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摘要： 应用PCR技术对羊种布鲁氏菌NN1202和LA1105株的[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因进行扩增、克隆和测序。测序结果显示，NN1202和LA1105株的[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因在布鲁氏菌种间高度保守。应用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法分析OMP25和OMP31蛋白的α-螺旋、β-折叠、转角区域和卷曲区域；应用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法分析蛋白的氨基酸亲水性、蛋白柔性区域、溶剂表面可及性和抗原指数。对各方法的结果综合分析，OMP25蛋白的27～34、59～65、69～75、101～107、148～154、182～189、197～202区域以及OMP31蛋白的25～32、50～58、63～70、102～111、125～130、166～173、176～183区域可能是优势B细胞抗原表位。
关键词： 布鲁氏菌；OMP25；OMP31；抗原表位
中图分类号： S858.26 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）08-0038-04
布鲁氏菌是一种感染人、家畜、野生动物等60多种动物的人兽共患病原菌，根据宿主和致病性的差异，分为羊种布鲁氏菌（Brucella melitensis）、牛种布鲁氏菌（B. abortus）、猪种布鲁氏菌（B.suis）、绵羊附睾种布鲁氏菌（B. ovis）、犬种布鲁氏菌（B. canis）和沙林鼠种布鲁氏菌（B. neotomae）6个种；此外，还从海洋动物中分离到在致病性和分子特征上有别于前6种的海豚布鲁氏菌（B. cetacease）和海豹布鲁氏菌（B. pinnipediae） [1]。在这8种布鲁氏菌中，以羊种布鲁氏菌对人的致病性最强。布鲁氏菌的外膜由外膜蛋白、脂多糖和磷脂层构成。外膜蛋白为一类与毒力密切相关的免疫原性蛋白 [2-3]，其中，分子量分别为25 ku（OMP25）和31 ku（OMP31）的2种外膜蛋白是布鲁氏菌的主要外膜蛋白 [4-5]。OMP25蛋白和OPM31蛋白免疫小鼠后，能分别诱导产生IgG2a 和IgG1类型的抗体，是一种抗原免疫保护蛋白 [6-7]。Bowden等证实OMP31的单克隆抗体与其诱导产生的抗体存在竞争抑制现象，表明OMP31存在抗原表位 [8]。本研究拟对广西分离的2株羊种布鲁氏菌NN1202、LA1105菌株的[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因进行克隆、测序，运用生物信息学技术对二者的B细胞抗原表位进行分析，为后续的合成肽疫苗研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 羊种布鲁氏菌NN1202和LA1105菌株由广西兽医研究所细菌研究室分离、鉴定和保存 [9]。羊种布氏菌5号疫苗为PCR扩增阳性对照菌株。
1.1.2 试剂 布氏琼脂粉购自英国Oxiod公司；马血清购自美国Thermo公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒及PCR反应所用试剂购自北京康为世纪生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1OMP25和OMP31 基因的PCR扩增和克隆 取保存的羊种布鲁氏菌NN1202株和LA1105株冻干菌种，每支菌种加入0.2 mL无菌水溶解，接种棒蘸取菌液接种于含10%马血清布氏琼脂斜面培养基，置于37 ℃的CO2培养箱培养 72 h。用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA，以细菌DNA为模板对[WTBX][WTBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因进行PCR扩增。以羊种布氏菌5号疫苗为阳性对照。PCR反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，60 ℃（57 ℃） 1 min，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 10 min。扩增预期片段分别为650 bp和750 bp。引物序列分别为PM25-F：5′-GAATTCATGCGCACTCTTAAGTCTCTC-3′；OPM25-R：5′-GTCGACTTAGAACTTGTAGCCGATGCC-3′；OPM31 -F：5′-GCGAATTCATGAAGTCCGTAATT-3′；OPM31-R：5′-GCCTCGAGTTAGAACTTGTAGTT-3。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
DNA胶回收试剂盒纯化、回收目的片段后，与pMD-18T载体4 ℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α，PCR鉴定正确的阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司测序。
