论文部分内容阅读
摘要：从鲫鱼肠道中分离纯化获得1株革兰氏阳性菌，编号为CB-1，通过细菌形态学观察、理化特性等研究，初步鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），该菌株能利用葡萄糖产酸，β-半乳糖苷、明胶液化试验为阳性，葡萄糖酸盐、硫化氢、吲哚试验等为阴性；药敏试验结果表明，CB-1菌株对头孢噻吩、卡那霉素、阿奇霉素等抗生素敏感，对洁霉素、甲硝唑、制霉菌素等不敏感。为进一步研究枯草芽孢杆菌与鱼类健康养殖关系提供参考。
关键词：鲫鱼；肠道细菌；枯草芽孢杆菌；分离鉴定；药敏试验
中图分类号： S917.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0244-02
收稿日期：2013-10-02
基金项目：国家自然科学基金（编号：31272692、30800847），江苏省高校重点专业类建设项目（编号：2012-2015）。
作者简介：李旭（1992—），男，江苏徐州人，主要从事水产动物微生物学研究。
通信作者：吕爱军，副教授，主要从事微生物及免疫学研究，E-mail：lajand@126.com。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种短杆状、无荚膜能运动的革兰氏阳性细菌，能产中生芽孢，广泛分布于土壤、湖泊、海洋、动植物体表及其栖息地[1]。2003年，我国农业部公布了能够用于生产微生态制剂菌种包括：枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）、蜡样芽孢杆菌（B. cereus）等[2]。最近，白延琴等从秸秆垛底层土壤中分离得到1株枯草芽孢杆菌[1]。周金敏等从黄颡鱼肠道中筛选出1株益生性芽孢杆菌[3]，结果表明，枯草芽孢杆菌的抗逆性及在消化道中稳定性强于其他益生菌。马如龙等研究斜带石斑鱼幼鱼肠道的优势菌为芽孢杆菌，对石斑鱼生长和健康具有促进作用[4]。本研究以鲫鱼肠道细菌为主要研究对象，从中分离纯化获得1株芽孢杆菌，并进行了染色特性、菌体形态、生理生化特性及药敏反应等研究，以期为鲫鱼肠道细菌的鉴定、微生态制剂开发等提供依据。
1材料与方法
1.1材料
鲫鱼购自江苏省徐州市某市场，体重约100 g。普通琼脂培养基、细菌生化微量鉴定管及药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。
1.2方法
1.2.1肠道细菌的分离与鉴定参考吕爱军等方法[5]进行，将新鲜鲫鱼肠道中的菌液，均匀涂布在普通琼脂平板，30 ℃ 恒温培养24 h后，挑取典型单菌落，采用平板划线法，纯化传代2～3次，转种于4 ℃冰箱保藏、备用。细菌生理生化特性试验等按常规方法进行，分别挑取单菌落涂片进行革兰氏染色及孔雀绿芽孢染色，镜检观察分离菌株的染色及形态特征。
1.2.2药敏试验采用纸片扩散法，用无菌操作将纸片置于接种分离菌株的普通琼脂平板，置于30 ℃温箱中培养24 h后，量取抑菌圈的直径，根据药敏试验判断标准书，确定该菌对不同药物的敏感程度。
2结果与分析
2.1菌落及形态特征
从鲫鱼肠道中分离纯化获得1株细菌，暂时编号为CB-1，接种于普通琼脂平板30 ℃恒温培养24 h后，形成表面干燥、褶皱、扁平、不透明、乳白色、边缘不整齐、直径2～5 mm的中大菌落；CB-1菌株为革兰氏阳性大杆菌，产芽孢，芽孢呈椭圆、中生状（图1）。
2.2生理生化特性
细菌生理生化试验结果，分离菌CB-1菌株葡萄糖酸盐利用试验、硫化氢产生试验、吲哚产生试验及MR试验为阴性，可利用葡萄糖产酸不产气，不能还原硝酸盐、水解淀粉、分解尿素，不能产生脱羧酶利用赖氨酸、鸟氨酸脱羧生成胺和二氧化碳；β-半乳糖苷、明胶液化试验为阳性。对CB-1菌株进行形态学观察、生理生化特性分析，发现与《常见细菌系统鉴定手册》[6]描述基本一致，初步鉴定为枯草芽孢杆菌。
