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摘 要：本实验以甘草酸为指标对甘草提取工艺进行研究。甘草酸最佳提取工艺为加入10倍量40%乙醇，超声提取25分钟，连续提取4次。本工艺稳定、可行、收率高。
关键词：甘草；提取；工艺
甘草别名为国老、甜草、乌拉尔甘草、甜根子。甘草具有清热解毒、祛痰止咳、脘腹等功效。甘草含有多种化学成分，主要成分有甘草酸、甘草甙、甘草甜素、甘草次酸、甘草甙、新异甘草甙、甘草素、异甘草素、异甘草甙、新甘草甙、甘草醇、异甘草醇[1-2]。大量的研究表明，甘草酸是甘草中最重要的生理活性物质之一。甘草具有抗溃疡、抗氧化、抗病毒、抗癌、抗炎、解痉、保肝、祛痰和增强记忆力等多种药理活性[3-5]。本实验以甘草酸为指标对甘草提取工艺进行研究。
1 仪器与试药
上海和泰仪器有限公司Ultra-pure water 超纯水器water-20n（中科仪（北京）仪器有限公司）；山东鲁创LC-3000液相色谱仪（梯度）（山东鲁创分析仪器有限公司）；XP204分析天平（北京联博永通科技有限公司）；KQ250DE超声波清洗器超声波检测仪器（烟台鑫康商贸有限公司）；PHS-550智能型台式酸度计（杭州陆恒生物科技有限公司）；WP-UP-Ⅲ-20精密型实验室专用超纯水机（四川沃特尔水处理设备有限公司）；美析V-1200可见分光光度计（美析（中国）仪器有限公司）。甘草酸对照品（中国药品生物制品检定所提供）。乙腈（山东丰仓化工有限公司）；磷酸（济南圣丰工贸有限公司）；甲醇（山东丰仓化工有限公司）；乙醇（济南圣丰工贸有限公司）。
2 方法与结果
2.1 单因素考察
2.2.1 提取次数。按处方称取药材，粉碎为20目，至于圆底烧瓶内，分别提取四次，第一次加10倍40%乙醇，超声提取25分钟，过滤，合并滤液，减压浓缩；第二次加10倍40%乙醇，超声提取25分钟，连续提取两次，过滤，合并滤液，减压浓缩；第三次加10倍40%乙醇，超声提取25分钟，连续提取三次，过滤，合并滤液，减压浓缩。第四次加10倍40%乙醇，超声提取25分钟，连续提取四次，过滤，合并滤液，减压浓缩。采用高效液相测定浓缩膏中甘草酸含量并计算甘草酸收率。
2.1.2 药材粉碎目数。按处方称取药材，分别粉碎为10目、20目、40目，至于圆底烧瓶内，加10倍40%乙醇，超声提取25分钟，连续煎煮三次，过滤，合并滤液，减压浓缩。采用高效液相测定浓缩膏中甘草酸含量并计算甘草酸收率。
2.1.3 加醇倍数。按处方称取药材，粉碎为20目，至于圆底烧瓶内，分别提取四次，第一次加14倍40%乙醇，超声提取25分钟，连续四次，第二次加12倍40%乙醇，超声提取25分钟，连续四次，第三次加10倍40%乙醇，超声提取25分钟，连续四次，第四次加8倍40%乙醇，超声提取25分钟，连续四次，分别过滤，合并滤液，减压浓缩。采用高效液相测定浓缩膏中甘草酸含量并计算甘草酸收率。
2.1.4 提取时间。按处方称取药材，粉碎为20目，至于圆底烧瓶内，分别提取三次，第一次加10倍40%乙醇，超声提取25分钟，连续四次，第二次加10倍40%乙醇，超声提取30分钟，连续四次，第三次加10倍40%乙醇，超声提取35分钟，连续四次，分别过滤，合并滤液，减压浓缩。采用高效液相测定浓缩膏中甘草酸含量并计算甘草酸收率。
2.2 正交试验设计
实验结果表明，粉碎目数对甘草酸收率影响不大，提取次数、加醇倍数和提取时间对甘草酸收率影响较大。选择提取次数、加水倍数和提取时间作为考察因素，采用正交试验法对影响提取效率的其它工艺条件进行优选。采用3个考察水平，用L9（34）正交表进行试验，因素水平表见表1。
3 含量测定
3.1 色谱条件
依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下。色谱柱为安捷伦Cl8规格为（4.6mm×250mm，5μm）；流动相以乙腈为流动相A，以0.05%磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为237nm；流速1.0mL·min-1；柱温：30℃。理论板数按甘草酸铵峰计算应不得低于2000。
