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【中图分类号】R556.61 【文献标识码】B【文章编号】1005-0019(2009)6-0066-02
血红蛋白病主要分为α地中海贫血(简称α-地贫)和β-地中海贫血(简称β-地贫),是由于血红蛋白链合成部分受抑或完全抑制而引起的一组遗传性溶血性贫血。地中海贫血最早发现于地中海沿岸居民而得名,现在广泛分布于世界许多地区,东南亚是高发区之一,中国以广东、广西、四川多见。此病为自体隐形遗传疾病,因此在筛查携带者、遗传咨询、产前诊断和选择性流产综合预防措施中起着重要的作用。目前实验室主要有筛查法和基因检测法两大类[1]。
1 地中海贫血的筛选方法
主要是血液学检查和血红蛋白的分析,如红细胞形态、红细胞指数、红细胞渗透脆性、血红蛋白理化性质测定、血红蛋白电泳几个方面来筛查[2]。
1.1 红细胞形态观察:制备新鲜血涂片、瑞氏染色,镜检红细胞的大小,异性等形态改变。地中海贫血患者红细胞均以小细胞低色素性改变为主,并且红细胞大小不均,可出现异型,嗜碱性点彩红细胞、靶形红细胞、网织红细胞比率增高,贫血越重,异形性越明显。
1.2 全血细胞计数仪的使用:随着科学技术的发展,高、精、尖科技应用到医学领域,血细胞计数也由传统的手工计数到现代仪器计数,测定项目从几项到二十几项不等。但其中红系统的6个基本参数:红细胞(RBC),血红蛋白(Hb),红细胞压积(HCT),红细胞平均体积(MCV),红细胞平均血红蛋白量(MCH)和红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)对地中海贫血的诊断有重要意义。而以MCV和MCH为首选筛查指标,国内使用的MCV和MCH截断值差异很大,而国际上使用较广泛的是MCV<79fl和MCH<27pg[3]。一般认为,不管Hb是否低于正常参考值,当MCV<79fl和MCH<27pg作为地中海贫血的可疑指标,此时要进一步检查。
1.3 红细胞渗透脆性试验:其原理是地中海贫血红细胞膜表面粗糙、凹陷、折叠和浆膜扩展,膜与内容物之比增大,对渗透溶解的抗性增加,在0. 32% (或0. 36% )NaCl中溶解度降低(脆性降低),一管法可用于地中海贫血群体筛查。多管法是把NaCl稀释成一系列浓度梯度而进行红细胞脆性试验,主要是检测红细胞对不同浓度低渗盐溶液的抵抗力。在低渗溶液中,当水渗透其内部达一定程度时,红细胞发生膨胀破裂,地中海贫血患者的渗透脆性降低[4]。
1.4 HbF定量测定、红细胞包涵体试验和异丙醇沉淀试验:HbF抗碱变性强,利用这点可以检测HbF;红细胞包涵体试验是将煌焦油蓝与新鲜血液一起孵育,不稳定蛋白异变性沉淀形成包涵体,常见疾病有HbH病,所以也叫HbH包涵体。异丙醇试验是检测不稳定血红蛋白,不稳定血红蛋白较正常血红蛋白更容易裂解,当血液中含有较多HbF、HbH、HbE时可出现阳性结果。
1.5 血红蛋白电泳:Hb电泳是确诊地贫的一种既可靠又快速的方法,目前常用醋纤薄膜电泳和全自动Hb琼脂糖电泳。醋纤薄膜电泳能进行定量测定异常Hb(包括HbH和HbE);全自动Hb琼脂糖电泳是在碱性条件下,经电场作用分离不同Hb分子,再经固定、染色、脱色、烘干、扫描定量等,能定量检测Hb各种成分。但血红蛋白电泳对轻型α-地贫有一定的局限性。
1.6 辅以血清铁和血清铁蛋白测定,排除缺铁性贫血的可能;还应该配合X线检查婴幼儿掌骨、指骨骨髓腔改变、骨板改变等的观察及临床表现。
1.7 高效液相色谱技术(HPLC)。原理:采用微柱法离子交换层析和梯度洗脱技术,全自动分析仪可分离血红蛋白的变异体与亚型,容易发现重型和轻型β地中海贫血。在操作上,HPLC采用的是全血标本,不需要制备Hb液,只要将全血标本直接放在仪器上,通过电脑操作便能实现HbA、HbA2、HbF等定量检测。优点:所需样本量少,自动化程度高,操作简单,快速,能消除人为误差,结果准确。HPLC也可用于胎儿脐带血的产前诊断,可诊断出重型β地中海贫血,但不能区分正常胎儿和杂合子胎儿[5]。
2 基因诊断
