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摘要
[目的] 建立一种高效稳定的杂种落叶松组织培养体系。[方法]以杂种落叶松成熟合子胚作为外植体材料，对其按照不同处理方式进行消毒，且以不同种类培养基和激素种类及浓度进行愈伤组织的诱导，测算愈伤组织的体积。[结果]将去皮种子用流水冲洗2 d，用70%乙醇消毒1 min转入4%NaClO消毒15 min后，再将剥出的胚放入0.5%NaClO消毒2 min胚存活率最高;在光照條件下，BM培养基中添加2.0 mg/L TDZ愈伤组织的诱导效果最好，愈伤组织的诱导率为90.5%;愈伤组织的L、W、H与t呈类线性关系，体积与时间呈类指数关系。[结论] 为落叶松稳定组织培养体系的构建和优化提供方法。
关键词 杂种落叶松; 成熟合子胚; 愈伤组织诱导; 愈伤组织体积
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）32-11243-04
The Culture Medium Establishment and Optimization for Callus Induction of Hybrid larch
ZHANG Li，ZHANG Lei*， FANG Jiaoyang et al
（Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding，Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）
Abstract [Objective] The aim was to establish a highly efficient and stable tissue culture system of Hybrid larch.[Method]Using mature zygotic embryos of Hybrid larch as explants material， different treatments for disinfection， and Callus induction were done in types of different medium and hormone ， and the volume of callus was measured. [Result]Statistical analysis results showed that： the peeled seed washed with water for 2448 h， 70% alcohol disinfection for 1min into 4%NaClO for 15 min and then stripping out the embryo into 0.5% NaClO disinfection for 2 min， survival rate of embryo was highest. ; In the light conditions， induced effect of cultured callus medium was best in BM by adding 2 mg/L TDZ， induction rate of the callus was 90.5%; callus long， width， thickness and time were linear relationship， was the exponential relationship between volume and time. [Conclusion] The study provided method for construction and optimization of stability and tissue culture system of Hybrid larch.
Key words Hybrid larch;Mature zygotic embryos;Callus induction;Volume of callus
落叶松是我国东北地区主要的针叶用材树种，在林业生产中占有重要地位[1]，具有分布面积广、适应性强、生长迅速、耐寒能力强等特点。杂种落叶松（Hybrid larch）是落叶松属中一个非常重要的速生树种，其遗传增益大，具有树干通直、圆满，木材坚硬、耐腐蚀等特点，是铁路、桥梁、造船、电业等方面的优良用材[2]。但由于落叶松生长周期长，采用常规育种进行新品种选育时，耗时长、见效慢，且某些优良性状在繁殖过程中无法控制，子代遗传的效果差，同时还存在基因资源缺乏和杂交不亲和等制约因素，落叶松组织培养不可控因素较多，且不同种落叶松无性繁殖差异性较大，所以需要建立一种高效稳定的组织培养体系，而其中愈伤组织的诱导是组织培养过程的第一步，也是比较重要的一步，通过稳定的愈伤组织诱导培养基的建立和优化，可以为落叶松稳定组织培养体系的构建和优化提供方法，也为无性系的繁殖、落叶松遗传改良及转基因育种奠定坚实的基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为2013年采自黑龙江省牡丹江市林口县青山种子园的成熟种子。
