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摘要[目的] 建立适用于科研用小牛肠碱性磷酸酶活性的检测方法。[方法] 通过模拟科研中小牛肠碱性磷酸酶的使用条件及缓冲液，并研究不同底物浓度、反应时间、显色时间、缓冲液pH等对酶活性检测的影响。[结果] 使用不同缓冲液对酶活性进行检测，其测量值差异较大。若使用添加硼酸的铁氰化钾溶液，则可以实现颜色的稳定显示。最佳水浴时间为10 min，最佳底物浓度为0.04 mol/L。随着温度的增加，对低浓度酶活性的影响不大，但对高浓度酶活性的影响逐渐增大。当缓冲液pH为7.0～8.0时，能够较好维持酶活性的稳定性。缓冲液粒子强度对酶活性的影响不大。[结论]成功建立了科研用小牛肠碱性磷酸酶的活性检测方法。
关键词碱性磷酸酶；小牛肠；活性检测；紫外分光光度法；科研
中图分类号S852.2文献标识码A文章编号0517-6611（2014）18-05870-04
碱性磷酸酶在科研上的应用目前主要集中在用于DNA片段的去磷酸化，即从核酸中去除5’磷酸以减少质粒载体在连接反应中的环化，使DNA易受或抵抗某些作用于核酸的酶。碱性磷酸酶根据其来源不同分为小牛肠碱性磷酸酶、虾源碱性磷酸酶和细菌源碱性磷酸酶等[1]。其中，小牛肠碱性磷酸酶为目前科研中最常用的且最容易购买到的，其活性部位由Asp101Ser102Ala103、3个在空间上相靠近的金属离子及配体、Arg166及其他一些相邻氨基酸残基组成[1-2]。最佳反应pH取决于反应底物以及反应底物浓度和所选择的缓冲液类型，然而碱性磷酸酶对于各种已知的缓冲液及底物，其最适酶活pH不低于8.0[3]。
碱性磷酸酶测定常用的缓冲体系分为激活型、抑制型和惰性型3类，其测定结果差异很大，其主要原因是其缓冲体系不仅具有缓冲作用，还可作为磷酸酰基的受体，提高酶促反应的速度，从而导致了测定结果的差异[4]。磷性磷酸酶检验方法有化学抑制法、电泳法、免疫法、分光光度法等，前2种方法的灵敏度和特异性较低，免疫法虽有较高的灵敏性和特异性但操作复杂耗时，而基于碱性磷酸酶活力的分光光度法更加方便和快捷[5]。科研用小牛肠碱性磷酸酶目前国内外均无专门的检验标准。国内关于碱性磷酸酶活性检测的现有标准有NY/T 8012004《生鲜牛乳及其制品中碱性磷酸酶活度的测定方法》[6]、WS/T 3512011《碱性磷酸酶（ALP）催化活性浓度测定参考方法》[7]，这2个标准中采用的底物、缓冲液和酶活单位定义均大不相同。
由于NY/T 8012004中检测对象为牛乳因此需要大量使用挥发性有机试剂正丁醇，对通常以毫克级别提供的科研用小牛肠碱性磷酸酶极不合适；WS/T 351-2011检测对象为血清，因此对试验环境条件控制严格，对分光光度计要求配制恒温模块，恒温模块价格昂贵，普通实验室难以达到[6-7]。由于科研中常用Tris·HCl缓冲液，与标准中所用不同会造成检测结果的偏差，因此有必要建立与科研中使用条件一致的检测方法。笔者比较科研中小牛肠碱性磷酸酶反应条件以及现有酶活性检测方法与条件，建立了一套适用于科研用小牛肠碱性磷酸酶活性的检测方法，以有助于统一科研中使用的小牛肠碱性磷酸酶活单位，从而保证试验结果的准确性和可靠性。
1材料与方法
