫种类有20科49属，与秀珍菇相关的仅有眼蕈蚊科和蚤蝇科2科4种（李建波和何璞，2017），且栽培气候、环境、品种等均会对害虫种类产生明显影响，同时害虫的田间发生规律与栽培环境更是息息相关（李光强，2009）。温志强和边广（2011）采用诱集成虫的方法统计了福建省秀珍菇上菇蚊菇蝇的全年消长规律，但其栽培模式与江浙地区存在明显差异，而其他地区仅有平菇虫害发生规律的报道（姜婷婷等，2016）。对秀珍菇上双翅目害虫应用黄色粘虫板、诱虫灯、黑光灯等诱杀成虫是防治效果明显的主要物理措施（曲绍轩等，2010;孔繁建等，2016），高效氯氰菊酯、吡虫啉和除虫脲等杀虫剂对秀珍菇上的双翅目害虫均有明显的杀虫活性（韩文贺，2016;雷雨霞等，2016）。个别菇农采用敌敌畏、毒死蜱、乙虫腈等杀虫剂会对秀珍菇造成药害，给食用菌产品安全带来隐患（赵晓娜等，2011;张孔金等，2012）。微生物（沈迎春等，2017）和植物源杀虫剂（曲绍轩等，2012;兰玉菲等，2016）是生产无公害食用菌优先选用的农药品种，但在江浙地区秀珍菇上使用生物杀虫剂对双翅目害虫效果的相关研究未见报道。【本研究切入点】秀珍菇最初由台湾引进到福建种植，近年来逐渐在经济发达的江浙地区大面积栽培，并形成了江浙地区独特的栽培模式，栽培期间发生的双翅目害虫种类、发生规律等均与其他地区存在差异，而目前已有报道多为福建地区的发生规律和防治措施，在江浙地区栽培中应用效果欠佳。因此，本课题组在对江浙地区秀珍菇害虫发生情况进行多次采样并完成室内毒力试验的基础上，拟结合江浙地区特殊的补水方式，将用药方式由单一的喷雾改为喷雾加倒扣吸水，以增加药液与害虫幼虫接触的机会，提高杀虫效果。【拟解决的关键问题】在江浙地区7个秀珍菇栽培基地采集双翅目害虫虫样，结合形态学特征和分子生物学方法对虫样进行分类鉴定，采用黄板诱虫法监测秀珍菇出菇棚内害虫全年动态消长规律，并在秀珍菇出菇期开展印楝素和苏云金芽孢杆菌以色列变种（Bacillus thuringiensis var. israelensis，Bti）两种生物药剂对双翅目害虫的防治效果试验，以期为江浙地区秀珍菇出菇期害虫的综合防控提供科学依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
秀珍菇品种为台秀57。供试药剂为1%印楝素（Azadirachtin）水分散粒剂（成都绿金生物科技有限责任公司）和1200 ITU/mg Bti可湿性粉剂（武汉科诺生物科技股份有限公司）。 1. 2 双翅目虫样的采集与鉴定
1. 2. 1 虫样采集方法 在江苏灌南、高淳和浙江淳安、江山的7个秀珍菇栽培基地（表1）开展双翅目害虫虫样采集，幼虫从秀珍菇培养料或子实体中采集，成虫从秀珍菇菌袋或子实体上采集，每个基地随机采集活跃的幼虫、成虫虫样各5份，分别浸泡于装有1.0 mL 75%乙醇的离心管中保存。
1. 2. 2 形态学鉴定 形态学鉴定以成虫观察为主。将采集的虫样按张晓云等（2007）的方法制作成玻片标本在显微镜下观察，主要观察成虫头部的复眼、触角和唇基，胸部的足和翅脉，腹部的尾器等部位（沈登荣等，2009），参考蔡邦华（2015）昆虫分类学双翅目的分类描述，将虫样鉴定到科。
1. 2. 3 分子生物学鉴定 取采集的单只幼虫或成虫于1.5 mL离心管中，加入适量液氮研磨呈粉状后，提取基因组DNA。PCR扩增线粒体COI基因片段，正向引物为CI-J-1751（5'-GGAGCTCCTGACATAGC
ATTCCC-3'），反向引物为CI-N-2191（5'-CCCGGTA
