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摘 要：以品种绿优1号、徽两优882、银两优851共266个批次种子为研究对象，采取SSR分子标记技术和田间种植鉴定2种测纯方法，对2种方法的结果进行差异性和相关性分析。结果表明：2种鉴定方法间差异不显著，并具有一定的相关性，相关系数R分别为0.424（绿优1号）、0.387（徽两优882）、0.397（银两优851），说明SSR分子标记鉴定方法可用于杂交稻种子纯度的快速鉴定。研究结果对于快速了解杂交水稻种子质量状况、保证用种安全和促进优质种子提前上市具有重要意义。
关键词：水稻;SSR分子标记;正季鉴定;纯度;差异分析
中图分类号 Q789;S511 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）04-0082-02
种子质量是种子企业的生命，种子纯度则是水稻种子质量的核心指标。传统的田间小区种植鉴定是国家标准规定的、目前鉴定杂交水稻种子纯度应用最广泛的方法，也是目前公认最准确、最可靠的方法。唐海燕等[1]对192份杂交稻种子样品的纯度进行了田间种植鉴定，并对鉴定结果进行了分析研究。随着分子标记技术的不断发展和杂交新品种的不断涌现，种子纯度鉴定进入了基因水平，目前应用较为广泛的是SSR分子标记。SSR分子标记技术具有重复性好、稳定性高、成本较低和易于操作等优点，利用SSR技术进行种子纯度鉴定已成为一项重要的手段。吴则东等[2]概述了AFLP、ISSR、SRAP、SSR 等4种主要的分子标记技术在农作物品种鉴定上的研究进展，提出了SSR将是未来利用分子标记技术鉴定品种纯度以及品种DUS测试的首选分子标记技术。王慧等[3]研究了不同世代恢复系所配杂交种种子室内分子鉴定与田间种植鉴定纯度结果的吻合度。结果表明：当恢复系完全纯合时，可用室内SSR分子标记鉴定替代田间种植鉴定来鉴定其杂交种的纯度。笔者选取安徽荃銀高科种业股份有限公司3个品种3年入库样品共计266批次种子，探讨了水稻品种的SSR标记技术与田间正季鉴定2种纯度检测结果的相关性和差异性，以期为杂交水稻种子纯度鉴定提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料 F1代材料：2018—2020年入库的种子，其中，绿优1号235批、徽两优882 13批、银两优851 18批，分别来自福建、贵州、四川、江西、江苏等5个制种基地。化学试剂：Tris-HCL、乙酸铵、10% SDS、EDTA、乙醇、6%聚丙烯酰胺、5×TBE、10%AP、TEMED、AgNO3、NaOH、甲醛等。
1.2 试验方法
1.2.1 田间鉴定 选择水源充足、排灌方便、肥力中等、形状规则、光照条件好的田块作为鉴定田。每个批次按照国家标准鉴定400株，在种子收后次年4月中下旬播种，5月中下旬移栽，8月上中旬进行鉴定。此鉴定时期、鉴定小区的植株基本与大田生产种植植株的生育期进程处于同一时期。采用人工观察统计的方法分别在抽穗扬花期、成熟期进行鉴定，记录父本、母本、保持系以及其他杂株类型。
1.2.2 SSR分子标记 DNA的提取：剪取1～2cm长的种子幼苗，冷冻后利用球磨仪进行研磨，采用张雯等[4]优化后的DNA提取法分别提取绿优1号、徽两优882、银两优851共计266批次种子的DNA备用。引物的筛选：根据中华人民共和国农业行业标准NY/T1433—2014公布的48对引物，分别对3个品种筛选出2对引物，绿优1号：RM583和RM471;徽两优882：RM339和RM3331;银两优851：RM471和RM481。PCR体系配比（10μL）：DNA模板1μL，上游引物0.25μL，下游引物0.25μL，Mix 5μL，ddH2O 3.5μL。PCR反应程序：94℃预变性2min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，进行30次扩增反应循环，10℃恒温保存。电泳和染色：采取非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染[5]。
1.3 数据处理 数据利用Excel进行卡方（χ2）分析。
χ2=∑（|分子测纯-正季鉴定|）2/正季鉴定
2 结果与分析
2.1 2种不同鉴定方法结果的差异性 由表1可知，银两优851种子的纯度最好，合格率均为94.4%;绿优1号和徽两优882种子的纯度合格率均是正季鉴定高于分子鉴定;3个品种的χ2计算分析，绿优1号：χ2=27.287<χ20.05，100=124.34<χ20.05，234，P>0.05;徽两优882：χ2=0.414<χ20.05，12=21.03，P>0.05;银两优851：χ2=10.085<χ20.05，17=27.59，P>0.05;表明3个品种种子的分子鉴定结果与正季鉴定结果差异均不显著。由此可见，SSR分子标记鉴定方法用于绿优1号、徽两优882、银两优851这3个品种种子纯度鉴定均具有可靠性。