1.1材料与试剂碳酸钠，购自西陇化工股份有限公司；碳酸氢钠，购自天津市红岩化学试剂厂；Tris base，购自深圳新拓扑生物科技有限公司；磷酸苯二钠盐水合物（98%），购自阿法埃莎化学有限公司；铁氰化钾，购自天津市红岩化学试剂厂；硼酸，购自国药集团化学有限公司；氢氧化钠，购自天津市红岩化学试剂厂；4-氨基安替比林，购自天津市科密欧化学试剂有限公司；无水苯酚，购自国药集团化学有限公司；氯化镁，购自西陇化工股份有限公司；氯化锌，购自西陇化工股份有限公司；氯化钾，购自西陇化工股份有限公司；甘油（纯度99.9%），购自Sigma公司。
1.2仪器与设备紫外可见分光光度计（DU730型），为美国贝克曼库尔特公司产品。（试验使用1 cm光径、4 ml容量的石英比色皿。）
1.3试验方法
1.3.1酶活性的检测方法。①在空白管：加入1.0 ml 0.04 mol/L磷酸苯二钠，37 ℃预热5 min；加入1.0 ml 0.01 mol/L Tris·HCl缓冲液（pH 8.0），混匀后37 ℃中水浴10 min；加入1.0 ml 0.5 mol/L NaOH溶液、1.0 ml 4-氨基安替比林、2.0 ml铁氰化钾溶液，立即混匀。②在反应管中加入1.0 ml 004 mol/L磷酸苯二钠，37 ℃预热5 min；加入1.0 ml酶液，混匀后37 ℃水浴10 min；加入1.0 ml 0.5 mol/L NaOH溶液、10 ml 4-氨基安替比林、2.0 ml铁氰化钾溶液，立即混匀。使用紫外可见分光光度计于波长510 nm处，以零号管为空白，读取各管吸光度，绘制校正曲线。
酶活单位定义（Defined enzyme unit，DEU）：在37 ℃0.01 mol/L Tris·HCl缓冲液（pH8.0）中，1 min水解磷酸苯二钠产生1 μg苯酚。比活力单位为DEU/mg或DEU/ml。
铁氰化钾溶液的配制：称取铁氰化钾2.5 g和硼酸17 g，各自溶于去离子水400 ml中，混合后加入去离子水至1 000 ml，置于棕色瓶中避光保存（如出现蓝绿色立即弃去）。4-氨基安替比林溶液的配制：称取4-氨基安替比林1.5 g，加去离子水溶解至500 ml置于棕色瓶中保存。
1.3.2酶液稀释。酶活性检测影响试验所用酶为NEB M0290S 小牛肠碱性磷酸酶（明示酶活为10 000 U/ml），吸取10 μl酶液置于990 μl碱性磷酸酶贮备液（10 mmol/L Tris·HCl（pH 8.0），50 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl，0.1 mmol/L ZnCl2，50%甘油）中，制成NEB的酶母液（100 U/ml），置于-20 ℃冰箱备用。使用0.1 mol/L碳酸盐缓冲液（pH 102）、Tris·HCl 缓冲液（pH 8.0）分别对母液中的酶进行稀释，直至明示酶活分别如表1所示。 3讨论