1.2 试验方法
1.2.1
外植体的消毒。选择成熟、饱满的杂种落叶松种子，剥去种皮后，流水冲洗24～48 h。先使用70%的乙醇消毒1 min后，分别在4%NaClO消毒10、15、20 min，30% H2O2消毒15、20、30 min，或者0.1% HgCl2消毒6、8、10 min（HgCl2消毒时间过长时将胚杀死），然后无菌水洗净，剥去胚乳，将胚用0.5% NaClO消毒2 min，无菌水洗净并用灭菌滤纸吸干水分，接种到培养基上，7 d后统计存活率（即非感染菌）。 1.2.2
基本培养基及激素组合、浓度的筛选。
以MS、S和BM为基本培养基，添加蔗糖30 g/L，琼脂6.5 g/L ，肌醇1 g/L ，L谷氨酰胺（LGln）450 mg/L，水解酪蛋白（CH） 500 mg/L，调节pH为5.8～6.0，MS、S置暗培养，BM光培养（暗培养效果差），按设计的激素组合及浓度（表2）分别添加至基本培养基中，置于23～25 ℃培养，观察愈伤组织形态及生长状况并统计愈伤率。
1.2.3
愈伤组织的长、宽、厚的测量及体积的计算。
在BM培养基，TDZ 2.0 mg/L的条件下，统计L、W、H。将接种日期记为第1天，每隔7 d用游标卡尺测量L、W、H，测12次，计算体积（mm3）。其中，1～ 3次按长方体计算体积V长，4～7次按圆锥体计算V锥，8～12次按球体计算V球，并对所得数据进行统计分析。V的计算公式如下：
V长=L*W*H
V锥=（1/48）*3.14* L*（W+H）2
V球=（1/162）*3.14*（L+W+H）3
1.3 数据统计及分析
数据统计时以试验中每一培养皿作基本单元分别统计，然后按处理方式的不同进行分类，求得平均值、标准差等，根据数据的情况进行方差分析、多重比較、时序分析等。
2 结果与分析
2.1 不同消毒处理的分析
NaClO、H2O2、HgCl2不同消毒时间对胚存活率的影响见表1。由表1可知，9种不同处理方式中，以NaClO（4%）消毒15 min及HgCl2（0.1%）消毒10 min为佳，未染菌胚的存活率分别为88.9%和83.6%，标准差s分别为0.130 5和0.320 2。由于HgCl2的毒性较强并易污染环境，因此9种处理方式中以NaClO（4%）消毒15 min最佳。按灭菌剂的种类不同，得到的存活率依次为68.0%、49.0%和48.1%，标准差s依次为0.241 7、0.250 7和0.380 1。由此可知，NaClO的消毒效果显著优于H2O2和HgCl2。
表1 NaClO、H2O2、HgCl2不同消毒时间对胚存活率的影响
灭菌剂
种类浓度
%处理时
间∥min外植体
总数∥个胚存活
数∥个胚存活
率∥%胚整体存
活率∥%
NaClO410563562.4 abc68.0 a
15807088.9 a
20643148.5 cd
H2O23015724359.3 bc49.0 b
20482859.0 bcd
30702231.4 de
HgCl20.1660813.3 e48.1 b
8643250.0 cd
10564783.6 ab
注：多重比较采用Duncan法，同列不同字母表示在0.05水平上差异显著。
表2 培养基和激素组合对愈伤组织诱导的影响
培养基激素组合及
浓度∥mg/L愈伤率
%愈伤组织的生长情况
MS0.5a+0.05b23.5白色，紧实，含水量大，生长慢
0.5a+0.5b31.4白色，紧实，生长较慢
0.5a+1.0b42.7白色、乳白色，疏松，生长一般
1.0a+0.05b44.3白色、乳白色，疏松，生长一般
1.0a+0.5b47.6黄白色、黄绿色，疏松，生长快
1.0a+1.0b40.9白色，疏松，生长一般
2.0a+0.05b48.1黄白色、黄绿色，疏松，生长快
2.0a+0.5b52.5黄白色、黄绿色，疏松，生长较快
2.0a+1.0b59.8黄白色、黄绿色，疏松，生长较快
0.05b+0.5c26.7白色，紧实，含水量大，生长慢
0.5b+0.5c32.8白色，紧实，生长慢
0.05b+1.0c39.5白色，紧实，生长一般
0.5b+1.0c45.2白色、乳白色，疏松，生长快
0.05b+2.0c33.1白色，紧实，生长慢
0.5b+2.0c31.9白色，紧实，生长慢