1.2.2 OMP25和OMP31基因的核苷酸同源性分析 应用MegAlign软件对测序获得的OMP25和OMP31基因的核苷酸序列与GenBank上登录的已知序列进行同源性比较，分析它们之间的亲缘关系。
1.2.3 OMP25蛋白和OMP31蛋白二级结构分析 运用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法分析OMP25蛋白和OMP31蛋白的α-螺旋、β-折叠、转角区域和卷曲区域 [10-11]。
1.2.4 OMP25蛋白和OMP31蛋白B细胞抗原表位分析 应用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法分析OMP25蛋白和OMP31蛋白的氨基酸亲水性、蛋白柔性区域、溶剂表面可及性和抗原指数，综合各方法的结果并结合B细胞表位网上预测（http：//www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/）来分析OMP25蛋白和OMP31蛋白的B细胞抗原表位 [12-15]。
2 结果与分析
2.1OMP25和OMP31基因的PCR扩增 提取羊种布鲁氏菌NN1202株和LA1105株的DNA，分别对OMP25和OMP31 [STBZ]基因进行PCR扩增，得到650 bp和750 bp的扩增片段，大小与阳性对照羊种布鲁氏菌5号疫苗的扩增结果一致（图1）。
2.2 OMP25和OMP31 基因的核苷酸同源性分析
NN1202株和LA1105株的阳性OMP25质粒测序后证实扩增片段大小为650 bp，内含1个642 bp的开放阅读框，编码213个氨基酸，它们的核苷酸序列已登录GenBank，登录号分别为KJ720202和KJ720201。将它们的核苷酸序列与GenBank登录的相应序列进行同源性比较，NN1202株和LA1105株OMP25之间的同源性为100%，与羊种布鲁氏菌M5-90（CP001852）、猪种布鲁氏菌S2（CP006961）、牛种布鲁氏菌S19（CP000887）、犬种布鲁氏菌ATCC23365（CP000872）、绵羊附睾种ATCC25840（CP000708）的同源性均为100%。
NN1202株和LA1105株的阳性OMP31 质粒测序后证实扩增片段大小为750 bp，内含1个723 bp的开放阅读框，编码240个氨基酸，它们的核苷酸序列已登录GenBank，登录号分别为KJ720203和KJ720204。将它们的核苷酸序列与GenBank登录的相应序列进行同源性比较，NN1202株、LA1105株和羊种布鲁氏菌M5-90（CP001852）[OMP25 之间的同源性均为100%；与猪种布鲁氏菌S2（CP006961）、犬种布鲁氏菌ATCC23365（CP000872）、绵羊附睾种ATCC25840（CP000708）的同源性为99%。
2.3 OMP25蛋白和OMP31蛋白二级结构分析
综合Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法的分析，OMP25蛋白有4个α-螺旋区域（13～29、75～79、100～104、109～114），9个β-折叠区域（6～10、49～55、62～67、86～91、130～144、154～159、173～181、190～196、204～207）。在α-螺旋和β-折叠区域的间隙分布着长短不一的13个转角区域和11个卷曲区域（图2）。OMP31蛋白有4个α-螺旋区域（4～21、121～134、144～145、172～176），9个β-折叠区域（22～25、75～77、82～88、97～102、112～115、135～139、147～152、156～163、230～240）。在α-螺旋和β-折叠区域的间隙分布着长短不一的17个转角区域和12个卷曲区域（图3）。
2.4 OMP25蛋白和OMP31蛋白的氨基酸亲水性分析
Kyte-Doolittle方法分析表明，OMP25蛋白有较多的亲水[CM（25]性区域（≥0.5），分布较为均匀，主要有27～32、44～46、
2.5 OMP25蛋白和OMP31蛋白的柔性区域分析
2.6 OMP25蛋白和OMP31蛋白的溶剂表面可及性分析
Emini方法分析表明，59～63、70～75、101～107、177～189和196～202区域出现在OMP25蛋白溶剂表面可及性较大（≥1）（图8）。OMP31蛋白的溶剂表面可及性区域较少，只有2个区域（63～69和177～182）（图9）。
2.7 OMP25蛋白和OMP31蛋白的抗原指数分析
Jameson-Wolf方法分析表明，OMP25蛋白抗原指数较高的区域（≥0）有：26～33、56～65、68～75、93～99、101～105、117～127、143～156、165～179、183～190、195～207，以C端区域的抗原指数较高，跨度较大，存在抗原表位的可能性也较大（图10）。OMP31蛋白抗原指数较高的区域（≥0）分布较均匀，以23～33、51～75、102～111、118～130、136～147、167～173、177～184和206～227区域存在抗原表位的可能性较大（图11）。
2.8 OMP25蛋白和OMP31蛋白B细胞表位综合分析