2.3药敏试验
采用26种抗生素对CB-1菌株进行药敏试验，测量抑菌圈直径，计算平均值。结果表明，CB-1菌株对头孢菌素类（头孢噻吩、头孢哌酮、先锋霉素Ⅳ）、氨基糖甙类（丁胺卡那霉素、庆大霉素、卡那霉素、氯霉素、乙基西梭霉素）、大环内酯类（阿奇霉素、红霉素）等抗生素敏感；对洁霉素、甲硝唑、制霉菌素等不敏感（表1）。
3讨论
国内对鲫鱼肠道中枯草芽孢杆菌的分离鉴定，尚未见相关文献报道。近年来，枯草芽孢杆菌在水产养殖上作为饲料添加剂已被广泛应用。Munro等发现鱼类肠道菌群主要来源于所摄取的活饲料而不是养殖水体[7]。邱燕等通过添加适量枯草芽孢杆菌，发现可改善草鱼肠道黏膜形态，促进草鱼对营养物质的吸收利用[8]。江永明等在饲料中添加枯草芽孢杆菌，能显著促进奥尼罗非鱼的生长[9]。赵士豪等利用大肠杆菌为抑菌对象分离到4株芽孢杆菌，研究高效复合益生菌来替代抗生素，减少抗生素对鱼类养殖的不利影响[10]。唐家毅等从水产养殖环境中筛选出1株芽孢杆菌能够有效降解水体中的氨氮、亚硝酸盐氮[11]。丁祥力等分离1株枯草芽孢杆菌，可有效改善淡水养殖水体的水质[12]。贺刚等从草鱼肠道分离出1株枯草芽胞杆菌并进行药敏试验，结果表明，该菌株对诺氟沙星、头孢哌酮、庆大霉素等抗生素高度敏感[13]。本研究从鲫鱼肠道中分离纯化出1株枯草芽孢杆菌，药敏试验结果表明，CB-1菌株对诺氟沙星、头孢哌酮、庆大霉素等敏感，本研究结果与已有报道结果基本一致[13]。关于鲫鱼肠道中枯草芽孢杆菌的16S rDNA基因分子鉴定及微生态制剂研制，还有待于进一步研究。
参考文献：
[1]白延琴，辛小玲，来有志，等. 枯草芽孢杆菌的分离筛选[J]. 畜牧兽医杂志，2013，32（2）：24-31.
[2]徐海燕，曹斌，辛国芹，等. 一株芽孢杆菌的分离鉴定及其益生潜质分析[J]. 家畜生态学报，2012，33（3）：48-53.
[3]周金敏，吴志新，曾令兵，等. 黄颡鱼肠道病原拮抗性芽孢杆菌的筛选与特性研究[J]. 水生生物学报，2012，36（1）：78-84.
[4]马如龙，杨红玲，孙云章，等. 2株渔源芽孢杆菌的生物学特性研究[J]. 水产科学，2010，29（9）：505-509.
[5]吕爱军，杨正行，刘欢，等. 斑马鱼肠道细菌的分离与生理生化特性[J]. 中国农学通报，2010，26（24）：412-415.
[6]东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001.
[7]Munro P D，Barbour A，Birkbeck T H. Comparison of the gut bacterial flora of start feeding larval turbot rearedunder different conditions[J]. Journal of Applied Bacteriology，1994，77（5）：560-566.
[8]邱燕，蔡春芳，戴小芳，等. 枯草芽孢杆菌对草鱼生长性能与肠道黏膜形态的影响[J]. 中国饲料，2010（19）：34-36.
[9]江永明，付天玺，张丽，等. 微生物制剂对奥尼罗非鱼生长及消化酶活性的影响[J]. 水生生物学报，2011，35（6）：998-1004.
[10]赵士豪，杨会琴，赵春海. 益生菌芽孢杆菌的分离与初步鉴定[J]. 中国农学通报，2012，28（18）：271-275.
[11]唐家毅，劉婕，于铁妹，等. 一株水产芽孢杆菌的鉴定及其培养基优化的研究[J]. 淡水渔业，2008，38（6）：26-30.