国内对碱性磷酸酶检测的标准分别是针对牛奶和血清中碱性磷酸酶的活性检测，由于检测对象的不同所采用的缓冲液、底物、pH、温度等也都大不相同[6-7]。其中，WS/T 351-2011标准中检测底物采用对硝基苯酚磷酸盐，由于检测对象为血清，血清中存在大量颜色干扰物质，因此其设置的加入量为100 μl，检测温度为接近体温的37 ℃，并且检测时使用受体激活剂2-氨基-2-甲基1-丙醇，因此其检测值应比实际使用时偏高。据报道，若处于高于25 ℃的环境中就会产生自分解反应，因此这也将影响检测结果的准确性[5]。选用磷酸苯二钠作为酶活性检测底物，主要原理为磷酸苯二钠在碱性磷酸酶作用下被分解、释放出苯酚，苯酚在碱性环境中经过铁氰化钾氧化作用，并与4-氨基安替比林显色剂结合产生红色的醌类化合物，于510 nm特异波长检测，在与标准曲线对比换算可计算出酶活力。由于科研中多使用001 mol/LTris·HCl（pH8.0）缓冲液对核酸进行保护，而对质粒进行去磷酸化反应时常使用温度为37 ℃，因此采用该缓冲液及温度进行酶活性检测能够更真实反映酶活性。同时，NY/T 801-2004使用2，6二氯醌氯亚胺以及硫酸铜对苯酚进行显色检测，由于2，6二氯醌氯亚胺容易降解产生游离物质，因此需使用当日配制，这在日常检验工作中增加了工作量也造成了一定程度的浪费[8]。
该试验中通过设置2种缓冲液，发现若使用不同的缓冲液对酶活性进行检测其测量值差异较大，因此应选用与实际使用条件一致的缓冲液；而通过设置不同的静止时间若使用加了硼酸的铁氰化钾溶液则可以实现颜色的稳定显示，以减少误差；针对目前采用磷酸苯二钠底物浓度不一致的情况[9-10]；通过设置不同的底物浓度，选择较稳定的最低浓度（0.04 mol/L）；通过设置不同反应时间，将反应时间缩短至10 min。 笔者建立了科研用小牛肠碱性磷酸酶的活性检测方法，说明采用该方法其检测结果更加贴近实际使用活性。
参考文献
[1] 陈凤娟.碱性磷酸酶结构与活性的研究及DNA化学酶、MoFeco的模拟合成[D].兰州：兰州大学，2009.
[2] 王秋颖.碱性磷酸酶特性及其应用的研究进展[J].中国畜牧兽医，2011，38（1）：157-161.
[3] ROSS M H，ELY J O，ARCHER J G.Alkaline phosphatase activity and pH optima[J].Journal of Biological Chemistry，1951，192（2）：561-568.
[4] 郑铁生，叶立新，薛锦，等.不同激活型缓冲体系对碱性磷酸酶活性测定的影响[J].临床检验杂志，2005，23（6）：423-424.
[5] 冯春梁，李红丹，张振彦，等.催化动力学光度法测定碱性磷酸酶的理论分析与条件优化[J].辽宁师范大学学报：自然科学版，2009，32（2）：195-198.
[6] 中华人民共和国农业部.NY/T 801-2004 生鲜牛乳及其制品中碱性磷酸酶活度的测定方法[S].北京：中国标准出版社，2004.
[7] 中华人民共和国卫生部.WS/T 351-2011 碱性磷酸酶（ALP）催化活性浓度测定参考方法[S].北京：中国标准出版社，2011.
[8] 洪红.乳品中碱性磷酸酶活度的比色测定[J].中国乳品工业，2004，32（40）：34-36.
[9] 张洪渊，刘克武，石安静，等.背角无齿蚌碱性磷酸酶分离、纯化及其动力学研究[J].水生生物学报，1996，20（1）：57-61.
[10] 徐文华.盐浓度对人血清碱性磷酸酶活性的影响[J].青岛大学医学院学报，2002，38（3）：265-266.