2.2 2种不同鉴定方法结果的相关性 对3个品种的正季鉴定和SSR分子测纯结果分别作相关性分析。相关系数R>0表示2变量存在正的线性关系;R<0表示负的线性关系;|R|>0.8表示具有较强的线性相关关系;|R|<0.3表示具有较弱的线性相关关系。由图1、2、3可知，绿优1号、徽两优882和银两优851的正季鉴定结果与SSR分子鉴定结果均呈正相关，其中绿优1号的相关系数R为0.424，徽两优882的相关系数R为0.387，银两优851的相关系数R为0.397，均说明这2种鉴定方法具有相关性。
3 结论与讨论
试验结果表明：3个品种种子纯度2种方法的鉴定结果均表现出正相关性，且R均>0.3，说明SSR分子鉴定结果与正季鉴定结果存在相关关系，这与阳庆华等[6]研究结果一致。SSR分子鉴定结果与正季鉴定结果虽然存在差异，但差异并不显著。主要原因在于其他品种串粉田间杂株多，其籽粒性状和植株生育期都与真品种较为接近，难以分辨;另外，田间环境和人为因素可能会造成影响。这表明了分子标记更易区分真杂种子，而田间正季鉴定难以区分相似的杂株。因此SSR分子标记鉴定方法可用于杂交稻品种纯度的快速鉴定，这与陈年伟等[7]研究结果一致。
参考文献
[1]唐海燕，严钦泉，严秋平.杂交水稻种子纯度田间种植鉴定的结果与分析[J].杂交水稻，2005（3）：38-42.
[2]吴则东，江伟，马龙彪.分子标记技术在农作物品种鉴定上的研究进展及未来展望[J].中国农学通报，2015，31（33）：172-176.
[3]王慧，张从合，陈金节，等.基于NY/T 1433—2014推荐SSR标记检测不同世代恢复系配制杂交种的纯度研究[J].杂交水稻，2019，34（2）：59-62.
[4]张雯，丁显萍，张萍，等.杂交水稻种子纯度DNA指纹鉴定与田间鉴定结果的比较[J].安徽农学通报，2018，24（13）：11-12.
[5]任辉.SSR分子标记在杂交水稻品种纯度鉴定中的应用研究[D].杭州：浙江农林大学，2013.
[6]阳庆华，李秀琼，鲁孟海.SSR分子检测与田间小区种植鉴定扬两优6号纯度的比较[J].中国种业，2014（7）：49-50.
[7]陈年伟，张体刚，徐昌能，等.SSR分子检测与田间种植鉴定杂交稻种子纯度的研究[J].西南农业学报，2009，22（3）：553-555.
（责编：徐世红）
关键词：水稻;SSR分子标记;正季鉴定;纯度;差异分析
中图分类号 Q789;S511 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）04-0082-02
种子质量是种子企业的生命，种子纯度则是水稻种子质量的核心指标。传统的田间小区种植鉴定是国家标准规定的、目前鉴定杂交水稻种子纯度应用最广泛的方法，也是目前公认最准确、最可靠的方法。唐海燕等[1]对192份杂交稻种子样品的纯度进行了田间种植鉴定，并对鉴定结果进行了分析研究。随着分子标记技术的不断发展和杂交新品种的不断涌现，种子纯度鉴定进入了基因水平，目前应用较为广泛的是SSR分子标记。SSR分子标记技术具有重复性好、稳定性高、成本较低和易于操作等优点，利用SSR技术进行种子纯度鉴定已成为一项重要的手段。吴则东等[2]概述了AFLP、ISSR、SRAP、SSR 等4种主要的分子标记技术在农作物品种鉴定上的研究进展，提出了SSR将是未来利用分子标记技术鉴定品种纯度以及品种DUS测试的首选分子标记技术。王慧等[3]研究了不同世代恢复系所配杂交种种子室内分子鉴定与田间种植鉴定纯度结果的吻合度。结果表明：当恢复系完全纯合时，可用室内SSR分子标记鉴定替代田间种植鉴定来鉴定其杂交种的纯度。笔者选取安徽荃銀高科种业股份有限公司3个品种3年入库样品共计266批次种子，探讨了水稻品种的SSR标记技术与田间正季鉴定2种纯度检测结果的相关性和差异性，以期为杂交水稻种子纯度鉴定提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料 F1代材料：2018—2020年入库的种子，其中，绿优1号235批、徽两优882 13批、银两优851 18批，分别来自福建、贵州、四川、江西、江苏等5个制种基地。化学试剂：Tris-HCL、乙酸铵、10% SDS、EDTA、乙醇、6%聚丙烯酰胺、5×TBE、10%AP、TEMED、AgNO3、NaOH、甲醛等。