应用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法并结合B细胞表位网上预测分析（http：//www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/），OMP25蛋白的27～34、59～65、69～75、101～107、148～154、182～189、197～202[CM（21*2/3]区域以及OMP31蛋白的25～32、50～58、63～70、
102～111、125～130、166～173、176～183区域均具有较好的亲水性、柔性和溶剂表面可及性，抗原指数也较高，结合蛋白二级结构上含有容易形成抗原表位的转角和卷曲区域，因此，这些区域极有可能是OMP25蛋白和OMP31蛋白的优势B细胞抗原表位。
3 讨论
研究证实，布鲁氏菌[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 基因是免疫原性基因，它们编码的蛋白对小鼠具有免疫保护作用 [6-7]。本研究对羊种NN1202株和LA1105株[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 基因核苷酸同源性比较结果表明，[OMP25和OMP31 基因在布鲁氏菌种间高度保守，OMP25和OMP31蛋白可以作为布鲁氏菌合成肽疫苗的候选靶蛋白。
利用生物信息学技术对病原微生物的抗原蛋白二级结构和B细胞抗原表位进行分析是研制合成肽疫苗的基础 [16]。研究表明，B细胞抗原表位的形成取决于蛋白二级结构的形成。蛋白在形成立体构象时，多肽链中的α-螺旋和β-折叠的氢键键能高，形成稳定的刚性结构，在蛋白内部中起着“骨架”作用，不易与抗体结合，成为B细胞抗原表位的几率低。相反，转角和卷曲区域的氢键键能低，形成盘旋、扭曲等松散的柔性结构暴露在蛋白表面，与抗体结合的几率大，成为B细胞抗原表位的可能性高 [17]。此外，氨基酸的亲水性、极性也决定了其是否暴露在蛋白表面，因此，蛋白的亲水部位和溶剂表面可及性也与B细胞抗原表位有密切关系。 B细胞抗原表位的分析方法主要有蛋白二级结构分析、氨基酸亲水性分析、蛋白柔性区域分析、溶剂表面可及性分析 [10-14]。Jamson等将上述4种方法综合，以蛋白二级结构分析占40%、氨基酸亲水性分析占30%、蛋白柔性区域分析占15%、溶剂表面可及性分析占15%的计算模式，提出一种抗原指数分析法 [15]。根据该方法分析，发现OMP25蛋白的26～33、56～65、68～75、93～99、101～105、117～127、143～156、165～179、183～190、195～207区域以及OMP31蛋白的23～33、51～75、102～111、118～130、136～147、167～173、177～184和206～227区域存在抗原表位的可能性较大，但由于蛋白在形成立体构象时，蛋白表面的氨基酸会遮盖一些抗原指数较高的区域，使其不能成为优势抗原表位，因此，根据综合分析，笔者选择OMP25蛋白的27～34、59～65、69～75、101～107、148～154、182～189、197～202区域以及OMP31蛋白的25～32、50～58、63～70、102～111、125～130、166～173、176～183区域作为后续合成肽疫苗研究的靶位点。
参考文献：
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[17]来鲁华. 蛋白质的结构预测与分子设计[M].
关键词： 布鲁氏菌；OMP25；OMP31；抗原表位
中图分类号： S858.26 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）08-0038-04
布鲁氏菌是一种感染人、家畜、野生动物等60多种动物的人兽共患病原菌，根据宿主和致病性的差异，分为羊种布鲁氏菌（Brucella melitensis）、牛种布鲁氏菌（B. abortus）、猪种布鲁氏菌（B.suis）、绵羊附睾种布鲁氏菌（B. ovis）、犬种布鲁氏菌（B. canis）和沙林鼠种布鲁氏菌（B. neotomae）6个种；此外，还从海洋动物中分离到在致病性和分子特征上有别于前6种的海豚布鲁氏菌（B. cetacease）和海豹布鲁氏菌（B. pinnipediae） [1]。在这8种布鲁氏菌中，以羊种布鲁氏菌对人的致病性最强。布鲁氏菌的外膜由外膜蛋白、脂多糖和磷脂层构成。外膜蛋白为一类与毒力密切相关的免疫原性蛋白 [2-3]，其中，分子量分别为25 ku（OMP25）和31 ku（OMP31）的2种外膜蛋白是布鲁氏菌的主要外膜蛋白 [4-5]。OMP25蛋白和OPM31蛋白免疫小鼠后，能分别诱导产生IgG2a 和IgG1类型的抗体，是一种抗原免疫保护蛋白 [6-7]。Bowden等证实OMP31的单克隆抗体与其诱导产生的抗体存在竞争抑制现象，表明OMP31存在抗原表位 [8]。本研究拟对广西分离的2株羊种布鲁氏菌NN1202、LA1105菌株的[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因进行克隆、测序，运用生物信息学技术对二者的B细胞抗原表位进行分析，为后续的合成肽疫苗研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 羊种布鲁氏菌NN1202和LA1105菌株由广西兽医研究所细菌研究室分离、鉴定和保存 [9]。羊种布氏菌5号疫苗为PCR扩增阳性对照菌株。