S0.5a+0.5b+0.5d17.6白色、黄白色，质地硬，致密，生长慢
0.5a+0.5b+1.0d10.3含水量大，后期逐渐褐化死亡
0.5a+1.0b+0.5d15.8白色、黄白色，质地硬，致密，生长慢
0.5a+1.0b+1.0d12.4白色，紧实，生长较慢
1.0a+0.5b+0.5d14.2白色，紧实，生长较慢
1.0a+0.5b+1.0d7.9含水量大，后期逐渐褐化死亡
1.0a+1.0b+0.5d16.8白色、黄白色，质地硬，致密，生长慢
1.0a+1.0b+1.0d9.8含水量大，后期逐渐褐化死亡
2.0a+0.5b+0.5d18.3白色、黄白色，质地硬，致密，生长慢
2.0a+0.5b+1.0d14.4白色，紧实，生长较慢
2.0a+1.0b+0.5d25.7黄白色，紧实，生长慢
2.0a+1.0b+1.0d20.2黄白色，紧实，生长慢
BM0.1b+0.5c40.6黄绿色、浅绿色，紧实，生长慢 1.0b+0.5c42.6浅绿色，致密，生长慢
2.0b+0.5c36.9黄绿色，致密，生长慢
0.1b+1.0c50.2绿色、黄绿色，疏松，生长快
1.0b+1.0c59.4绿色、黄绿色，疏松，生长快
2.0b+1.0c39.8黄绿色，致密，生长慢
0.1b+2.0c45.1浅绿色、黄绿色，致密，生长慢
1.0b+2.0c50.5绿色、黄绿色，疏松，生长快
2.0b+2.0c48.8浅绿色、黄绿色，致密，生长一般
1.0e55.6浅紫红色、浅绿色，致密，生长一般
1.5e84.2紫红色、绿色，疏松，生长较快
2.0e90.5紫红色、绿色，色泽明亮，松散，生长快
2.5e41.1浅紫红色、浅绿色，致密，生长慢
注：a，b，c，d，e依次代表2，4D，6BA，NAA，KT，TDZ。
2.2 基本培养基及激素组合、浓度对愈伤组织诱导的影响
2.2.1
基本培养基对愈伤组织诱导的影响。
基本培养基对愈伤组织诱导的影响见表2。由表2可知，MS培养基上的愈伤率为23.5%～59.8%，平均为40.0%，愈伤组织大多呈白色，生長速度一般;S培养基上的愈伤率为7.9%～25.7%，平均为15.3%，愈伤组织大多呈白色，生长速度慢，且更易褐化死亡;BM培养基上的愈伤率为36.9%～90.5%，平均为52.7%，愈伤组织呈绿色、黄绿色和紫红色，生长速度较快。由此可知，BM培养基适合于杂种落叶松成熟胚愈伤组织的诱导，MS培养基次之。
2.2.2
激素组合、浓度对愈伤组织诱导的影响。激素组合、浓度对愈伤组织诱导的影响见表2。由表2可知，MS培养基中主要包括2，4D+6BA与NAA+ 6BA 2种激素组合类型。当2，4D与6BA组合使用时，愈伤率为23.5%～59.8%，平均43.4%，以2.0 mg/L 2，4D+1.0 mg/L 6BA组合为最佳，愈伤组织呈白色或黄白色，质地疏松，生长速度一般（图1）;当添加激素为NAA与6BA组合时，愈伤率为26.7%～45.2%，平均34.9%，其中1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6BA组合为最佳，愈伤组织呈白色，紧实，生长速度较慢（图2）。
S培养基上，2，4D、6BA与KT 3种激素组合使用时，愈伤率为7.9%～25.7%，平均为15.3%，以2.0 mg/L 2，4D+1.0 mg/L 6BA+0.5 mg/L KT组合为最佳，愈伤组织呈白色或黄白色，紧实，生长速度慢且一段时间后褐化死亡（图3）。
BM培养基上有NAA+ 6BA与TDZ单独使用2个处理。当NAA与6BA组合使用时，愈伤率为36.9%～59.4%，平均46.0%，以1.0 mg/L NAA +1.0 mg/L 6BA组合为最佳，愈伤组织呈绿色、黄绿色，紧实，生长一般（图4）;当单独使用TDZ时，愈伤率为44.1%～90.5%，平均67.9%，以2.0 mg/L TDZ为最佳，愈伤组织呈紫红色、绿色、黄绿色，疏松或紧实，生长较快（图5）。
图1 在MS上添加2.0 mg/L 2，4D+1.0 mg/L 6BA生长的愈伤组织
图2 在MS上添加1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6BA生长的愈伤组织
图3 在S上添加2.0 mg/L 2，4D+1.0 mg/L6BA+0.5 mg/LKT生长的愈伤组织
图4 在BM上添加1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6BA生长的愈伤组织
图5 在BM上添加2.0 mg/L TDZ生长的愈伤组织
2.3 愈伤组织的量化与分析