1.2 试验方法
1.2.1 田间鉴定 选择水源充足、排灌方便、肥力中等、形状规则、光照条件好的田块作为鉴定田。每个批次按照国家标准鉴定400株，在种子收后次年4月中下旬播种，5月中下旬移栽，8月上中旬进行鉴定。此鉴定时期、鉴定小区的植株基本与大田生产种植植株的生育期进程处于同一时期。采用人工观察统计的方法分别在抽穗扬花期、成熟期进行鉴定，记录父本、母本、保持系以及其他杂株类型。
1.2.2 SSR分子标记 DNA的提取：剪取1～2cm长的种子幼苗，冷冻后利用球磨仪进行研磨，采用张雯等[4]优化后的DNA提取法分别提取绿优1号、徽两优882、银两优851共计266批次种子的DNA备用。引物的筛选：根据中华人民共和国农业行业标准NY/T1433—2014公布的48对引物，分别对3个品种筛选出2对引物，绿优1号：RM583和RM471;徽两优882：RM339和RM3331;银两优851：RM471和RM481。PCR体系配比（10μL）：DNA模板1μL，上游引物0.25μL，下游引物0.25μL，Mix 5μL，ddH2O 3.5μL。PCR反应程序：94℃预变性2min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，进行30次扩增反应循环，10℃恒温保存。电泳和染色：采取非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染[5]。
1.3 数据处理 数据利用Excel进行卡方（χ2）分析。
χ2=∑（|分子测纯-正季鉴定|）2/正季鉴定
2 结果与分析
2.1 2种不同鉴定方法结果的差异性 由表1可知，银两优851种子的纯度最好，合格率均为94.4%;绿优1号和徽两优882种子的纯度合格率均是正季鉴定高于分子鉴定;3个品种的χ2计算分析，绿优1号：χ2=27.287<χ20.05，100=124.34<χ20.05，234，P>0.05;徽两优882：χ2=0.414<χ20.05，12=21.03，P>0.05;银两优851：χ2=10.085<χ20.05，17=27.59，P>0.05;表明3个品种种子的分子鉴定结果与正季鉴定结果差异均不显著。由此可见，SSR分子标记鉴定方法用于绿优1号、徽两优882、银两优851这3个品种种子纯度鉴定均具有可靠性。
2.2 2种不同鉴定方法结果的相关性 对3个品种的正季鉴定和SSR分子测纯结果分别作相关性分析。相关系数R>0表示2变量存在正的线性关系;R<0表示负的线性关系;|R|>0.8表示具有较强的线性相关关系;|R|<0.3表示具有较弱的线性相关关系。由图1、2、3可知，绿优1号、徽两优882和银两优851的正季鉴定结果与SSR分子鉴定结果均呈正相关，其中绿优1号的相关系数R为0.424，徽两优882的相关系数R为0.387，银两优851的相关系数R为0.397，均说明这2种鉴定方法具有相关性。
3 结论与讨论
试验结果表明：3个品种种子纯度2种方法的鉴定结果均表现出正相关性，且R均>0.3，说明SSR分子鉴定结果与正季鉴定结果存在相关关系，这与阳庆华等[6]研究结果一致。SSR分子鉴定结果与正季鉴定结果虽然存在差异，但差异并不显著。主要原因在于其他品种串粉田间杂株多，其籽粒性状和植株生育期都与真品种较为接近，难以分辨;另外，田间环境和人为因素可能会造成影响。这表明了分子标记更易区分真杂种子，而田间正季鉴定难以区分相似的杂株。因此SSR分子标记鉴定方法可用于杂交稻品种纯度的快速鉴定，这与陈年伟等[7]研究结果一致。
参考文献
[1]唐海燕，严钦泉，严秋平.杂交水稻种子纯度田间种植鉴定的结果与分析[J].杂交水稻，2005（3）：38-42.
[2]吴则东，江伟，马龙彪.分子标记技术在农作物品种鉴定上的研究进展及未来展望[J].中国农学通报，2015，31（33）：172-176.
[3]王慧，张从合，陈金节，等.基于NY/T 1433—2014推荐SSR标记检测不同世代恢复系配制杂交种的纯度研究[J].杂交水稻，2019，34（2）：59-62.
[4]张雯，丁显萍，张萍，等.杂交水稻种子纯度DNA指纹鉴定与田间鉴定结果的比较[J].安徽农学通报，2018，24（13）：11-12.
[5]任辉.SSR分子标记在杂交水稻品种纯度鉴定中的应用研究[D].杭州：浙江农林大学，2013.
[6]阳庆华，李秀琼，鲁孟海.SSR分子检测与田间小区种植鉴定扬两优6号纯度的比较[J].中国种业，2014（7）：49-50.
[7]陈年伟，张体刚，徐昌能，等.SSR分子检测与田间种植鉴定杂交稻种子纯度的研究[J].西南农业学报，2009，22（3）：553-555.
（责编：徐世红）