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【摘要】 目的：探讨HMGB2、CCL1与NO在骨关节炎发病中的相关性，以了解HMGB2及CCL1在骨关节炎发病中可能的生物学作用。方法：选取54例KOA患者作为试验组，24例正常人作为对照组，应用酶联免疫吸附测定HMGB2、CCL1，用硝酸还原法测定NO在关节滑液中的含量，分析HMGB2与CCL1、NO在膝骨关节炎关节滑液中的相关性。结果：试验组的HMGB2、CCL1和NO三个指标均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.01），表示HMGB2、CCL1和NO三个指标在骨关节炎关节滑液中的表达与正常人的关节滑液比较异常增高。HMGB2与CCL1和NO的水平作Spearman相关分析，相关系数分别为r=0.912、0.885（P<0.01），均呈正相关。结论：HMGB2可能是炎症因子CCL1和NO的趋化因子，可促进KOA的局部非感染性炎症形成。
【关键词】 膝骨关节炎； 关节滑液； 高迁移蛋白2； 趋化因子1； 一氧化氮
骨性关节炎（osteoarthritis，OA）常见于老年化的退行性变、体重增加或者长期负重导致慢性压缩磨损的非感染性炎症改变、创伤导致的损伤性变等原因造成，初始仅引起关节轻微疼痛，逐渐可进展成关节疼痛加重、晨僵及关节活动功能障碍的慢性关节性疾病[1]。高迁移率蛋白2（High-mobility group box 2，HMGB2）主要表达在人类关节软骨浅表区，正常关节软骨里发现HMGB2的表达是随着年龄增长越来越少，最终导致完全缺失[2]。有报道显示趋化因子1（Chemokine ligand 1，CCL1）在非感染性炎症中的表达中增高，其可能在非感染性炎症中可趋化炎症因子的聚集[3]。KOA为非感染性骨关节炎，研究CCL1在KOA发病中的作用有重要的意义。故本文通过ELISA检测KOA患者关节滑液中HMGB2和CCL1的表达量，运用相关回归曲线分析他们的关系，并了解他们与骨关节炎发病进展中可能存在的关系。
1 材料与方法
1.1 一般材料 选取2010年3月-2013年10月本院骨科收治的54骨关节炎患者作为试验组。另选取本院24例健康体检者作为对照组，无KOA病史，双膝关节X线平片正常，行关节穿刺前与其签署知情同意书。KOA临床诊断标准参考2010年中华医学会风湿病学分会制定的《骨关节炎诊断及治疗指南》及X线诊断标准（参考Kellgren-Lawrence分级标准[4]）。试验组的标本在患者行关节腔注射治疗前留取，两组均为2 mL生理盐水关节腔冲洗后抽出。两组标本均在1500 r/min离心10 min后取上清液，置于-20 ℃冰箱保存备用。
1.2 方法
1.2.1 主要仪器 -20 ℃普通冰箱，电热恒温水浴箱（深圳爱特尔），全自动酶标仪（Bio-Tec）。
1.2.2 主要试剂 High Mobility Group Box Protein 2 （HMGB2） ELISA Kit（货号：ABIN166506，公司：antibodies-online）；Chemokine （C-C motif） ligand 1 （CCL1） ELISA Kit（货号：10900-H14H，公司：Sino Biological Inc）；一氧化氮Griess Reagent法检测试剂盒（NO）（货号：S0021，公司：碧云天）。
1.2.3 ELISA检测HMGB2和CCL1在关节液中的表达水平 96孔板第一排的8个孔作为标准孔，按以下浓度：1、5、10、20、30、40、50 μL滴入各标准孔，按50 μL/孔稀释，第一排的最后一个孔滴入超纯水作为空白对照，利用标准孔数据在Excel下建立标准曲线。将制备的关节液回复常温后各样品50 μL加入其余样品孔，在37 ℃的恒温箱中反应90 min；预先制备的0.01 M PBS洗板三次，滤纸印干；加入一抗（HMGB2、CCL1）100 μL，37 ℃恒温箱中反应60 min；0.01 M PBS再次洗板三次，每次浸泡4 min，滤纸印干；加入酶标液100 μL，37 ℃恒温箱中反应30 min；0.01 M PBS洗板四次，每次浸泡3 min，滤纸印干；加入底物TMB 90 μL，置恒温箱中37 ℃在暗處反应11 min；每孔加入一滴终止液混匀，当蓝色转为黄色时上机检测；DG5033A酶标仪设定450 nm处测定吸光值。