AAATTAAAATATAAACTTC-3'），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系25.0 μL：I5 Mix 12.5 μL，正、反向引物（10 pmol/μL）各1.0 μL，基因组DNA模板1.0 μL，超纯水9.5 μL。扩增程序：98 ℃预变性2 min;98 ℃ 10 s，47 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环;72 ℃延伸5 min。扩增产物由擎科生物工程（南京）股份有限公司进行测序，测序结果通过在NCBI上BLAST比对结果初步确认虫样分类学地位。
1. 3 双翅目害虫的全年消長规律监测
在秀珍菇出菇棚中悬挂黄色黏虫板（25 cm×40 cm），距离出菇袋上方0.5 m左右，纵向间隔5.0 m，横向每排悬挂2张，每10 d记录1次黄板上的虫口数，每月3次，每次记录结束后全部更换新的黄板。大棚类型选择江浙地区常用的覆盖防虫网的塑料薄膜拱形大棚和未覆盖防虫网的彩钢瓦棚顶通风大棚，记录大棚内全年36次所有黄板上成虫数，计算每次黄板上的平均成虫数量，以此为依据对双翅目害虫消长规律进行监测。
1. 4 生物农药对双翅目害虫的防治效果试验
采用喷雾法（马林等，2017）测定1%印楝素水分散粒剂1000倍稀释液和1200 ITU/mg Bti可湿性粉剂500倍稀释液在秀珍菇出菇期对双翅目害虫的防治效果。秀珍菇栽培按照秀珍菇生产技术规程（DB 33/T 526—2012）进行出菇管理，大棚类型为覆盖防虫网的塑料薄膜拱形大棚，每棚内排放12000袋秀珍菇出菇袋，1号棚使用Bti药剂，2号棚使用印楝素，3号棚为对照棚。第1次用药为秀珍菇开袋后浇水前用药，第2次用药为第1潮菇采收结束后，结合下架倒扣补水进行给药，将药剂加入补水液中，连续补水2 d，使倒扣菌袋充分吸水的同时吸入药液。通过出菇房内悬挂黄板上的双翅目害虫成虫数反映防治效果。出菇房内黄板悬挂方法同1.3，每次用药后10 d全部更换新黄板，15 d时记录黄板上的平均成虫数量。
1. 5 统计分析
运用SPSS 20.0计算黄板上成虫的平均数和标准差。利用One-way-ANOVA方差分析法（Ross and Willson，2017）对不同处理间的成虫数量进行统计分析，利用Duncan’s新复极差法（Thonghua and Thonghua，2015）进行多重比较。
2 结果与分析
2. 1 江浙地区秀珍菇双翅目虫样鉴定结果
在江浙地区7个秀珍菇栽培基地采集虫样70份，通过形态学和分子生物学鉴定，结果如表1所示。70份样本分别属于4科[眼蕈蚊科（Sciaridae）、蚤蝇科（Phoridae）、果蝇科（Drosophilidae）和瘿蚊科（Cecidomyiidae）]5属[迟眼蕈蚊属（Bradysia）、厉眼蕈蚊属（Lycoriella）、异蚤蝇属（Megaselia）、果蝇属（Drosophila）和瘿蚊科未知属]。采样地点不同，害虫种类存在差异，其中，迟眼蕈蚊属的异迟眼蕈蚊分布最广、样本数最多，是江浙地区秀珍菇栽培中的优势种群;厉眼蕈蚊属仅在江苏出现，在浙江未采集到样本;其余3种仅在浙江出现，江苏未采集到样本，其中异蚤蝇属只在浙江江山出现，而果蝇属和瘿蚊科Cecidomyiidae sp.仅在浙江淳安采集到。通过测序和比对发现COI基因片段与NCBI上已公布的昆虫同源性均在98%以上。
2. 2 江浙地区秀珍菇双翅目害虫的全年消长规律
江浙地区秀珍菇出菇棚中双翅目害虫全年的动态消长规律如图1所示，害虫数量与大棚内秀珍菇栽培阶段和气温有明显的相关性。从栽培阶段来看，随着5月初菌袋开始开袋，大棚内双翅目害虫成虫数量开始增加，10月底—11月初出菇结束，11月底出菇棚内所有菌袋全部清空，虫口数量又回落至最低点，12月—翌年4月为空棚期和发菌期，出菇棚内虫口数量一直处于最低点。从气温来看，5月初气温开始稳定且逐步上升至20 ℃以上，8月为夏季气温最高期，大棚内温度可达40 ℃以上，9月气温开始回落，至11月温度降至20 ℃左右，此阶段成虫消长规律与双翅目害虫最适生存温度范围一致，有2个明显的发生高峰，即5—7月和9—10月，在11月底—翌年4月底基本无虫害发生。从有无覆盖防虫网的2个大棚虫量曲线可看出，防虫网可起到明显的减少虫口基数的作用。