愈伤组织的L、W、H及V随时间t变化结果见表3。L、W、H与t基本符合线性正相关，且增长率随t变化不明显（图6）。V与t在43 d之前基本呈线性正相关，且相关系数很小; 43 d后，V与t呈近指数关系，V随t的增加而增大较快（图7）。以BM+TDZ 2.0 mg/L上生长的愈伤组织作为统计对象，进行愈伤组织L、W、H及V的时序分析，使得对愈伤组织生长状况有一个量化的衡量标准。
对V与t进行回归拟合时，以V与t的立方关系为宜，拟合方程的F值为27.69，P值为0.001，Rsq（adi）值为99.5%，说明方程的拟合效果较好，且经验证，当t>40时，拟合方程较为准确（图8），拟合方程：
V=7.44+0.009t-0.101 1t2+0.003 49t3
表3 愈伤组织尺寸随时间变化
试验天数
dL均值
mmW均值
mmH均值
mmV均值
mm3
01.720.960.631.06
72.191.310.922.68
142.701.861.306.56
213.673.182.838.99
284.343.493.1112.73
354.924.123.8721.18
426.095.344.5139.51
498.377.056.19198.70
569.738.057.35311.89
6311.609.438.62507.54
7012.8810.349.57686.74
7714.4012.0910.681 002.56
图6 L，W，H的时间序列图 图7 V时间序列图
图8 V与t拟合线图
42卷32期 张 莉等 杂种落叶松愈伤组织诱导培养基的建立和优化
3 结论与讨论
组织培养过程中，获得无菌的外植体是植物组织培养取得成功的最基本前提。落叶松成熟种子多带有内生菌，消毒非常困难，对种子表面消毒不能完全杀死内生菌[3]。该试验以4%NaClO对去皮种子消毒处理15 min后，洗净，剥去胚乳再用0.5%次氯酸钠对胚消毒2 min，洗净，胚的污染率最低，存活率达到88.9%，与王伟达等[3]研究结果相近，其利用2%NaClO消毒50 min后挑出胚直接接种，污染率高达91.1%，对去皮种子进行消毒后，挑出胚放入0.5% NaClO中进行浸泡，在不降低胚存活率的情况下明显降低了污染率，胚存活率为78.8%，证明用低质量浓度的NaClO对胚进行浸泡处理的必要性。
愈伤组织诱导的最佳培养基为BM培养基，激素以2.0 mg/L TDZ单独作用时愈伤组织诱导率最高，为90.5%，愈伤组织呈紫红色、绿色，疏松或紧实，生长较快，该结论与激素促进作用的倒钟形曲线相符[4]，这为愈伤组织的分化、不定芽的发生奠定了基础，在MS培养基上，当2，4D与6BA组合使用时，以2.0 mg/L 2，4D+1.0 mg/L 6BA组合为最佳，当添加激素为NAA与 6BA组合时，愈伤率为26.7%～45.2%，平均34.9%，其中1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6BA组合为最佳，该结论符合在诱导愈伤组织时，生长素与细胞分裂素组合使用，当生长素浓度高于细胞分裂素浓度时，能提高愈伤率的规律[5];S培养基上，2，4D、6BA与KT 3种激
素组合使用时，愈伤率为7.9%～25.7%，平均
15.3%，表明
S培养基不适合于杂种落叶松成熟胚愈伤组织诱导，这与齐
力旺等[6]对华北落叶松未成熟胚愈伤组织诱导的结果不同;通过统计BM、S、MS 3种基本培养基上愈伤组织的诱导率、观察愈伤组织生长状况，表明高盐浓度的培养基可能促进愈伤组织数量及鲜重增加。
该研究通过对愈伤组织的L、W、H及V的时序分析，得到L、W、H、V与t正相关的结果，通过对线图的观察可以了解不同时间段的增长趋势。V与t的回归拟合，使得通过t来估算V成为可能，但目前由于跟踪测量的次数较少使得该拟合方程是否能够通过t来预测V还有待进一步研究。
影响愈伤组织发生的因素包括基因型、采集时间或者合子胚的发育阶段、培养基、植物生长调节物质、碳源的浓度、凝胶物质的浓度、肌醇等。尽管已有很多树种诱导出愈伤组织，但大多仍显示出相当低的有效愈伤诱导率，一般在0～10%。因此，诱导出大量的有效愈伤组织，使其保持旺盛的分化状态，是进行后续以愈伤组织为基础试验的重要环节[7]。
该试验以杂种落叶松成熟合子胚为材料，进行愈伤组织的诱导和增殖，尽管该试验在诱导、继代过程中都出现过褐化、死亡现象，但最终还是有部分生长旺盛且具胚性的愈伤组织能够长期继代增殖，这为愈伤组织的分化及不定芽的诱导提供了前提。
参考文献
[1]
孙晓梅，张守攻.日木落叶松纸浆材优良家系多性状联合选择[J].林业科学，2005，41（4）：48-54.
[2] 崔海涛，张玲敏.长白落叶松形态特征与生物学特性[J].现代农业科技，2012（7）：212.
[3] 王伟达，李成浩，张含国，等.长白落叶松愈伤组织诱导与不定芽分化[J].东北林业大学学报，2008，36（2）：6-7.