关键词碱性磷酸酶；小牛肠；活性检测；紫外分光光度法；科研
中图分类号S852.2文献标识码A文章编号0517-6611（2014）18-05870-04
碱性磷酸酶在科研上的应用目前主要集中在用于DNA片段的去磷酸化，即从核酸中去除5’磷酸以减少质粒载体在连接反应中的环化，使DNA易受或抵抗某些作用于核酸的酶。碱性磷酸酶根据其来源不同分为小牛肠碱性磷酸酶、虾源碱性磷酸酶和细菌源碱性磷酸酶等[1]。其中，小牛肠碱性磷酸酶为目前科研中最常用的且最容易购买到的，其活性部位由Asp101Ser102Ala103、3个在空间上相靠近的金属离子及配体、Arg166及其他一些相邻氨基酸残基组成[1-2]。最佳反应pH取决于反应底物以及反应底物浓度和所选择的缓冲液类型，然而碱性磷酸酶对于各种已知的缓冲液及底物，其最适酶活pH不低于8.0[3]。
碱性磷酸酶测定常用的缓冲体系分为激活型、抑制型和惰性型3类，其测定结果差异很大，其主要原因是其缓冲体系不仅具有缓冲作用，还可作为磷酸酰基的受体，提高酶促反应的速度，从而导致了测定结果的差异[4]。磷性磷酸酶检验方法有化学抑制法、电泳法、免疫法、分光光度法等，前2种方法的灵敏度和特异性较低，免疫法虽有较高的灵敏性和特异性但操作复杂耗时，而基于碱性磷酸酶活力的分光光度法更加方便和快捷[5]。科研用小牛肠碱性磷酸酶目前国内外均无专门的检验标准。国内关于碱性磷酸酶活性检测的现有标准有NY/T 8012004《生鲜牛乳及其制品中碱性磷酸酶活度的测定方法》[6]、WS/T 3512011《碱性磷酸酶（ALP）催化活性浓度测定参考方法》[7]，这2个标准中采用的底物、缓冲液和酶活单位定义均大不相同。
由于NY/T 8012004中检测对象为牛乳因此需要大量使用挥发性有机试剂正丁醇，对通常以毫克级别提供的科研用小牛肠碱性磷酸酶极不合适；WS/T 351-2011检测对象为血清，因此对试验环境条件控制严格，对分光光度计要求配制恒温模块，恒温模块价格昂贵，普通实验室难以达到[6-7]。由于科研中常用Tris·HCl缓冲液，与标准中所用不同会造成检测结果的偏差，因此有必要建立与科研中使用条件一致的检测方法。笔者比较科研中小牛肠碱性磷酸酶反应条件以及现有酶活性检测方法与条件，建立了一套适用于科研用小牛肠碱性磷酸酶活性的检测方法，以有助于统一科研中使用的小牛肠碱性磷酸酶活单位，从而保证试验结果的准确性和可靠性。
1材料与方法
1.1材料与试剂碳酸钠，购自西陇化工股份有限公司；碳酸氢钠，购自天津市红岩化学试剂厂；Tris base，购自深圳新拓扑生物科技有限公司；磷酸苯二钠盐水合物（98%），购自阿法埃莎化学有限公司；铁氰化钾，购自天津市红岩化学试剂厂；硼酸，购自国药集团化学有限公司；氢氧化钠，购自天津市红岩化学试剂厂；4-氨基安替比林，购自天津市科密欧化学试剂有限公司；无水苯酚，购自国药集团化学有限公司；氯化镁，购自西陇化工股份有限公司；氯化锌，购自西陇化工股份有限公司；氯化钾，购自西陇化工股份有限公司；甘油（纯度99.9%），购自Sigma公司。
1.2仪器与设备紫外可见分光光度计（DU730型），为美国贝克曼库尔特公司产品。（试验使用1 cm光径、4 ml容量的石英比色皿。）
1.3试验方法
1.3.1酶活性的检测方法。①在空白管：加入1.0 ml 0.04 mol/L磷酸苯二钠，37 ℃预热5 min；加入1.0 ml 0.01 mol/L Tris·HCl缓冲液（pH 8.0），混匀后37 ℃中水浴10 min；加入1.0 ml 0.5 mol/L NaOH溶液、1.0 ml 4-氨基安替比林、2.0 ml铁氰化钾溶液，立即混匀。②在反应管中加入1.0 ml 004 mol/L磷酸苯二钠，37 ℃预热5 min；加入1.0 ml酶液，混匀后37 ℃水浴10 min；加入1.0 ml 0.5 mol/L NaOH溶液、10 ml 4-氨基安替比林、2.0 ml铁氰化钾溶液，立即混匀。使用紫外可见分光光度计于波长510 nm处，以零号管为空白，读取各管吸光度，绘制校正曲线。