2. 3 生物农药对双翅目害虫的防治效果
从2次用药15 d后黄板上诱集到的双翅目害虫成虫数量（表2）可看出，分别喷施Bti和印楝素后秀珍菇大棚内黄板上的成虫数量均比对照明显减少，防效显著（P<0.05，下同）。第1次用药15 d后，Bti处理大棚内黄板上的虫数多于印楝素处理大棚，说明Bti防效低于印楝素，且差异达显著水平;而第2次用药15 d后从黄板上的虫数可看出虽然Bti的防效仍低于印楝素，但差异不显著（P>0.05），可能与Bti作用效果较慢有关。 3 討论
目前，我国已报道的为害食用菌的双翅目害虫主要涉及长角亚目、短角亚目和芒角亚目的20科49属，其中眼蕈蚊科有6属27种（李建波和何璞，2017）。罗佳和庄秋林（2007）对福建省食用菌上发生的双翅目害虫种类进行调查发现有10科27种;沈登荣等（2009）发现云南省食用菌栽培地眼蕈蚊科害虫有6属11种，其中平菇厉眼蕈蚊和异迟眼蕈蚊为云南省食用菌上眼蕈蚊的主要优势种类。本研究仅针对江浙地区7个秀珍菇栽培基地的双翅目害虫进行采样和分类鉴定，虫样种类相对简单，只有4科5属，但优势种群与其他地区一致，均为迟眼蕈蚊属的异迟眼蕈蚊。
食用菌昆虫群落动态变化在春秋两季随着季节温度的变化呈一定规律性，但受食用菌品种、栽培环境、栽培方式和人为因素的影响而有所变化（李光强，2009）。福建省秀珍菇上菇蚊菇蝇一年出现两个高峰期，分别是3—7月和9—12月（温志强和边广，2011）;山东省平菇出菇期害虫种群动态出现春秋两个高峰，分别在4—5月和9月（王丹丹，2012）;广西南宁市平菇上菇蚊菇蝇的为害高峰期在3—4月（王瑾，2013）;辽宁沈阳地区平菇的主要害虫平菇厉眼蕈蚊和泰纳异蚤蝇的暴发期分别在3—6月和9—10月（张超逸，2017）。福建、山东、广西和辽宁分别代表了我国东南、中部、西南和东北地区菇蚊菇蝇的发生规律，而本研究的检测地点恰好代表了中东部沿海地区秀珍菇双翅目害虫的发生规律，与福建相似，一年出现两个高峰（5—7月和9—10月）。
在食用菌双翅目害虫的生物防治方面，苏云金芽孢杆菌以色列变种是专门针对双翅目蚊蝇害虫的一种生物杀虫剂（师迎春等，2014），通过产生的伴孢晶体对害虫幼虫有特异的杀虫活性，对成虫无效（马林等，2015）。印楝素是目前世界上最优秀的植物源农药，具有拒食、抑制生长发育、诱导细胞凋亡和自噬的作用，对昆虫幼虫和成虫均有效果（徐汉虹等，2017）。宋爽等（2015）研究表明，印楝素在平菇上防治双翅目害虫的效果优于Bti，且对平菇子实体生长无影响。本研究结果与宋爽等（2015）的研究结论相似。本研究中用药方式与当地特殊的补水方式结合，菌袋倒扣在地面吸水，使药液与出菇袋口结合更紧，药液吸收更彻底，解决了墙式栽培时喷雾的药液多数流出菌袋，降低药效的问题。由于供试两种生物农药作用机理完全不同，在实际生产中可轮换使用，以减缓害虫抗药性的产生。
4 结论
江浙地区秀珍菇栽培中受到4科（眼蕈蚊科、蚤蝇科、果蝇科和瘿蚊科）5属（迟眼蕈蚊属、厉眼蕈蚊属、异蚤蝇属、果蝇属和瘿蚊科未知属）双翅目害虫的危害，其中迟眼蕈蚊属的异迟眼蕈蚊为优势种群。江浙地区秀珍菇出菇棚中双翅目害虫全年有两个发生高峰，分别为5—7月和9—10月，在11月底—翌年4月底基本无虫害发生。Bti和印楝素两种生物药剂对秀珍菇上的双翅目害虫均有明显的杀虫效果，且对秀珍菇生长无影响，两种生物药剂均可作为防治秀珍菇双翅目害虫的药剂在生产上推广使用。
参考文献：
蔡邦华. 2015. 昆虫分类学[M]. 修订版. 北京： 化学工业出版社： 748-882. [Cai B H. 2015. Entomological Taxonomy[M]. Revised Edition. Beijing：Chemical Industry Press： 748-882.]