[4] ROBERTS D R，FLINN B S，WEBB D T，et al.Abscisic acid and indole3butyric acid regulation of maturation and accumulation of storage proteins in somatic embryos of interior spruce[J].Physiologia Plantarum，1990，78：355-360.
[5] KIM Y W，MOON H K.Enhancement of somatic embryogenesis and plant regeneration in Japanese larch[J].Plant Cell.Tissue Organ Culture，2007，88：241-245.
[6] 齊力旺.华北落叶松体细胞胚胎发生与遗传转化系统建立的研究[D].北京：中国林业科学院，2000.
[7] 赵晓敏.兴安落叶松胚性愈伤组织诱导研究[D].哈尔滨：东北林业大学，2007.
[目的] 建立一种高效稳定的杂种落叶松组织培养体系。[方法]以杂种落叶松成熟合子胚作为外植体材料，对其按照不同处理方式进行消毒，且以不同种类培养基和激素种类及浓度进行愈伤组织的诱导，测算愈伤组织的体积。[结果]将去皮种子用流水冲洗2 d，用70%乙醇消毒1 min转入4%NaClO消毒15 min后，再将剥出的胚放入0.5%NaClO消毒2 min胚存活率最高;在光照條件下，BM培养基中添加2.0 mg/L TDZ愈伤组织的诱导效果最好，愈伤组织的诱导率为90.5%;愈伤组织的L、W、H与t呈类线性关系，体积与时间呈类指数关系。[结论] 为落叶松稳定组织培养体系的构建和优化提供方法。
关键词 杂种落叶松; 成熟合子胚; 愈伤组织诱导; 愈伤组织体积
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）32-11243-04
The Culture Medium Establishment and Optimization for Callus Induction of Hybrid larch
ZHANG Li，ZHANG Lei*， FANG Jiaoyang et al
（Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding，Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）
Abstract [Objective] The aim was to establish a highly efficient and stable tissue culture system of Hybrid larch.[Method]Using mature zygotic embryos of Hybrid larch as explants material， different treatments for disinfection， and Callus induction were done in types of different medium and hormone ， and the volume of callus was measured. [Result]Statistical analysis results showed that： the peeled seed washed with water for 2448 h， 70% alcohol disinfection for 1min into 4%NaClO for 15 min and then stripping out the embryo into 0.5% NaClO disinfection for 2 min， survival rate of embryo was highest. ; In the light conditions， induced effect of cultured callus medium was best in BM by adding 2 mg/L TDZ， induction rate of the callus was 90.5%; callus long， width， thickness and time were linear relationship， was the exponential relationship between volume and time. [Conclusion] The study provided method for construction and optimization of stability and tissue culture system of Hybrid larch.