1.2.4 关节滑液中一氧化氮的检测 取出标准品（1M NaNO2）和样品（关节液）放置至室温；将标准品按以下浓度加入标准孔：0、1、2、5、10、20、30、40、50、60、80、100 μM，并稀释至50 μL/孔。在剩余的样品孔中加入50 μL/孔的关节液样品；取出Griess Reagent Ⅰ、Ⅱ放置至室温，按50 μL/孔在各孔中加入Griess Reagent Ⅰ，按50 μL/孔在各孔中加入Griess Reagent Ⅱ；通过酶标仪测出各标准品及样品孔的吸光度，通过标准品的吸光度绘制出标准曲线，并通过标准曲线及样品孔的吸光度求出各样品的NO浓度。
1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，其中三个指标的试验组与对照组组间比较应用单因素方差分析；作CCL1与HMGB2及CCL1与NO进行Spearman相关分析，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组HMGB2、CCL1及NO在关节滑液中的检测结果比较 试验组的HMGB2、CCL1和NO三个指标均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.01），表示HMGB2、CCL1和NO三个指标在骨关节炎关节滑液中的表达与正常人的关节滑液比较异常增高，见表1。
2.2 HMGB2与CCL1和NO的相关分析 HMGB2与CCL1和NO的水平作Spearman相关分析，相关系数分别为r=0.912、0.885（P<0.01），均呈正相关。 3 讨论
膝骨关节炎（Knee Osteoarthritis，KOA）的发病与关节滑液中炎症因子的形成与聚集密切相关，有实验研究表明在胚胎时期间充质干细胞定向发育为软骨与成骨的过程中，一定浓度的趋化因子注射于上述过程的环境中时，可表现出聚集炎症因子、趋化炎症改变[5]。然而KOA的关节滑液中的炎症改变是否与HMGB2的炎症趋化有关？定量检测KOA患者关节滑液中HMGB2的含量是否可以作为KOA的诊断指标？目前为止尚未有报道肯定的回答以上两个问题，以下将对以上两个问题展开深入讨论。
非感染性炎症是KOA局部内环境的主要特征，在KOA的发展过程中早期病理改变主要表现为：关节软骨浅表区的非感染行炎症改变，并逐渐进展为胶原的破坏、缺失，软骨细胞的凋亡，并最终出现软骨层的中断，该病理生理过程的蛋白分子机制尚未完全阐明[6]。然而另一方面的实验证明在早期红斑狼疮细胞（非感染性炎症）的研究中，应用趋化因子HMGB2受体竞争性抑制剂干预红斑狼疮细胞病程进展，发现红斑狼疮的非感染性炎症范围逐步缩小，炎症因子浓度逐渐下降[7]。本实验研究发现HMGB2、CCL1及NO在试验组的表达均较对照组高，由此可见HMGB2、CCL1及NO均为骨关节炎的炎症因子之一，与其他报道结果基本相符[8]。笔者发现HMGB2在骨关节炎患者的关节滑液中表达量是正常人的4～5倍，而HMGB2和NO的表达量在2～3倍，由此更加证实了HMGB2可能是炎症因子CCL1和NO的趋化因子。
NO因浓度不同而具有不同的生物学作用，低浓度时可扩血管、促炎症的作用，高浓度时可促细胞凋亡的作用。近几年有大量的实验证明了NO与KOA有密切的关系，其中早期KOA时，低浓度的NO可促使KOA非感染性炎症改变；晚期KOA时，高浓度的NO可促使软骨细胞的凋亡，由此可见NO于KOA密切相关[9-10]。HMGB2是由Th1细胞分泌的趋化性细胞因子，有大量相关的报道其为KOA的炎症相关因子之一[11-12]。本研究发现HMGB2与NO和CCL1均成正相关关系，由此可表明HMGB2可促进KOA的局部非感染性炎症形成。
综上所述，HMGB2可能是炎症因子CCL1和NO的趋化因子，其可促进KOA的局部非感染性炎症形成。探讨HMGB2受体抑制剂对KOA细胞或者KOA动物实验的治疗作用，可为KOA的治疗提供新的靶向治疗方向；然而通过研究HMGB2在KOA各级临床阶段的分组变化，能够更有效地掌握各级临床阶段中HMGB2的实验数据，为将来临床HMGB2靶向治疗提供可靠的依据。
参考文献
[1]李存祥，贾素华，王健，等.单纯腓骨截断术治疗膝骨关节炎临床研究[J].中国医学创新，2010，7（2）：115-117.