陈躬国，林原，刘新锐，赵光辉，陈剑. 2017. 秀珍菇遗传育种研究进展[J]. 热带作物学报，38（7）：1377-1381. [Chen G G，Lin Y，Liu X R，Zhao G H，Chen J. 2017. Recent advances in genetics and breeding of Pleurotus pulmonarius [J]. Chinese Journal of Tropical Crops，38（7）：1377-1381.]
韩文贺. 2016. 4种农药对秀珍菇虫害防治及产品安全性影响的研究[J]. 食用菌，（4）： 48-50. [Han W H. 2016. The study on the pest control of Pleurotus geesteranus and the effect of product safety on four pesticides[J]. Edible Fungi，（4）： 48-50.]
姜婷婷，覃培升，黎金锋，刘斌，李子玲，谭梦超，王瑾，吴宗华，梁锟，罗燕卿. 2016. 广西南宁市平菇蚊、蝇类害虫常见种鉴定及消长规律研究[J]. 南方农业学报，47（1）： 67-73. [Jiang T T，Qin P S，Li J F，Liu B，Li Z L，Tan M C，Wang J，Wu Z H，Liang K，Luo Y Q. 2016. Common species identification and growth-declinelaw of mosquitoes and flies damaging Pleurotus ostreatus in Nanning，Guangxi[J]. Journal of Southern Agriculture，47（1）： 67-73.]
孔繁建，张智，谢爱婷，吴晓晨，师迎春，崔丽娥. 2016. 黄板不同悬挂位置和高度对平菇菇房眼蕈蚊诱杀效果的影响[J]. 中国植保导刊，36（4）： 34-36. [Kong F J，Zhang Z，Xie A T，Wu X C，Shi Y C，Cui L E. 2016. The trapping effects of yellow boards hanged different location and height against sciaridae in Pleurotus ostreatus mushroom house[J]. China Plant Protection，36（4）： 34-36.]
关键词： 秀珍菇;双翅目;害虫;鉴定;生物药剂;防治效果
中图分类号： S436.46 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）01-0068-06
0 引言
【研究意义】秀珍菇学名肺形侧耳（Pleurotus pulmonarius），隶属于担子菌纲（Basidiomycetes）伞菌目（Agaricales）侧耳科（Pleurotaceae）侧耳属（Pleurotus）（陈躬国等，2017）。秀珍菇属变温结实性菌类，子实体生长温度5～30 ℃，最适生长温度8～20 ℃（刘跃钧等，2003）。国内秀珍菇栽培模式以反季节设施栽培为主，根据秀珍菇变温结实的特性，江苏、浙江等地秀珍菇出菇期集中在5～10月全年气温较高时期，栽培过程中常受到多种害虫的危害，以双翅目害虫的危害尤为严重，害虫咬食菌丝体和子实体，使秀珍菇的产量和品质受到严重影响。据不完全统计，虫害引起的食用菌产量损失一般为总产量的20%～30%，严重时甚至绝收（温志强和边广，2011）。因此，明确江浙地区危害秀珍菇的害虫种类和发生规律，为害虫综合防控提供准确的用药时间、方式和种类，减少害虫对秀珍菇产量的影响及乱用药导致的药害农残等食品安全问题，对保障江浙地区秀珍菇产业健康发展具有重要意义。