Key words Hybrid larch;Mature zygotic embryos;Callus induction;Volume of callus
落叶松是我国东北地区主要的针叶用材树种，在林业生产中占有重要地位[1]，具有分布面积广、适应性强、生长迅速、耐寒能力强等特点。杂种落叶松（Hybrid larch）是落叶松属中一个非常重要的速生树种，其遗传增益大，具有树干通直、圆满，木材坚硬、耐腐蚀等特点，是铁路、桥梁、造船、电业等方面的优良用材[2]。但由于落叶松生长周期长，采用常规育种进行新品种选育时，耗时长、见效慢，且某些优良性状在繁殖过程中无法控制，子代遗传的效果差，同时还存在基因资源缺乏和杂交不亲和等制约因素，落叶松组织培养不可控因素较多，且不同种落叶松无性繁殖差异性较大，所以需要建立一种高效稳定的组织培养体系，而其中愈伤组织的诱导是组织培养过程的第一步，也是比较重要的一步，通过稳定的愈伤组织诱导培养基的建立和优化，可以为落叶松稳定组织培养体系的构建和优化提供方法，也为无性系的繁殖、落叶松遗传改良及转基因育种奠定坚实的基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为2013年采自黑龙江省牡丹江市林口县青山种子园的成熟种子。
1.2 试验方法
1.2.1
外植体的消毒。选择成熟、饱满的杂种落叶松种子，剥去种皮后，流水冲洗24～48 h。先使用70%的乙醇消毒1 min后，分别在4%NaClO消毒10、15、20 min，30% H2O2消毒15、20、30 min，或者0.1% HgCl2消毒6、8、10 min（HgCl2消毒时间过长时将胚杀死），然后无菌水洗净，剥去胚乳，将胚用0.5% NaClO消毒2 min，无菌水洗净并用灭菌滤纸吸干水分，接种到培养基上，7 d后统计存活率（即非感染菌）。 1.2.2
基本培养基及激素组合、浓度的筛选。
以MS、S和BM为基本培养基，添加蔗糖30 g/L，琼脂6.5 g/L ，肌醇1 g/L ，L谷氨酰胺（LGln）450 mg/L，水解酪蛋白（CH） 500 mg/L，调节pH为5.8～6.0，MS、S置暗培养，BM光培养（暗培养效果差），按设计的激素组合及浓度（表2）分别添加至基本培养基中，置于23～25 ℃培养，观察愈伤组织形态及生长状况并统计愈伤率。
1.2.3
愈伤组织的长、宽、厚的测量及体积的计算。
在BM培养基，TDZ 2.0 mg/L的条件下，统计L、W、H。将接种日期记为第1天，每隔7 d用游标卡尺测量L、W、H，测12次，计算体积（mm3）。其中，1～ 3次按长方体计算体积V长，4～7次按圆锥体计算V锥，8～12次按球体计算V球，并对所得数据进行统计分析。V的计算公式如下：
V长=L*W*H
V锥=（1/48）*3.14* L*（W+H）2
V球=（1/162）*3.14*（L+W+H）3
1.3 数据统计及分析
数据统计时以试验中每一培养皿作基本单元分别统计，然后按处理方式的不同进行分类，求得平均值、标准差等，根据数据的情况进行方差分析、多重比較、时序分析等。
2 结果与分析
2.1 不同消毒处理的分析
NaClO、H2O2、HgCl2不同消毒时间对胚存活率的影响见表1。由表1可知，9种不同处理方式中，以NaClO（4%）消毒15 min及HgCl2（0.1%）消毒10 min为佳，未染菌胚的存活率分别为88.9%和83.6%，标准差s分别为0.130 5和0.320 2。由于HgCl2的毒性较强并易污染环境，因此9种处理方式中以NaClO（4%）消毒15 min最佳。按灭菌剂的种类不同，得到的存活率依次为68.0%、49.0%和48.1%，标准差s依次为0.241 7、0.250 7和0.380 1。由此可知，NaClO的消毒效果显著优于H2O2和HgCl2。
表1 NaClO、H2O2、HgCl2不同消毒时间对胚存活率的影响
灭菌剂
种类浓度
%处理时
间∥min外植体
总数∥个胚存活
数∥个胚存活
率∥%胚整体存
活率∥%
NaClO410563562.4 abc68.0 a
15807088.9 a
20643148.5 cd
H2O23015724359.3 bc49.0 b
20482859.0 bcd
30702231.4 de
HgCl20.1660813.3 e48.1 b
8643250.0 cd
10564783.6 ab
注：多重比较采用Duncan法，同列不同字母表示在0.05水平上差异显著。
表2 培养基和激素组合对愈伤组织诱导的影响
培养基激素组合及
浓度∥mg/L愈伤率
%愈伤组织的生长情况
MS0.5a+0.05b23.5白色，紧实，含水量大，生长慢
0.5a+0.5b31.4白色，紧实，生长较慢
0.5a+1.0b42.7白色、乳白色，疏松，生长一般
1.0a+0.05b44.3白色、乳白色，疏松，生长一般
1.0a+0.5b47.6黄白色、黄绿色，疏松，生长快