[12]丁祥力，王震，陈薇，等. 枯草芽孢杆菌WH-5的分离鉴定及净水研究[J]. 湖南农业科学，2012（1）：15-19.
[13]贺刚，何力，王朝元，等. 草鱼肠道枯草芽孢杆菌的耐药性分析[J]. 现代农业科技，2008（22）：219-222.
关键词：鲫鱼；肠道细菌；枯草芽孢杆菌；分离鉴定；药敏试验
中图分类号： S917.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0244-02
收稿日期：2013-10-02
基金项目：国家自然科学基金（编号：31272692、30800847），江苏省高校重点专业类建设项目（编号：2012-2015）。
作者简介：李旭（1992—），男，江苏徐州人，主要从事水产动物微生物学研究。
通信作者：吕爱军，副教授，主要从事微生物及免疫学研究，E-mail：lajand@126.com。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种短杆状、无荚膜能运动的革兰氏阳性细菌，能产中生芽孢，广泛分布于土壤、湖泊、海洋、动植物体表及其栖息地[1]。2003年，我国农业部公布了能够用于生产微生态制剂菌种包括：枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）、蜡样芽孢杆菌（B. cereus）等[2]。最近，白延琴等从秸秆垛底层土壤中分离得到1株枯草芽孢杆菌[1]。周金敏等从黄颡鱼肠道中筛选出1株益生性芽孢杆菌[3]，结果表明，枯草芽孢杆菌的抗逆性及在消化道中稳定性强于其他益生菌。马如龙等研究斜带石斑鱼幼鱼肠道的优势菌为芽孢杆菌，对石斑鱼生长和健康具有促进作用[4]。本研究以鲫鱼肠道细菌为主要研究对象，从中分离纯化获得1株芽孢杆菌，并进行了染色特性、菌体形态、生理生化特性及药敏反应等研究，以期为鲫鱼肠道细菌的鉴定、微生态制剂开发等提供依据。
1材料与方法
1.1材料
鲫鱼购自江苏省徐州市某市场，体重约100 g。普通琼脂培养基、细菌生化微量鉴定管及药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。
1.2方法
1.2.1肠道细菌的分离与鉴定参考吕爱军等方法[5]进行，将新鲜鲫鱼肠道中的菌液，均匀涂布在普通琼脂平板，30 ℃ 恒温培养24 h后，挑取典型单菌落，采用平板划线法，纯化传代2～3次，转种于4 ℃冰箱保藏、备用。细菌生理生化特性试验等按常规方法进行，分别挑取单菌落涂片进行革兰氏染色及孔雀绿芽孢染色，镜检观察分离菌株的染色及形态特征。
1.2.2药敏试验采用纸片扩散法，用无菌操作将纸片置于接种分离菌株的普通琼脂平板，置于30 ℃温箱中培养24 h后，量取抑菌圈的直径，根据药敏试验判断标准书，确定该菌对不同药物的敏感程度。
2结果与分析
2.1菌落及形态特征
从鲫鱼肠道中分离纯化获得1株细菌，暂时编号为CB-1，接种于普通琼脂平板30 ℃恒温培养24 h后，形成表面干燥、褶皱、扁平、不透明、乳白色、边缘不整齐、直径2～5 mm的中大菌落；CB-1菌株为革兰氏阳性大杆菌，产芽孢，芽孢呈椭圆、中生状（图1）。
2.2生理生化特性
细菌生理生化试验结果，分离菌CB-1菌株葡萄糖酸盐利用试验、硫化氢产生试验、吲哚产生试验及MR试验为阴性，可利用葡萄糖产酸不产气，不能还原硝酸盐、水解淀粉、分解尿素，不能产生脱羧酶利用赖氨酸、鸟氨酸脱羧生成胺和二氧化碳；β-半乳糖苷、明胶液化试验为阳性。对CB-1菌株进行形态学观察、生理生化特性分析，发现与《常见细菌系统鉴定手册》[6]描述基本一致，初步鉴定为枯草芽孢杆菌。
2.3药敏试验