酶活单位定义（Defined enzyme unit，DEU）：在37 ℃0.01 mol/L Tris·HCl缓冲液（pH8.0）中，1 min水解磷酸苯二钠产生1 μg苯酚。比活力单位为DEU/mg或DEU/ml。
铁氰化钾溶液的配制：称取铁氰化钾2.5 g和硼酸17 g，各自溶于去离子水400 ml中，混合后加入去离子水至1 000 ml，置于棕色瓶中避光保存（如出现蓝绿色立即弃去）。4-氨基安替比林溶液的配制：称取4-氨基安替比林1.5 g，加去离子水溶解至500 ml置于棕色瓶中保存。
1.3.2酶液稀释。酶活性检测影响试验所用酶为NEB M0290S 小牛肠碱性磷酸酶（明示酶活为10 000 U/ml），吸取10 μl酶液置于990 μl碱性磷酸酶贮备液（10 mmol/L Tris·HCl（pH 8.0），50 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl，0.1 mmol/L ZnCl2，50%甘油）中，制成NEB的酶母液（100 U/ml），置于-20 ℃冰箱备用。使用0.1 mol/L碳酸盐缓冲液（pH 102）、Tris·HCl 缓冲液（pH 8.0）分别对母液中的酶进行稀释，直至明示酶活分别如表1所示。 3讨论
国内对碱性磷酸酶检测的标准分别是针对牛奶和血清中碱性磷酸酶的活性检测，由于检测对象的不同所采用的缓冲液、底物、pH、温度等也都大不相同[6-7]。其中，WS/T 351-2011标准中检测底物采用对硝基苯酚磷酸盐，由于检测对象为血清，血清中存在大量颜色干扰物质，因此其设置的加入量为100 μl，检测温度为接近体温的37 ℃，并且检测时使用受体激活剂2-氨基-2-甲基1-丙醇，因此其检测值应比实际使用时偏高。据报道，若处于高于25 ℃的环境中就会产生自分解反应，因此这也将影响检测结果的准确性[5]。选用磷酸苯二钠作为酶活性检测底物，主要原理为磷酸苯二钠在碱性磷酸酶作用下被分解、释放出苯酚，苯酚在碱性环境中经过铁氰化钾氧化作用，并与4-氨基安替比林显色剂结合产生红色的醌类化合物，于510 nm特异波长检测，在与标准曲线对比换算可计算出酶活力。由于科研中多使用001 mol/LTris·HCl（pH8.0）缓冲液对核酸进行保护，而对质粒进行去磷酸化反应时常使用温度为37 ℃，因此采用该缓冲液及温度进行酶活性检测能够更真实反映酶活性。同时，NY/T 801-2004使用2，6二氯醌氯亚胺以及硫酸铜对苯酚进行显色检测，由于2，6二氯醌氯亚胺容易降解产生游离物质，因此需使用当日配制，这在日常检验工作中增加了工作量也造成了一定程度的浪费[8]。
该试验中通过设置2种缓冲液，发现若使用不同的缓冲液对酶活性进行检测其测量值差异较大，因此应选用与实际使用条件一致的缓冲液；而通过设置不同的静止时间若使用加了硼酸的铁氰化钾溶液则可以实现颜色的稳定显示，以减少误差；针对目前采用磷酸苯二钠底物浓度不一致的情况[9-10]；通过设置不同的底物浓度，选择较稳定的最低浓度（0.04 mol/L）；通过设置不同反应时间，将反应时间缩短至10 min。 笔者建立了科研用小牛肠碱性磷酸酶的活性检测方法，说明采用该方法其检测结果更加贴近实际使用活性。
参考文献
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[6] 中华人民共和国农业部.NY/T 801-2004 生鲜牛乳及其制品中碱性磷酸酶活度的测定方法[S].北京：中国标准出版社，2004.
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[8] 洪红.乳品中碱性磷酸酶活度的比色测定[J].中国乳品工业，2004，32（40）：34-36.
[9] 张洪渊，刘克武，石安静，等.背角无齿蚌碱性磷酸酶分离、纯化及其动力学研究[J].水生生物学报，1996，20（1）：57-61.
[10] 徐文华.盐浓度对人血清碱性磷酸酶活性的影响[J].青岛大学医学院学报，2002，38（3）：265-266.