1.0a+1.0b40.9白色，疏松，生长一般
2.0a+0.05b48.1黄白色、黄绿色，疏松，生长快
2.0a+0.5b52.5黄白色、黄绿色，疏松，生长较快
2.0a+1.0b59.8黄白色、黄绿色，疏松，生长较快
0.05b+0.5c26.7白色，紧实，含水量大，生长慢
0.5b+0.5c32.8白色，紧实，生长慢
0.05b+1.0c39.5白色，紧实，生长一般
0.5b+1.0c45.2白色、乳白色，疏松，生长快
0.05b+2.0c33.1白色，紧实，生长慢
0.5b+2.0c31.9白色，紧实，生长慢
S0.5a+0.5b+0.5d17.6白色、黄白色，质地硬，致密，生长慢
0.5a+0.5b+1.0d10.3含水量大，后期逐渐褐化死亡
0.5a+1.0b+0.5d15.8白色、黄白色，质地硬，致密，生长慢
0.5a+1.0b+1.0d12.4白色，紧实，生长较慢
1.0a+0.5b+0.5d14.2白色，紧实，生长较慢
1.0a+0.5b+1.0d7.9含水量大，后期逐渐褐化死亡
1.0a+1.0b+0.5d16.8白色、黄白色，质地硬，致密，生长慢
1.0a+1.0b+1.0d9.8含水量大，后期逐渐褐化死亡
2.0a+0.5b+0.5d18.3白色、黄白色，质地硬，致密，生长慢
2.0a+0.5b+1.0d14.4白色，紧实，生长较慢
2.0a+1.0b+0.5d25.7黄白色，紧实，生长慢
2.0a+1.0b+1.0d20.2黄白色，紧实，生长慢
BM0.1b+0.5c40.6黄绿色、浅绿色，紧实，生长慢 1.0b+0.5c42.6浅绿色，致密，生长慢
2.0b+0.5c36.9黄绿色，致密，生长慢
0.1b+1.0c50.2绿色、黄绿色，疏松，生长快
1.0b+1.0c59.4绿色、黄绿色，疏松，生长快
2.0b+1.0c39.8黄绿色，致密，生长慢
0.1b+2.0c45.1浅绿色、黄绿色，致密，生长慢
1.0b+2.0c50.5绿色、黄绿色，疏松，生长快
2.0b+2.0c48.8浅绿色、黄绿色，致密，生长一般
1.0e55.6浅紫红色、浅绿色，致密，生长一般
1.5e84.2紫红色、绿色，疏松，生长较快
2.0e90.5紫红色、绿色，色泽明亮，松散，生长快
2.5e41.1浅紫红色、浅绿色，致密，生长慢
注：a，b，c，d，e依次代表2，4D，6BA，NAA，KT，TDZ。
2.2 基本培养基及激素组合、浓度对愈伤组织诱导的影响
2.2.1
基本培养基对愈伤组织诱导的影响。
基本培养基对愈伤组织诱导的影响见表2。由表2可知，MS培养基上的愈伤率为23.5%～59.8%，平均为40.0%，愈伤组织大多呈白色，生長速度一般;S培养基上的愈伤率为7.9%～25.7%，平均为15.3%，愈伤组织大多呈白色，生长速度慢，且更易褐化死亡;BM培养基上的愈伤率为36.9%～90.5%，平均为52.7%，愈伤组织呈绿色、黄绿色和紫红色，生长速度较快。由此可知，BM培养基适合于杂种落叶松成熟胚愈伤组织的诱导，MS培养基次之。
2.2.2
激素组合、浓度对愈伤组织诱导的影响。激素组合、浓度对愈伤组织诱导的影响见表2。由表2可知，MS培养基中主要包括2，4D+6BA与NAA+ 6BA 2种激素组合类型。当2，4D与6BA组合使用时，愈伤率为23.5%～59.8%，平均43.4%，以2.0 mg/L 2，4D+1.0 mg/L 6BA组合为最佳，愈伤组织呈白色或黄白色，质地疏松，生长速度一般（图1）;当添加激素为NAA与6BA组合时，愈伤率为26.7%～45.2%，平均34.9%，其中1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6BA组合为最佳，愈伤组织呈白色，紧实，生长速度较慢（图2）。
S培养基上，2，4D、6BA与KT 3种激素组合使用时，愈伤率为7.9%～25.7%，平均为15.3%，以2.0 mg/L 2，4D+1.0 mg/L 6BA+0.5 mg/L KT组合为最佳，愈伤组织呈白色或黄白色，紧实，生长速度慢且一段时间后褐化死亡（图3）。
BM培养基上有NAA+ 6BA与TDZ单独使用2个处理。当NAA与6BA组合使用时，愈伤率为36.9%～59.4%，平均46.0%，以1.0 mg/L NAA +1.0 mg/L 6BA组合为最佳，愈伤组织呈绿色、黄绿色，紧实，生长一般（图4）;当单独使用TDZ时，愈伤率为44.1%～90.5%，平均67.9%，以2.0 mg/L TDZ为最佳，愈伤组织呈紫红色、绿色、黄绿色，疏松或紧实，生长较快（图5）。
图1 在MS上添加2.0 mg/L 2，4D+1.0 mg/L 6BA生长的愈伤组织
图2 在MS上添加1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6BA生长的愈伤组织
图3 在S上添加2.0 mg/L 2，4D+1.0 mg/L6BA+0.5 mg/LKT生长的愈伤组织