【前人研究进展】目前我国食用菌上双翅目害虫种类有20科49属，与秀珍菇相关的仅有眼蕈蚊科和蚤蝇科2科4种（李建波和何璞，2017），且栽培气候、环境、品种等均会对害虫种类产生明显影响，同时害虫的田间发生规律与栽培环境更是息息相关（李光强，2009）。温志强和边广（2011）采用诱集成虫的方法统计了福建省秀珍菇上菇蚊菇蝇的全年消长规律，但其栽培模式与江浙地区存在明显差异，而其他地区仅有平菇虫害发生规律的报道（姜婷婷等，2016）。对秀珍菇上双翅目害虫应用黄色粘虫板、诱虫灯、黑光灯等诱杀成虫是防治效果明显的主要物理措施（曲绍轩等，2010;孔繁建等，2016），高效氯氰菊酯、吡虫啉和除虫脲等杀虫剂对秀珍菇上的双翅目害虫均有明显的杀虫活性（韩文贺，2016;雷雨霞等，2016）。个别菇农采用敌敌畏、毒死蜱、乙虫腈等杀虫剂会对秀珍菇造成药害，给食用菌产品安全带来隐患（赵晓娜等，2011;张孔金等，2012）。微生物（沈迎春等，2017）和植物源杀虫剂（曲绍轩等，2012;兰玉菲等，2016）是生产无公害食用菌优先选用的农药品种，但在江浙地区秀珍菇上使用生物杀虫剂对双翅目害虫效果的相关研究未见报道。【本研究切入点】秀珍菇最初由台湾引进到福建种植，近年来逐渐在经济发达的江浙地区大面积栽培，并形成了江浙地区独特的栽培模式，栽培期间发生的双翅目害虫种类、发生规律等均与其他地区存在差异，而目前已有报道多为福建地区的发生规律和防治措施，在江浙地区栽培中应用效果欠佳。因此，本课题组在对江浙地区秀珍菇害虫发生情况进行多次采样并完成室内毒力试验的基础上，拟结合江浙地区特殊的补水方式，将用药方式由单一的喷雾改为喷雾加倒扣吸水，以增加药液与害虫幼虫接触的机会，提高杀虫效果。【拟解决的关键问题】在江浙地区7个秀珍菇栽培基地采集双翅目害虫虫样，结合形态学特征和分子生物学方法对虫样进行分类鉴定，采用黄板诱虫法监测秀珍菇出菇棚内害虫全年动态消长规律，并在秀珍菇出菇期开展印楝素和苏云金芽孢杆菌以色列变种（Bacillus thuringiensis var. israelensis，Bti）两种生物药剂对双翅目害虫的防治效果试验，以期为江浙地区秀珍菇出菇期害虫的综合防控提供科学依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
秀珍菇品种为台秀57。供试药剂为1%印楝素（Azadirachtin）水分散粒剂（成都绿金生物科技有限责任公司）和1200 ITU/mg Bti可湿性粉剂（武汉科诺生物科技股份有限公司）。 1. 2 双翅目虫样的采集与鉴定
1. 2. 1 虫样采集方法 在江苏灌南、高淳和浙江淳安、江山的7个秀珍菇栽培基地（表1）开展双翅目害虫虫样采集，幼虫从秀珍菇培养料或子实体中采集，成虫从秀珍菇菌袋或子实体上采集，每个基地随机采集活跃的幼虫、成虫虫样各5份，分别浸泡于装有1.0 mL 75%乙醇的离心管中保存。
1. 2. 2 形态学鉴定 形态学鉴定以成虫观察为主。将采集的虫样按张晓云等（2007）的方法制作成玻片标本在显微镜下观察，主要观察成虫头部的复眼、触角和唇基，胸部的足和翅脉，腹部的尾器等部位（沈登荣等，2009），参考蔡邦华（2015）昆虫分类学双翅目的分类描述，将虫样鉴定到科。
1. 2. 3 分子生物学鉴定 取采集的单只幼虫或成虫于1.5 mL离心管中，加入适量液氮研磨呈粉状后，提取基因组DNA。PCR扩增线粒体COI基因片段，正向引物为CI-J-1751（5'-GGAGCTCCTGACATAGC
ATTCCC-3'），反向引物为CI-N-2191（5'-CCCGGTA