近年来,随着分子生物学研究领域的不断发展,从最初的限制性酶切多态性检测至目前的聚合酶链反应(PCR)技术。中国的地中海贫血的基因诊断是随着PCR技术的发展而发展的。
2.1 限制性片段长度多态性连锁分析(RFLP连锁分析)。原理:DNA限制性内切酶可识别并切割DNA上特定的核苷酸序列,得到一定长度的DNA片段,而碱基的突变可导致酶切位
点的丢失或形成,从而改变酶切片段的大小。突变基因在经过相应的限制性内切酶水解后,其电泳条带的数量和大小就会发生改变,根据这些改变可判断出突变是否存在。
2.2 等位基因特异性寡核苷酸(ASO)技术:是用寡核苷酸探针和PCR产物进行杂交以检测点突变的方法[6]。被检测基因片段经PCR扩增并经电泳分离后转移到膜上,分别与经标记的含有正常序列和突变序列的寡核苷酸探针杂交,通过严格控制杂交条件。可使PCR产物仅与完全互补的探针进行杂交,根据有无杂交信号可判断被检扩增片段中是否带有突变点,此技术的缺点是必须严格控制杂交条件,否则会出现假阳性或假阴性,另一缺点是成本高[7]。在此基础上发展起来的反向杂交(RDB)技术,改变了传统的杂交技术一次只能检测一种突变的不足,并能区分纯合子、杂合子、突变子,快速、敏感,适于β-地中海贫血的诊断。
2.3 缺口PCR技术和反向斑点杂交技术分析:采用缺口PCR(即Gap-PCR)技术检测缺失型α-地中海贫血;用反向斑点杂交技术检测非缺失型α-地中海贫血和17种β-地贫基因。
2.4 荧光-PCR:比普通的PCR敏感性高出1000倍以上,在胚胎植入前遗传学诊断(PCD)借助辅助生产技术中,荧光PCR(F-PCR)比传统的巢式PCR有更高的敏感性,降低等位基因脱扣(ADO)率,且反应周期短[8]。
2.5 液态悬浮点阵技术和基因芯片:液态悬浮点阵技术建立在PCR技术和悬浮点阵检测技术基础上,被称为“液态生物芯片”。 而基因芯片根据基因芯片上不同位置所出现的荧光位点颜色及强弱的变化来判断地中海贫血的基因突变类型。
总之 随着各种技术的发展,各种检测手段层出不穷。但只有把筛查方法和基因检测方法联合起来,才能提高地中海贫血诊断的准确性,减少误诊和漏诊;才能为筛查携带者、遗传咨询、产前诊断和选择性流产综合预防措施提供可靠的依据。
血红蛋白病主要分为α地中海贫血(简称α-地贫)和β-地中海贫血(简称β-地贫),是由于血红蛋白链合成部分受抑或完全抑制而引起的一组遗传性溶血性贫血。地中海贫血最早发现于地中海沿岸居民而得名,现在广泛分布于世界许多地区,东南亚是高发区之一,中国以广东、广西、四川多见。此病为自体隐形遗传疾病,因此在筛查携带者、遗传咨询、产前诊断和选择性流产综合预防措施中起着重要的作用。目前实验室主要有筛查法和基因检测法两大类[1]。
1 地中海贫血的筛选方法
主要是血液学检查和血红蛋白的分析,如红细胞形态、红细胞指数、红细胞渗透脆性、血红蛋白理化性质测定、血红蛋白电泳几个方面来筛查[2]。
1.1 红细胞形态观察:制备新鲜血涂片、瑞氏染色,镜检红细胞的大小,异性等形态改变。地中海贫血患者红细胞均以小细胞低色素性改变为主,并且红细胞大小不均,可出现异型,嗜碱性点彩红细胞、靶形红细胞、网织红细胞比率增高,贫血越重,异形性越明显。
1.2 全血细胞计数仪的使用:随着科学技术的发展,高、精、尖科技应用到医学领域,血细胞计数也由传统的手工计数到现代仪器计数,测定项目从几项到二十几项不等。但其中红系统的6个基本参数:红细胞(RBC),血红蛋白(Hb),红细胞压积(HCT),红细胞平均体积(MCV),红细胞平均血红蛋白量(MCH)和红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)对地中海贫血的诊断有重要意义。而以MCV和MCH为首选筛查指标,国内使用的MCV和MCH截断值差异很大,而国际上使用较广泛的是MCV<79fl和MCH<27pg[3]。一般认为,不管Hb是否低于正常参考值,当MCV<79fl和MCH<27pg作为地中海贫血的可疑指标,此时要进一步检查。