[2]陈向阳，郭开今，董启榕，等.兔骨性关节炎早期软骨下骨弹性模量改变的实验研究[J].中国医学创新，2011，8（3）：15-17.
[3] Di Prisco S，Merega E，Milanese M，et al.CCL5-glutamate interaction in central nervous system：early and acute presynaptic defects in EAE mice[J].Neuropharmacology，2013，16（75）：337-346.
[4] Vincent H K，Percival S S，Conrad B P，et al.Hyaluronic acid （HA） viscosupplementation on synovial fluid inflammation in knee osteoarthritis：a pilot study[J].Open Orthop J，2013，20（7）：378-384.
[5]杨国奇，蔡杰勇，钟小会.玻璃酸钠治疗膝关节骨关节炎的临床观察[J].中国医学创新，2012，9（16）：140-141.
[6] Petersson I F，Boeg?rd T，Saxne T，et al.Radiographic osteoarthritis of the knee classified by the Ahlb?ck and Kellgren & Lawrence systems for the tibiofemoral joint in people aged 35-54 years with chronic knee pain[J].Ann Rheum Dis，1997，56（8）：493-496.
[7] Hrycek E，Franek A，B?aszczak E，et al.Serum levels of selected chemokines in systemic lupus erythematosus patients[J].Rheumatol Int，2013，33（9）：2423-2427.
[8] Pierzchala A W，Kusz D J，Hajduk G.CXCL8 and CCL5 expression in synovial fluid and blood serum in patients with osteoarthritis of the knee[J].Arch Immunol Ther Exp （Warsz），2011，59（2）：151-155.
[9] El Mansouri F E，Chabane N，Zayed N，et al.Contribution of H3K4 methylation by SET-1A to interleukin-1-induced cyclooxygenase 2 and inducible nitric oxide synthase expression in human osteoarthritis chondrocytes[J].Arthritis Rheum，2011，63（1）：168-179.
[10]林睿，高燦，胡永挑，等.NO，TNF-α在骨性关节炎病程中的作用[J].放射免疫学杂志，2011，24（3）：351-352.
[11] Chauffier K，Laiguillon M C，Bougault C，et al.Induction of the chemokine IL-8/Kc by the articular cartilage：possible influence on osteoarthritis[J].Joint Bone Spine，2012，79（6）：604-609.
[12] Raap T，Jüsten H P，Miller L E，et al.Neurotransmitter modulation of interleukin 6 （IL-6） and IL-8 secretion of synovial fibroblasts in patients with rheumatoid arthritis compared to osteoarthritis[J].J Rheumatol，2000，27（11）：2558-2565.
（收稿日期：2014-01-03） （本文编辑：欧丽）
【关键词】 膝骨关节炎； 关节滑液； 高迁移蛋白2； 趋化因子1； 一氧化氮
骨性关节炎（osteoarthritis，OA）常见于老年化的退行性变、体重增加或者长期负重导致慢性压缩磨损的非感染性炎症改变、创伤导致的损伤性变等原因造成，初始仅引起关节轻微疼痛，逐渐可进展成关节疼痛加重、晨僵及关节活动功能障碍的慢性关节性疾病[1]。高迁移率蛋白2（High-mobility group box 2，HMGB2）主要表达在人类关节软骨浅表区，正常关节软骨里发现HMGB2的表达是随着年龄增长越来越少，最终导致完全缺失[2]。有报道显示趋化因子1（Chemokine ligand 1，CCL1）在非感染性炎症中的表达中增高，其可能在非感染性炎症中可趋化炎症因子的聚集[3]。KOA为非感染性骨关节炎，研究CCL1在KOA发病中的作用有重要的意义。故本文通过ELISA检测KOA患者关节滑液中HMGB2和CCL1的表达量，运用相关回归曲线分析他们的关系，并了解他们与骨关节炎发病进展中可能存在的关系。