AAATTAAAATATAAACTTC-3'），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系25.0 μL：I5 Mix 12.5 μL，正、反向引物（10 pmol/μL）各1.0 μL，基因组DNA模板1.0 μL，超纯水9.5 μL。扩增程序：98 ℃预变性2 min;98 ℃ 10 s，47 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环;72 ℃延伸5 min。扩增产物由擎科生物工程（南京）股份有限公司进行测序，测序结果通过在NCBI上BLAST比对结果初步确认虫样分类学地位。
1. 3 双翅目害虫的全年消長规律监测
在秀珍菇出菇棚中悬挂黄色黏虫板（25 cm×40 cm），距离出菇袋上方0.5 m左右，纵向间隔5.0 m，横向每排悬挂2张，每10 d记录1次黄板上的虫口数，每月3次，每次记录结束后全部更换新的黄板。大棚类型选择江浙地区常用的覆盖防虫网的塑料薄膜拱形大棚和未覆盖防虫网的彩钢瓦棚顶通风大棚，记录大棚内全年36次所有黄板上成虫数，计算每次黄板上的平均成虫数量，以此为依据对双翅目害虫消长规律进行监测。
1. 4 生物农药对双翅目害虫的防治效果试验
采用喷雾法（马林等，2017）测定1%印楝素水分散粒剂1000倍稀释液和1200 ITU/mg Bti可湿性粉剂500倍稀释液在秀珍菇出菇期对双翅目害虫的防治效果。秀珍菇栽培按照秀珍菇生产技术规程（DB 33/T 526—2012）进行出菇管理，大棚类型为覆盖防虫网的塑料薄膜拱形大棚，每棚内排放12000袋秀珍菇出菇袋，1号棚使用Bti药剂，2号棚使用印楝素，3号棚为对照棚。第1次用药为秀珍菇开袋后浇水前用药，第2次用药为第1潮菇采收结束后，结合下架倒扣补水进行给药，将药剂加入补水液中，连续补水2 d，使倒扣菌袋充分吸水的同时吸入药液。通过出菇房内悬挂黄板上的双翅目害虫成虫数反映防治效果。出菇房内黄板悬挂方法同1.3，每次用药后10 d全部更换新黄板，15 d时记录黄板上的平均成虫数量。
1. 5 统计分析
运用SPSS 20.0计算黄板上成虫的平均数和标准差。利用One-way-ANOVA方差分析法（Ross and Willson，2017）对不同处理间的成虫数量进行统计分析，利用Duncan’s新复极差法（Thonghua and Thonghua，2015）进行多重比较。
2 结果与分析
2. 1 江浙地区秀珍菇双翅目虫样鉴定结果
在江浙地区7个秀珍菇栽培基地采集虫样70份，通过形态学和分子生物学鉴定，结果如表1所示。70份样本分别属于4科[眼蕈蚊科（Sciaridae）、蚤蝇科（Phoridae）、果蝇科（Drosophilidae）和瘿蚊科（Cecidomyiidae）]5属[迟眼蕈蚊属（Bradysia）、厉眼蕈蚊属（Lycoriella）、异蚤蝇属（Megaselia）、果蝇属（Drosophila）和瘿蚊科未知属]。采样地点不同，害虫种类存在差异，其中，迟眼蕈蚊属的异迟眼蕈蚊分布最广、样本数最多，是江浙地区秀珍菇栽培中的优势种群;厉眼蕈蚊属仅在江苏出现，在浙江未采集到样本;其余3种仅在浙江出现，江苏未采集到样本，其中异蚤蝇属只在浙江江山出现，而果蝇属和瘿蚊科Cecidomyiidae sp.仅在浙江淳安采集到。通过测序和比对发现COI基因片段与NCBI上已公布的昆虫同源性均在98%以上。
2. 2 江浙地区秀珍菇双翅目害虫的全年消长规律
江浙地区秀珍菇出菇棚中双翅目害虫全年的动态消长规律如图1所示，害虫数量与大棚内秀珍菇栽培阶段和气温有明显的相关性。从栽培阶段来看，随着5月初菌袋开始开袋，大棚内双翅目害虫成虫数量开始增加，10月底—11月初出菇结束，11月底出菇棚内所有菌袋全部清空，虫口数量又回落至最低点，12月—翌年4月为空棚期和发菌期，出菇棚内虫口数量一直处于最低点。从气温来看，5月初气温开始稳定且逐步上升至20 ℃以上，8月为夏季气温最高期，大棚内温度可达40 ℃以上，9月气温开始回落，至11月温度降至20 ℃左右，此阶段成虫消长规律与双翅目害虫最适生存温度范围一致，有2个明显的发生高峰，即5—7月和9—10月，在11月底—翌年4月底基本无虫害发生。从有无覆盖防虫网的2个大棚虫量曲线可看出，防虫网可起到明显的减少虫口基数的作用。