3.2 供试品溶液的制备
取提取膏适量，精密量取，置50mL量瓶中，加50%乙醇适量，超声处理十分钟，放置至室温，加50%乙醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得。
3.3 对照品溶液的制备
分别精密称取甘草酸铵对照品5mg，置25mL容量瓶中，用50%乙醇溶解并稀釋至刻度，摇匀，即得。
3.4 标准曲线的制备
将浓度为50μg/ml，100μg/ml，150μg/ml，200μg/ml，250μg/ml，300μg/ml的对照品溶液分别吸取20μL注入HPLC，以进样量（μg）为横坐标，峰面积积分值A为纵坐标，绘制标准曲线。试验表明，甘草酸铵对照品在50～300μg/ml范围内线性关系良好。
3.5 回收率试验
取已知含量的同一批供试品各6份，分别精密添加一定量的甘草酸对照品，测定含量，计算回收率。平均回收率为98.55%，RSD为0.71%。
3.6 样品含量测定
依照上述含量测定方法，测定提取膏中甘草酸的含量，甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207。
4 实验结果
按照L9（34）正交设计表条件进行试验，得到最佳提取工艺为加入10倍量40%乙醇，超声提取25分钟，连续提取4次。本工艺稳定、可行、收率高。
参考文献
[1]田庆来，官月平，张波，刘会洲.甘草有效成分的药理作用研究进展[J].天然产物研究与开发，2006（2）.
[2]用含黄芩属、甘草属等植物提取物的制品增强化疗药物的抗肿瘤疗效[J].国外医药（植物药分册），2006（5）.
[3]陈超，李宁，倪慧，孟大利，张娟，贾晓光.甘草化学成分分离、细胞培养和分析研究进展[J].现代药物与临床，2011（3）.
[4]刘萍，王平.甘草化学成分及其对心血管系统影响的机理[J].世界科学技术（中医药现代化），2011（1）.
[5]梁冰，杨爱馥，黄凤兰，胡宝忠.甘草属（Glycyrrhiza）化学成分及药理作用研究进展[J].东北农业大学学报，2006（1）.
关键词：甘草；提取；工艺
甘草别名为国老、甜草、乌拉尔甘草、甜根子。甘草具有清热解毒、祛痰止咳、脘腹等功效。甘草含有多种化学成分，主要成分有甘草酸、甘草甙、甘草甜素、甘草次酸、甘草甙、新异甘草甙、甘草素、异甘草素、异甘草甙、新甘草甙、甘草醇、异甘草醇[1-2]。大量的研究表明，甘草酸是甘草中最重要的生理活性物质之一。甘草具有抗溃疡、抗氧化、抗病毒、抗癌、抗炎、解痉、保肝、祛痰和增强记忆力等多种药理活性[3-5]。本实验以甘草酸为指标对甘草提取工艺进行研究。
1 仪器与试药
上海和泰仪器有限公司Ultra-pure water 超纯水器water-20n（中科仪（北京）仪器有限公司）；山东鲁创LC-3000液相色谱仪（梯度）（山东鲁创分析仪器有限公司）；XP204分析天平（北京联博永通科技有限公司）；KQ250DE超声波清洗器超声波检测仪器（烟台鑫康商贸有限公司）；PHS-550智能型台式酸度计（杭州陆恒生物科技有限公司）；WP-UP-Ⅲ-20精密型实验室专用超纯水机（四川沃特尔水处理设备有限公司）；美析V-1200可见分光光度计（美析（中国）仪器有限公司）。甘草酸对照品（中国药品生物制品检定所提供）。乙腈（山东丰仓化工有限公司）；磷酸（济南圣丰工贸有限公司）；甲醇（山东丰仓化工有限公司）；乙醇（济南圣丰工贸有限公司）。
2 方法与结果
2.1 单因素考察
2.2.1 提取次数。按处方称取药材，粉碎为20目，至于圆底烧瓶内，分别提取四次，第一次加10倍40%乙醇，超声提取25分钟，过滤，合并滤液，减压浓缩；第二次加10倍40%乙醇，超声提取25分钟，连续提取两次，过滤，合并滤液，减压浓缩；第三次加10倍40%乙醇，超声提取25分钟，连续提取三次，过滤，合并滤液，减压浓缩。第四次加10倍40%乙醇，超声提取25分钟，连续提取四次，过滤，合并滤液，减压浓缩。采用高效液相测定浓缩膏中甘草酸含量并计算甘草酸收率。