1.1.2 试剂 布氏琼脂粉购自英国Oxiod公司；马血清购自美国Thermo公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒及PCR反应所用试剂购自北京康为世纪生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1OMP25和OMP31 基因的PCR扩增和克隆 取保存的羊种布鲁氏菌NN1202株和LA1105株冻干菌种，每支菌种加入0.2 mL无菌水溶解，接种棒蘸取菌液接种于含10%马血清布氏琼脂斜面培养基，置于37 ℃的CO2培养箱培养 72 h。用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA，以细菌DNA为模板对[WTBX][WTBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因进行PCR扩增。以羊种布氏菌5号疫苗为阳性对照。PCR反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，60 ℃（57 ℃） 1 min，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 10 min。扩增预期片段分别为650 bp和750 bp。引物序列分别为PM25-F：5′-GAATTCATGCGCACTCTTAAGTCTCTC-3′；OPM25-R：5′-GTCGACTTAGAACTTGTAGCCGATGCC-3′；OPM31 -F：5′-GCGAATTCATGAAGTCCGTAATT-3′；OPM31-R：5′-GCCTCGAGTTAGAACTTGTAGTT-3。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
DNA胶回收试剂盒纯化、回收目的片段后，与pMD-18T载体4 ℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α，PCR鉴定正确的阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司测序。
1.2.2 OMP25和OMP31基因的核苷酸同源性分析 应用MegAlign软件对测序获得的OMP25和OMP31基因的核苷酸序列与GenBank上登录的已知序列进行同源性比较，分析它们之间的亲缘关系。
1.2.3 OMP25蛋白和OMP31蛋白二级结构分析 运用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法分析OMP25蛋白和OMP31蛋白的α-螺旋、β-折叠、转角区域和卷曲区域 [10-11]。
1.2.4 OMP25蛋白和OMP31蛋白B细胞抗原表位分析 应用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法分析OMP25蛋白和OMP31蛋白的氨基酸亲水性、蛋白柔性区域、溶剂表面可及性和抗原指数，综合各方法的结果并结合B细胞表位网上预测（http：//www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/）来分析OMP25蛋白和OMP31蛋白的B细胞抗原表位 [12-15]。
2 结果与分析
2.1OMP25和OMP31基因的PCR扩增 提取羊种布鲁氏菌NN1202株和LA1105株的DNA，分别对OMP25和OMP31 [STBZ]基因进行PCR扩增，得到650 bp和750 bp的扩增片段，大小与阳性对照羊种布鲁氏菌5号疫苗的扩增结果一致（图1）。
2.2 OMP25和OMP31 基因的核苷酸同源性分析
NN1202株和LA1105株的阳性OMP25质粒测序后证实扩增片段大小为650 bp，内含1个642 bp的开放阅读框，编码213个氨基酸，它们的核苷酸序列已登录GenBank，登录号分别为KJ720202和KJ720201。将它们的核苷酸序列与GenBank登录的相应序列进行同源性比较，NN1202株和LA1105株OMP25之间的同源性为100%，与羊种布鲁氏菌M5-90（CP001852）、猪种布鲁氏菌S2（CP006961）、牛种布鲁氏菌S19（CP000887）、犬种布鲁氏菌ATCC23365（CP000872）、绵羊附睾种ATCC25840（CP000708）的同源性均为100%。
NN1202株和LA1105株的阳性OMP31 质粒测序后证实扩增片段大小为750 bp，内含1个723 bp的开放阅读框，编码240个氨基酸，它们的核苷酸序列已登录GenBank，登录号分别为KJ720203和KJ720204。将它们的核苷酸序列与GenBank登录的相应序列进行同源性比较，NN1202株、LA1105株和羊种布鲁氏菌M5-90（CP001852）[OMP25 之间的同源性均为100%；与猪种布鲁氏菌S2（CP006961）、犬种布鲁氏菌ATCC23365（CP000872）、绵羊附睾种ATCC25840（CP000708）的同源性为99%。
2.3 OMP25蛋白和OMP31蛋白二级结构分析