1 材料与方法
1.1 一般材料 选取2010年3月-2013年10月本院骨科收治的54骨关节炎患者作为试验组。另选取本院24例健康体检者作为对照组，无KOA病史，双膝关节X线平片正常，行关节穿刺前与其签署知情同意书。KOA临床诊断标准参考2010年中华医学会风湿病学分会制定的《骨关节炎诊断及治疗指南》及X线诊断标准（参考Kellgren-Lawrence分级标准[4]）。试验组的标本在患者行关节腔注射治疗前留取，两组均为2 mL生理盐水关节腔冲洗后抽出。两组标本均在1500 r/min离心10 min后取上清液，置于-20 ℃冰箱保存备用。
1.2 方法
1.2.1 主要仪器 -20 ℃普通冰箱，电热恒温水浴箱（深圳爱特尔），全自动酶标仪（Bio-Tec）。
1.2.2 主要试剂 High Mobility Group Box Protein 2 （HMGB2） ELISA Kit（货号：ABIN166506，公司：antibodies-online）；Chemokine （C-C motif） ligand 1 （CCL1） ELISA Kit（货号：10900-H14H，公司：Sino Biological Inc）；一氧化氮Griess Reagent法检测试剂盒（NO）（货号：S0021，公司：碧云天）。
1.2.3 ELISA检测HMGB2和CCL1在关节液中的表达水平 96孔板第一排的8个孔作为标准孔，按以下浓度：1、5、10、20、30、40、50 μL滴入各标准孔，按50 μL/孔稀释，第一排的最后一个孔滴入超纯水作为空白对照，利用标准孔数据在Excel下建立标准曲线。将制备的关节液回复常温后各样品50 μL加入其余样品孔，在37 ℃的恒温箱中反应90 min；预先制备的0.01 M PBS洗板三次，滤纸印干；加入一抗（HMGB2、CCL1）100 μL，37 ℃恒温箱中反应60 min；0.01 M PBS再次洗板三次，每次浸泡4 min，滤纸印干；加入酶标液100 μL，37 ℃恒温箱中反应30 min；0.01 M PBS洗板四次，每次浸泡3 min，滤纸印干；加入底物TMB 90 μL，置恒温箱中37 ℃在暗處反应11 min；每孔加入一滴终止液混匀，当蓝色转为黄色时上机检测；DG5033A酶标仪设定450 nm处测定吸光值。
1.2.4 关节滑液中一氧化氮的检测 取出标准品（1M NaNO2）和样品（关节液）放置至室温；将标准品按以下浓度加入标准孔：0、1、2、5、10、20、30、40、50、60、80、100 μM，并稀释至50 μL/孔。在剩余的样品孔中加入50 μL/孔的关节液样品；取出Griess Reagent Ⅰ、Ⅱ放置至室温，按50 μL/孔在各孔中加入Griess Reagent Ⅰ，按50 μL/孔在各孔中加入Griess Reagent Ⅱ；通过酶标仪测出各标准品及样品孔的吸光度，通过标准品的吸光度绘制出标准曲线，并通过标准曲线及样品孔的吸光度求出各样品的NO浓度。
1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，其中三个指标的试验组与对照组组间比较应用单因素方差分析；作CCL1与HMGB2及CCL1与NO进行Spearman相关分析，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组HMGB2、CCL1及NO在关节滑液中的检测结果比较 试验组的HMGB2、CCL1和NO三个指标均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.01），表示HMGB2、CCL1和NO三个指标在骨关节炎关节滑液中的表达与正常人的关节滑液比较异常增高，见表1。
2.2 HMGB2与CCL1和NO的相关分析 HMGB2与CCL1和NO的水平作Spearman相关分析，相关系数分别为r=0.912、0.885（P<0.01），均呈正相关。 3 讨论
膝骨关节炎（Knee Osteoarthritis，KOA）的发病与关节滑液中炎症因子的形成与聚集密切相关，有实验研究表明在胚胎时期间充质干细胞定向发育为软骨与成骨的过程中，一定浓度的趋化因子注射于上述过程的环境中时，可表现出聚集炎症因子、趋化炎症改变[5]。然而KOA的关节滑液中的炎症改变是否与HMGB2的炎症趋化有关？定量检测KOA患者关节滑液中HMGB2的含量是否可以作为KOA的诊断指标？目前为止尚未有报道肯定的回答以上两个问题，以下将对以上两个问题展开深入讨论。
非感染性炎症是KOA局部内环境的主要特征，在KOA的发展过程中早期病理改变主要表现为：关节软骨浅表区的非感染行炎症改变，并逐渐进展为胶原的破坏、缺失，软骨细胞的凋亡，并最终出现软骨层的中断，该病理生理过程的蛋白分子机制尚未完全阐明[6]。然而另一方面的实验证明在早期红斑狼疮细胞（非感染性炎症）的研究中，应用趋化因子HMGB2受体竞争性抑制剂干预红斑狼疮细胞病程进展，发现红斑狼疮的非感染性炎症范围逐步缩小，炎症因子浓度逐渐下降[7]。本实验研究发现HMGB2、CCL1及NO在试验组的表达均较对照组高，由此可见HMGB2、CCL1及NO均为骨关节炎的炎症因子之一，与其他报道结果基本相符[8]。笔者发现HMGB2在骨关节炎患者的关节滑液中表达量是正常人的4～5倍，而HMGB2和NO的表达量在2～3倍，由此更加证实了HMGB2可能是炎症因子CCL1和NO的趋化因子。