2.1.2 药材粉碎目数。按处方称取药材，分别粉碎为10目、20目、40目，至于圆底烧瓶内，加10倍40%乙醇，超声提取25分钟，连续煎煮三次，过滤，合并滤液，减压浓缩。采用高效液相测定浓缩膏中甘草酸含量并计算甘草酸收率。
2.1.3 加醇倍数。按处方称取药材，粉碎为20目，至于圆底烧瓶内，分别提取四次，第一次加14倍40%乙醇，超声提取25分钟，连续四次，第二次加12倍40%乙醇，超声提取25分钟，连续四次，第三次加10倍40%乙醇，超声提取25分钟，连续四次，第四次加8倍40%乙醇，超声提取25分钟，连续四次，分别过滤，合并滤液，减压浓缩。采用高效液相测定浓缩膏中甘草酸含量并计算甘草酸收率。
2.1.4 提取时间。按处方称取药材，粉碎为20目，至于圆底烧瓶内，分别提取三次，第一次加10倍40%乙醇，超声提取25分钟，连续四次，第二次加10倍40%乙醇，超声提取30分钟，连续四次，第三次加10倍40%乙醇，超声提取35分钟，连续四次，分别过滤，合并滤液，减压浓缩。采用高效液相测定浓缩膏中甘草酸含量并计算甘草酸收率。
2.2 正交试验设计
实验结果表明，粉碎目数对甘草酸收率影响不大，提取次数、加醇倍数和提取时间对甘草酸收率影响较大。选择提取次数、加水倍数和提取时间作为考察因素，采用正交试验法对影响提取效率的其它工艺条件进行优选。采用3个考察水平，用L9（34）正交表进行试验，因素水平表见表1。
3 含量测定
3.1 色谱条件
依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下。色谱柱为安捷伦Cl8规格为（4.6mm×250mm，5μm）；流动相以乙腈为流动相A，以0.05%磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为237nm；流速1.0mL·min-1；柱温：30℃。理论板数按甘草酸铵峰计算应不得低于2000。
3.2 供试品溶液的制备
取提取膏适量，精密量取，置50mL量瓶中，加50%乙醇适量，超声处理十分钟，放置至室温，加50%乙醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得。
3.3 对照品溶液的制备
分别精密称取甘草酸铵对照品5mg，置25mL容量瓶中，用50%乙醇溶解并稀釋至刻度，摇匀，即得。
3.4 标准曲线的制备
将浓度为50μg/ml，100μg/ml，150μg/ml，200μg/ml，250μg/ml，300μg/ml的对照品溶液分别吸取20μL注入HPLC，以进样量（μg）为横坐标，峰面积积分值A为纵坐标，绘制标准曲线。试验表明，甘草酸铵对照品在50～300μg/ml范围内线性关系良好。
3.5 回收率试验
取已知含量的同一批供试品各6份，分别精密添加一定量的甘草酸对照品，测定含量，计算回收率。平均回收率为98.55%，RSD为0.71%。
3.6 样品含量测定
依照上述含量测定方法，测定提取膏中甘草酸的含量，甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207。
4 实验结果
按照L9（34）正交设计表条件进行试验，得到最佳提取工艺为加入10倍量40%乙醇，超声提取25分钟，连续提取4次。本工艺稳定、可行、收率高。
参考文献
[1]田庆来，官月平，张波，刘会洲.甘草有效成分的药理作用研究进展[J].天然产物研究与开发，2006（2）.
[2]用含黄芩属、甘草属等植物提取物的制品增强化疗药物的抗肿瘤疗效[J].国外医药（植物药分册），2006（5）.
[3]陈超，李宁，倪慧，孟大利，张娟，贾晓光.甘草化学成分分离、细胞培养和分析研究进展[J].现代药物与临床，2011（3）.
[4]刘萍，王平.甘草化学成分及其对心血管系统影响的机理[J].世界科学技术（中医药现代化），2011（1）.
[5]梁冰，杨爱馥，黄凤兰，胡宝忠.甘草属（Glycyrrhiza）化学成分及药理作用研究进展[J].东北农业大学学报，2006（1）.