图4 在BM上添加1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6BA生长的愈伤组织
图5 在BM上添加2.0 mg/L TDZ生长的愈伤组织
2.3 愈伤组织的量化与分析
愈伤组织的L、W、H及V随时间t变化结果见表3。L、W、H与t基本符合线性正相关，且增长率随t变化不明显（图6）。V与t在43 d之前基本呈线性正相关，且相关系数很小; 43 d后，V与t呈近指数关系，V随t的增加而增大较快（图7）。以BM+TDZ 2.0 mg/L上生长的愈伤组织作为统计对象，进行愈伤组织L、W、H及V的时序分析，使得对愈伤组织生长状况有一个量化的衡量标准。
对V与t进行回归拟合时，以V与t的立方关系为宜，拟合方程的F值为27.69，P值为0.001，Rsq（adi）值为99.5%，说明方程的拟合效果较好，且经验证，当t>40时，拟合方程较为准确（图8），拟合方程：
V=7.44+0.009t-0.101 1t2+0.003 49t3
表3 愈伤组织尺寸随时间变化
试验天数
dL均值
mmW均值
mmH均值
mmV均值
mm3
01.720.960.631.06
72.191.310.922.68
142.701.861.306.56
213.673.182.838.99
284.343.493.1112.73
354.924.123.8721.18
426.095.344.5139.51
498.377.056.19198.70
569.738.057.35311.89
6311.609.438.62507.54
7012.8810.349.57686.74
7714.4012.0910.681 002.56
图6 L，W，H的时间序列图 图7 V时间序列图
图8 V与t拟合线图
42卷32期 张 莉等 杂种落叶松愈伤组织诱导培养基的建立和优化
3 结论与讨论
组织培养过程中，获得无菌的外植体是植物组织培养取得成功的最基本前提。落叶松成熟种子多带有内生菌，消毒非常困难，对种子表面消毒不能完全杀死内生菌[3]。该试验以4%NaClO对去皮种子消毒处理15 min后，洗净，剥去胚乳再用0.5%次氯酸钠对胚消毒2 min，洗净，胚的污染率最低，存活率达到88.9%，与王伟达等[3]研究结果相近，其利用2%NaClO消毒50 min后挑出胚直接接种，污染率高达91.1%，对去皮种子进行消毒后，挑出胚放入0.5% NaClO中进行浸泡，在不降低胚存活率的情况下明显降低了污染率，胚存活率为78.8%，证明用低质量浓度的NaClO对胚进行浸泡处理的必要性。
愈伤组织诱导的最佳培养基为BM培养基，激素以2.0 mg/L TDZ单独作用时愈伤组织诱导率最高，为90.5%，愈伤组织呈紫红色、绿色，疏松或紧实，生长较快，该结论与激素促进作用的倒钟形曲线相符[4]，这为愈伤组织的分化、不定芽的发生奠定了基础，在MS培养基上，当2，4D与6BA组合使用时，以2.0 mg/L 2，4D+1.0 mg/L 6BA组合为最佳，当添加激素为NAA与 6BA组合时，愈伤率为26.7%～45.2%，平均34.9%，其中1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6BA组合为最佳，该结论符合在诱导愈伤组织时，生长素与细胞分裂素组合使用，当生长素浓度高于细胞分裂素浓度时，能提高愈伤率的规律[5];S培养基上，2，4D、6BA与KT 3种激
素组合使用时，愈伤率为7.9%～25.7%，平均
15.3%，表明
S培养基不适合于杂种落叶松成熟胚愈伤组织诱导，这与齐
力旺等[6]对华北落叶松未成熟胚愈伤组织诱导的结果不同;通过统计BM、S、MS 3种基本培养基上愈伤组织的诱导率、观察愈伤组织生长状况，表明高盐浓度的培养基可能促进愈伤组织数量及鲜重增加。
该研究通过对愈伤组织的L、W、H及V的时序分析，得到L、W、H、V与t正相关的结果，通过对线图的观察可以了解不同时间段的增长趋势。V与t的回归拟合，使得通过t来估算V成为可能，但目前由于跟踪测量的次数较少使得该拟合方程是否能够通过t来预测V还有待进一步研究。
影响愈伤组织发生的因素包括基因型、采集时间或者合子胚的发育阶段、培养基、植物生长调节物质、碳源的浓度、凝胶物质的浓度、肌醇等。尽管已有很多树种诱导出愈伤组织，但大多仍显示出相当低的有效愈伤诱导率，一般在0～10%。因此，诱导出大量的有效愈伤组织，使其保持旺盛的分化状态，是进行后续以愈伤组织为基础试验的重要环节[7]。
该试验以杂种落叶松成熟合子胚为材料，进行愈伤组织的诱导和增殖，尽管该试验在诱导、继代过程中都出现过褐化、死亡现象，但最终还是有部分生长旺盛且具胚性的愈伤组织能够长期继代增殖，这为愈伤组织的分化及不定芽的诱导提供了前提。
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