2. 3 生物农药对双翅目害虫的防治效果
从2次用药15 d后黄板上诱集到的双翅目害虫成虫数量（表2）可看出，分别喷施Bti和印楝素后秀珍菇大棚内黄板上的成虫数量均比对照明显减少，防效显著（P<0.05，下同）。第1次用药15 d后，Bti处理大棚内黄板上的虫数多于印楝素处理大棚，说明Bti防效低于印楝素，且差异达显著水平;而第2次用药15 d后从黄板上的虫数可看出虽然Bti的防效仍低于印楝素，但差异不显著（P>0.05），可能与Bti作用效果较慢有关。 3 討论
目前，我国已报道的为害食用菌的双翅目害虫主要涉及长角亚目、短角亚目和芒角亚目的20科49属，其中眼蕈蚊科有6属27种（李建波和何璞，2017）。罗佳和庄秋林（2007）对福建省食用菌上发生的双翅目害虫种类进行调查发现有10科27种;沈登荣等（2009）发现云南省食用菌栽培地眼蕈蚊科害虫有6属11种，其中平菇厉眼蕈蚊和异迟眼蕈蚊为云南省食用菌上眼蕈蚊的主要优势种类。本研究仅针对江浙地区7个秀珍菇栽培基地的双翅目害虫进行采样和分类鉴定，虫样种类相对简单，只有4科5属，但优势种群与其他地区一致，均为迟眼蕈蚊属的异迟眼蕈蚊。
食用菌昆虫群落动态变化在春秋两季随着季节温度的变化呈一定规律性，但受食用菌品种、栽培环境、栽培方式和人为因素的影响而有所变化（李光强，2009）。福建省秀珍菇上菇蚊菇蝇一年出现两个高峰期，分别是3—7月和9—12月（温志强和边广，2011）;山东省平菇出菇期害虫种群动态出现春秋两个高峰，分别在4—5月和9月（王丹丹，2012）;广西南宁市平菇上菇蚊菇蝇的为害高峰期在3—4月（王瑾，2013）;辽宁沈阳地区平菇的主要害虫平菇厉眼蕈蚊和泰纳异蚤蝇的暴发期分别在3—6月和9—10月（张超逸，2017）。福建、山东、广西和辽宁分别代表了我国东南、中部、西南和东北地区菇蚊菇蝇的发生规律，而本研究的检测地点恰好代表了中东部沿海地区秀珍菇双翅目害虫的发生规律，与福建相似，一年出现两个高峰（5—7月和9—10月）。
在食用菌双翅目害虫的生物防治方面，苏云金芽孢杆菌以色列变种是专门针对双翅目蚊蝇害虫的一种生物杀虫剂（师迎春等，2014），通过产生的伴孢晶体对害虫幼虫有特异的杀虫活性，对成虫无效（马林等，2015）。印楝素是目前世界上最优秀的植物源农药，具有拒食、抑制生长发育、诱导细胞凋亡和自噬的作用，对昆虫幼虫和成虫均有效果（徐汉虹等，2017）。宋爽等（2015）研究表明，印楝素在平菇上防治双翅目害虫的效果优于Bti，且对平菇子实体生长无影响。本研究结果与宋爽等（2015）的研究结论相似。本研究中用药方式与当地特殊的补水方式结合，菌袋倒扣在地面吸水，使药液与出菇袋口结合更紧，药液吸收更彻底，解决了墙式栽培时喷雾的药液多数流出菌袋，降低药效的问题。由于供试两种生物农药作用机理完全不同，在实际生产中可轮换使用，以减缓害虫抗药性的产生。
4 结论
江浙地区秀珍菇栽培中受到4科（眼蕈蚊科、蚤蝇科、果蝇科和瘿蚊科）5属（迟眼蕈蚊属、厉眼蕈蚊属、异蚤蝇属、果蝇属和瘿蚊科未知属）双翅目害虫的危害，其中迟眼蕈蚊属的异迟眼蕈蚊为优势种群。江浙地区秀珍菇出菇棚中双翅目害虫全年有两个发生高峰，分别为5—7月和9—10月，在11月底—翌年4月底基本无虫害发生。Bti和印楝素两种生物药剂对秀珍菇上的双翅目害虫均有明显的杀虫效果，且对秀珍菇生长无影响，两种生物药剂均可作为防治秀珍菇双翅目害虫的药剂在生产上推广使用。
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