综合Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法的分析，OMP25蛋白有4个α-螺旋区域（13～29、75～79、100～104、109～114），9个β-折叠区域（6～10、49～55、62～67、86～91、130～144、154～159、173～181、190～196、204～207）。在α-螺旋和β-折叠区域的间隙分布着长短不一的13个转角区域和11个卷曲区域（图2）。OMP31蛋白有4个α-螺旋区域（4～21、121～134、144～145、172～176），9个β-折叠区域（22～25、75～77、82～88、97～102、112～115、135～139、147～152、156～163、230～240）。在α-螺旋和β-折叠区域的间隙分布着长短不一的17个转角区域和12个卷曲区域（图3）。
2.4 OMP25蛋白和OMP31蛋白的氨基酸亲水性分析
Kyte-Doolittle方法分析表明，OMP25蛋白有较多的亲水[CM（25]性区域（≥0.5），分布较为均匀，主要有27～32、44～46、
2.5 OMP25蛋白和OMP31蛋白的柔性区域分析
2.6 OMP25蛋白和OMP31蛋白的溶剂表面可及性分析
Emini方法分析表明，59～63、70～75、101～107、177～189和196～202区域出现在OMP25蛋白溶剂表面可及性较大（≥1）（图8）。OMP31蛋白的溶剂表面可及性区域较少，只有2个区域（63～69和177～182）（图9）。
2.7 OMP25蛋白和OMP31蛋白的抗原指数分析
Jameson-Wolf方法分析表明，OMP25蛋白抗原指数较高的区域（≥0）有：26～33、56～65、68～75、93～99、101～105、117～127、143～156、165～179、183～190、195～207，以C端区域的抗原指数较高，跨度较大，存在抗原表位的可能性也较大（图10）。OMP31蛋白抗原指数较高的区域（≥0）分布较均匀，以23～33、51～75、102～111、118～130、136～147、167～173、177～184和206～227区域存在抗原表位的可能性较大（图11）。
2.8 OMP25蛋白和OMP31蛋白B细胞表位综合分析
应用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法并结合B细胞表位网上预测分析（http：//www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/），OMP25蛋白的27～34、59～65、69～75、101～107、148～154、182～189、197～202[CM（21*2/3]区域以及OMP31蛋白的25～32、50～58、63～70、
102～111、125～130、166～173、176～183区域均具有较好的亲水性、柔性和溶剂表面可及性，抗原指数也较高，结合蛋白二级结构上含有容易形成抗原表位的转角和卷曲区域，因此，这些区域极有可能是OMP25蛋白和OMP31蛋白的优势B细胞抗原表位。
3 讨论
研究证实，布鲁氏菌[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 基因是免疫原性基因，它们编码的蛋白对小鼠具有免疫保护作用 [6-7]。本研究对羊种NN1202株和LA1105株[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 基因核苷酸同源性比较结果表明，[OMP25和OMP31 基因在布鲁氏菌种间高度保守，OMP25和OMP31蛋白可以作为布鲁氏菌合成肽疫苗的候选靶蛋白。
利用生物信息学技术对病原微生物的抗原蛋白二级结构和B细胞抗原表位进行分析是研制合成肽疫苗的基础 [16]。研究表明，B细胞抗原表位的形成取决于蛋白二级结构的形成。蛋白在形成立体构象时，多肽链中的α-螺旋和β-折叠的氢键键能高，形成稳定的刚性结构，在蛋白内部中起着“骨架”作用，不易与抗体结合，成为B细胞抗原表位的几率低。相反，转角和卷曲区域的氢键键能低，形成盘旋、扭曲等松散的柔性结构暴露在蛋白表面，与抗体结合的几率大，成为B细胞抗原表位的可能性高 [17]。此外，氨基酸的亲水性、极性也决定了其是否暴露在蛋白表面，因此，蛋白的亲水部位和溶剂表面可及性也与B细胞抗原表位有密切关系。 B细胞抗原表位的分析方法主要有蛋白二级结构分析、氨基酸亲水性分析、蛋白柔性区域分析、溶剂表面可及性分析 [10-14]。Jamson等将上述4种方法综合，以蛋白二级结构分析占40%、氨基酸亲水性分析占30%、蛋白柔性区域分析占15%、溶剂表面可及性分析占15%的计算模式，提出一种抗原指数分析法 [15]。根据该方法分析，发现OMP25蛋白的26～33、56～65、68～75、93～99、101～105、117～127、143～156、165～179、183～190、195～207区域以及OMP31蛋白的23～33、51～75、102～111、118～130、136～147、167～173、177～184和206～227区域存在抗原表位的可能性较大，但由于蛋白在形成立体构象时，蛋白表面的氨基酸会遮盖一些抗原指数较高的区域，使其不能成为优势抗原表位，因此，根据综合分析，笔者选择OMP25蛋白的27～34、59～65、69～75、101～107、148～154、182～189、197～202区域以及OMP31蛋白的25～32、50～58、63～70、102～111、125～130、166～173、176～183区域作为后续合成肽疫苗研究的靶位点。
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