NO因浓度不同而具有不同的生物学作用，低浓度时可扩血管、促炎症的作用，高浓度时可促细胞凋亡的作用。近几年有大量的实验证明了NO与KOA有密切的关系，其中早期KOA时，低浓度的NO可促使KOA非感染性炎症改变；晚期KOA时，高浓度的NO可促使软骨细胞的凋亡，由此可见NO于KOA密切相关[9-10]。HMGB2是由Th1细胞分泌的趋化性细胞因子，有大量相关的报道其为KOA的炎症相关因子之一[11-12]。本研究发现HMGB2与NO和CCL1均成正相关关系，由此可表明HMGB2可促进KOA的局部非感染性炎症形成。
综上所述，HMGB2可能是炎症因子CCL1和NO的趋化因子，其可促进KOA的局部非感染性炎症形成。探讨HMGB2受体抑制剂对KOA细胞或者KOA动物实验的治疗作用，可为KOA的治疗提供新的靶向治疗方向；然而通过研究HMGB2在KOA各级临床阶段的分组变化，能够更有效地掌握各级临床阶段中HMGB2的实验数据，为将来临床HMGB2靶向治疗提供可靠的依据。
参考文献
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[2]陈向阳，郭开今，董启榕，等.兔骨性关节炎早期软骨下骨弹性模量改变的实验研究[J].中国医学创新，2011，8（3）：15-17.
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[4] Vincent H K，Percival S S，Conrad B P，et al.Hyaluronic acid （HA） viscosupplementation on synovial fluid inflammation in knee osteoarthritis：a pilot study[J].Open Orthop J，2013，20（7）：378-384.
[5]杨国奇，蔡杰勇，钟小会.玻璃酸钠治疗膝关节骨关节炎的临床观察[J].中国医学创新，2012，9（16）：140-141.
[6] Petersson I F，Boeg?rd T，Saxne T，et al.Radiographic osteoarthritis of the knee classified by the Ahlb?ck and Kellgren & Lawrence systems for the tibiofemoral joint in people aged 35-54 years with chronic knee pain[J].Ann Rheum Dis，1997，56（8）：493-496.
[7] Hrycek E，Franek A，B?aszczak E，et al.Serum levels of selected chemokines in systemic lupus erythematosus patients[J].Rheumatol Int，2013，33（9）：2423-2427.
[8] Pierzchala A W，Kusz D J，Hajduk G.CXCL8 and CCL5 expression in synovial fluid and blood serum in patients with osteoarthritis of the knee[J].Arch Immunol Ther Exp （Warsz），2011，59（2）：151-155.
[9] El Mansouri F E，Chabane N，Zayed N，et al.Contribution of H3K4 methylation by SET-1A to interleukin-1-induced cyclooxygenase 2 and inducible nitric oxide synthase expression in human osteoarthritis chondrocytes[J].Arthritis Rheum，2011，63（1）：168-179.
[10]林睿，高燦，胡永挑，等.NO，TNF-α在骨性关节炎病程中的作用[J].放射免疫学杂志，2011，24（3）：351-352.
[11] Chauffier K，Laiguillon M C，Bougault C，et al.Induction of the chemokine IL-8/Kc by the articular cartilage：possible influence on osteoarthritis[J].Joint Bone Spine，2012，79（6）：604-609.
[12] Raap T，Jüsten H P，Miller L E，et al.Neurotransmitter modulation of interleukin 6 （IL-6） and IL-8 secretion of synovial fibroblasts in patients with rheumatoid arthritis compared to osteoarthritis[J].J Rheumatol，2000，27（11）：2558-2565.
（收稿日期：2014-01-03） （本文编辑：欧丽）