采用26种抗生素对CB-1菌株进行药敏试验，测量抑菌圈直径，计算平均值。结果表明，CB-1菌株对头孢菌素类（头孢噻吩、头孢哌酮、先锋霉素Ⅳ）、氨基糖甙类（丁胺卡那霉素、庆大霉素、卡那霉素、氯霉素、乙基西梭霉素）、大环内酯类（阿奇霉素、红霉素）等抗生素敏感；对洁霉素、甲硝唑、制霉菌素等不敏感（表1）。
3讨论
国内对鲫鱼肠道中枯草芽孢杆菌的分离鉴定，尚未见相关文献报道。近年来，枯草芽孢杆菌在水产养殖上作为饲料添加剂已被广泛应用。Munro等发现鱼类肠道菌群主要来源于所摄取的活饲料而不是养殖水体[7]。邱燕等通过添加适量枯草芽孢杆菌，发现可改善草鱼肠道黏膜形态，促进草鱼对营养物质的吸收利用[8]。江永明等在饲料中添加枯草芽孢杆菌，能显著促进奥尼罗非鱼的生长[9]。赵士豪等利用大肠杆菌为抑菌对象分离到4株芽孢杆菌，研究高效复合益生菌来替代抗生素，减少抗生素对鱼类养殖的不利影响[10]。唐家毅等从水产养殖环境中筛选出1株芽孢杆菌能够有效降解水体中的氨氮、亚硝酸盐氮[11]。丁祥力等分离1株枯草芽孢杆菌，可有效改善淡水养殖水体的水质[12]。贺刚等从草鱼肠道分离出1株枯草芽胞杆菌并进行药敏试验，结果表明，该菌株对诺氟沙星、头孢哌酮、庆大霉素等抗生素高度敏感[13]。本研究从鲫鱼肠道中分离纯化出1株枯草芽孢杆菌，药敏试验结果表明，CB-1菌株对诺氟沙星、头孢哌酮、庆大霉素等敏感，本研究结果与已有报道结果基本一致[13]。关于鲫鱼肠道中枯草芽孢杆菌的16S rDNA基因分子鉴定及微生态制剂研制，还有待于进一步研究。
参考文献：
[1]白延琴，辛小玲，来有志，等. 枯草芽孢杆菌的分离筛选[J]. 畜牧兽医杂志，2013，32（2）：24-31.
[2]徐海燕，曹斌，辛国芹，等. 一株芽孢杆菌的分离鉴定及其益生潜质分析[J]. 家畜生态学报，2012，33（3）：48-53.
[3]周金敏，吴志新，曾令兵，等. 黄颡鱼肠道病原拮抗性芽孢杆菌的筛选与特性研究[J]. 水生生物学报，2012，36（1）：78-84.
[4]马如龙，杨红玲，孙云章，等. 2株渔源芽孢杆菌的生物学特性研究[J]. 水产科学，2010，29（9）：505-509.
[5]吕爱军，杨正行，刘欢，等. 斑马鱼肠道细菌的分离与生理生化特性[J]. 中国农学通报，2010，26（24）：412-415.
[6]东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001.
[7]Munro P D，Barbour A，Birkbeck T H. Comparison of the gut bacterial flora of start feeding larval turbot rearedunder different conditions[J]. Journal of Applied Bacteriology，1994，77（5）：560-566.
[8]邱燕，蔡春芳，戴小芳，等. 枯草芽孢杆菌对草鱼生长性能与肠道黏膜形态的影响[J]. 中国饲料，2010（19）：34-36.
[9]江永明，付天玺，张丽，等. 微生物制剂对奥尼罗非鱼生长及消化酶活性的影响[J]. 水生生物学报，2011，35（6）：998-1004.
[10]赵士豪，杨会琴，赵春海. 益生菌芽孢杆菌的分离与初步鉴定[J]. 中国农学通报，2012，28（18）：271-275.
[11]唐家毅，劉婕，于铁妹，等. 一株水产芽孢杆菌的鉴定及其培养基优化的研究[J]. 淡水渔业，2008，38（6）：26-30.
[12]丁祥力，王震，陈薇，等. 枯草芽孢杆菌WH-5的分离鉴定及净水研究[J]. 湖南农业科学，2012（1）：15-19.
[13]贺刚，何力，王朝元，等. 草鱼肠道枯草芽孢杆菌的耐药性分析[J]. 现代农业科技，2008（22）：219-222.