1.3 红细胞渗透脆性试验:其原理是地中海贫血红细胞膜表面粗糙、凹陷、折叠和浆膜扩展,膜与内容物之比增大,对渗透溶解的抗性增加,在0. 32% (或0. 36% )NaCl中溶解度降低(脆性降低),一管法可用于地中海贫血群体筛查。多管法是把NaCl稀释成一系列浓度梯度而进行红细胞脆性试验,主要是检测红细胞对不同浓度低渗盐溶液的抵抗力。在低渗溶液中,当水渗透其内部达一定程度时,红细胞发生膨胀破裂,地中海贫血患者的渗透脆性降低[4]。
1.4 HbF定量测定、红细胞包涵体试验和异丙醇沉淀试验:HbF抗碱变性强,利用这点可以检测HbF;红细胞包涵体试验是将煌焦油蓝与新鲜血液一起孵育,不稳定蛋白异变性沉淀形成包涵体,常见疾病有HbH病,所以也叫HbH包涵体。异丙醇试验是检测不稳定血红蛋白,不稳定血红蛋白较正常血红蛋白更容易裂解,当血液中含有较多HbF、HbH、HbE时可出现阳性结果。
1.5 血红蛋白电泳:Hb电泳是确诊地贫的一种既可靠又快速的方法,目前常用醋纤薄膜电泳和全自动Hb琼脂糖电泳。醋纤薄膜电泳能进行定量测定异常Hb(包括HbH和HbE);全自动Hb琼脂糖电泳是在碱性条件下,经电场作用分离不同Hb分子,再经固定、染色、脱色、烘干、扫描定量等,能定量检测Hb各种成分。但血红蛋白电泳对轻型α-地贫有一定的局限性。
1.6 辅以血清铁和血清铁蛋白测定,排除缺铁性贫血的可能;还应该配合X线检查婴幼儿掌骨、指骨骨髓腔改变、骨板改变等的观察及临床表现。
1.7 高效液相色谱技术(HPLC)。原理:采用微柱法离子交换层析和梯度洗脱技术,全自动分析仪可分离血红蛋白的变异体与亚型,容易发现重型和轻型β地中海贫血。在操作上,HPLC采用的是全血标本,不需要制备Hb液,只要将全血标本直接放在仪器上,通过电脑操作便能实现HbA、HbA2、HbF等定量检测。优点:所需样本量少,自动化程度高,操作简单,快速,能消除人为误差,结果准确。HPLC也可用于胎儿脐带血的产前诊断,可诊断出重型β地中海贫血,但不能区分正常胎儿和杂合子胎儿[5]。
2 基因诊断
近年来,随着分子生物学研究领域的不断发展,从最初的限制性酶切多态性检测至目前的聚合酶链反应(PCR)技术。中国的地中海贫血的基因诊断是随着PCR技术的发展而发展的。
2.1 限制性片段长度多态性连锁分析(RFLP连锁分析)。原理:DNA限制性内切酶可识别并切割DNA上特定的核苷酸序列,得到一定长度的DNA片段,而碱基的突变可导致酶切位
点的丢失或形成,从而改变酶切片段的大小。突变基因在经过相应的限制性内切酶水解后,其电泳条带的数量和大小就会发生改变,根据这些改变可判断出突变是否存在。
2.2 等位基因特异性寡核苷酸(ASO)技术:是用寡核苷酸探针和PCR产物进行杂交以检测点突变的方法[6]。被检测基因片段经PCR扩增并经电泳分离后转移到膜上,分别与经标记的含有正常序列和突变序列的寡核苷酸探针杂交,通过严格控制杂交条件。可使PCR产物仅与完全互补的探针进行杂交,根据有无杂交信号可判断被检扩增片段中是否带有突变点,此技术的缺点是必须严格控制杂交条件,否则会出现假阳性或假阴性,另一缺点是成本高[7]。在此基础上发展起来的反向杂交(RDB)技术,改变了传统的杂交技术一次只能检测一种突变的不足,并能区分纯合子、杂合子、突变子,快速、敏感,适于β-地中海贫血的诊断。
2.3 缺口PCR技术和反向斑点杂交技术分析:采用缺口PCR(即Gap-PCR)技术检测缺失型α-地中海贫血;用反向斑点杂交技术检测非缺失型α-地中海贫血和17种β-地贫基因。
2.4 荧光-PCR:比普通的PCR敏感性高出1000倍以上,在胚胎植入前遗传学诊断(PCD)借助辅助生产技术中,荧光PCR(F-PCR)比传统的巢式PCR有更高的敏感性,降低等位基因脱扣(ADO)率,且反应周期短[8]。
2.5 液态悬浮点阵技术和基因芯片:液态悬浮点阵技术建立在PCR技术和悬浮点阵检测技术基础上,被称为“液态生物芯片”。 而基因芯片根据基因芯片上不同位置所出现的荧光位点颜色及强弱的变化来判断地中海贫血的基因突变类型。
总之 随着各种技术的发展,各种检测手段层出不穷。但只有把筛查方法和基因检测方法联合起来,才能提高地中海贫血诊断的准确性,减少误诊和漏诊;才能为筛查携带者、遗传咨询、产前诊断和选择性流产综合预防措施提供可靠的依据。