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摘要 [目的]试验选取山西道地药材连翘，利用组织培养技术进行快速繁育研究。[方法]以连翘含有2个腋芽的嫩茎茎段为外植体，利用不同激素种类和浓度水平通过正交试验法进行比较，最终利用方差分析筛选出最适宜连翘快速繁育的组织培养体系。[结果]连翘的最佳组织培养体系为初代培养基（MS+6BA 10 mg/L+IBA 0.3 mg/L+蔗糖 25 g/L）、增殖培养基（MS+6BA 10 mg/L+IBA 0.1 mg/L+蔗糖 35 g/L）、生根培养基（MS+6BA 1.5 mg/L+ IBA 0.1 mg/L+蔗糖 25 g/L），生根率可达93.3%，生根的平均根长最长，达97mm，适合大规模繁殖。[结论]该研究为连翘的大规模发展提供技术支持。
关键词 连翘；正交试验；组织培养；快速繁育；方差分析
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）12-041-02
Abstract [Objective]The research aimed to select Shanxi trueborn medicinal material to study the rapid propagation technique for Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl by tissue culture.[Method]Stems with two axillary buds， Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl was used as explants for comparison by means of the orthogonal test in different hormone types and concentrations.The optimal tissue culture system of rapid propagation of Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl by variance analysis were established as follow.[Result]The optimal tissue culture system of rapid propagation of Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl were initial medium （ MS+6BA 1.0 mg/L+IBA 0.3 mg/L+ surcourse 25 g/L），enrichment medium（MS+6BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L+ surcourse 35 g/L），rooting medium（MS+6BA 1.5 mg/L+ IBA 0.1 mg/L+ surcourse 25 g/L）. The rooting rate was high as 93.3%. The average root length was long as 9.7 mm， which was the longest one. It was suitable for largescale propagation. [Conclusion]The study provides the technical support for large-scale development of Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl.
Key words Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl；Orthogonal test； Tissue culture； Rapid propagation； Variance analysis
连翘[Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl]，木犀科连翘属植物，园林中常应用于公园绿地、庭院和街道，可丛植、孤植，病虫害较少，易于管理[1-2]。同时连翘具有清热止吐、清肝利胆、除湿退黄、通调三焦、畅达血脉、保肝护心等作用[3]，含有金丝桃素类等重要药用价值和具有抗病毒、抗癌和治疗AIDS 的应用前景[4]。
随着人们对连翘药用价值研究的不断深入和园林绿化建设事业的快速发展，连翘传统的繁殖方式越来越不能满足市场的需求，再加上培育出了许多观赏价值更高的新品种，有些新品种用传统的繁殖方法繁殖比较困难。山西省凭借在道地药材党参、黄芪和苦参3个品种药材的研究利用，获得国家中药材GAP基地认证。目前全国近年来已公布共有63家企业48个品种得到GAP认证，山西在48个品种中占有三席位置，这为山西从事中药材工作的同仁提供了坚定道地药材品种选育的信心，加快了培育道地资源品种，提升了山西道地药材品种繁育及推广进程，也为山西道地药材连翘进一步开发利用提供方向。
该研究利用组织培养的无性繁殖技术拟筛选出一种高效的连翘快繁方法，通过正交试验法利用不同激素种类和浓度水平进行比较，最终通过方差分析筛选出最适宜连翘的组织培养体系，从而为连翘的大规模发展提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料及处理
从春季品种纯正、生长健壮、无病虫害的连翘采集所萌发抽生的一年生嫩枝，将剪取的嫩枝蘸取适量洗衣粉仔细清洗2遍，再用流水冲洗后，放入无菌水中浸泡备用。在超净台上将枝条切成 3～4 cm 的含有2个腋芽的嫩茎茎段，放置在70%的酒精中消毒 30 s，用无菌水冲洗3次，每次3 min。转入0.1% 氯化汞溶液中消毒7 min[5]，用无菌水漂洗3次，每次3 min，然后接种到培养基上。
1.2 培养条件
温度为22～26 ℃，培养基pH为5.8，光照度为1 500～2 000 lx，光照周期为10～12 h/d。
1.3 试验方法 1.3.1
初代培养。采用四因素三水平L9（34）正交试验设计[6]。每个处理接种20瓶，重复3次。接种21 d后，开始统计结果。
1.3.2
增殖培养。以MS为基本培养基，加入不同浓度水平的6BA、IBA和蔗糖，将经过初代培养筛选出来的最佳培养基的植物材料转接，采用三因素三水平L9（34）进行增殖培养。每个处理接种20瓶，重复3次。接种23 d后，统计试验结果。
1.3.3
生根培养。由于激素水平对连翘生根起着主要作用[7-8]，所以生根培养以MS、25 g/L的蔗糖为基本培养基，加入不同浓度的6BA和IBA作为生根培养基。将增殖培养筛选出来的最适培养基生长良好的芽转接到生根培养基中进行生根培养。每个处理接种20瓶，重复3次。接种27 d后，统计生根率，对生长出的根进行长度测定。
2 结果与分析
2.1 初代培养
接种7 d，培养基上茎段开始萌芽生长。在接种21 d后，统计成活率，结果表明（表1），以MS为基本培养基（试验序号a4、a5、a6号培养基）的植株在初代培养成活率较高，均超过了70%，其中a5号培养基的成活率最高，达80.0%。
将初代培养的统计结果通过SAS软件进行方差分析[9-10]，方差分析结果（表2）显示，1MS培养基对连翘初代培养成活率的影响极显著高于3/2MS、1/2 MS培养基；1.0 mg/L 6BA对连翘初代培养成活率的影响极显著高于1.5、0.5 mg/L 6BA；0.3 mg/L IBA对连翘初代培养成活率的影响极显著高于0.2、0.1 mg/L IBA；25 g/L蔗糖对连翘初代培养成活率的影响极显著高于35、30 g/L蔗糖。
2.2 增殖培养
接种23 d后，统计试验结果（表3）显示，加入1.0 mg/L 6BA的MS基本培养基（试验序号b4、b5、b6号培养基）的植株在增殖培养成活率较高，均超过了70%，试验序号b4培养基的成活率最高，达88.3%。
增殖培养方差分析结果（表4）显示，1.0 mg/L 6BA对连翘增殖培养成活率的影响极显著高于0.5、1.5 mg/L 6BA；01 mg/L IBA对连翘增殖培养成活率的影响极显著高于02 mg/L IBA；35、25 g/L蔗糖对连翘增殖培养成活率的影响极显著高于30 g/L蔗糖。
2.3 生根培养
接种7 d后，部分培养基芽基部开始出现白色小突起。接种27 d后，统计生根率，然后对部分根进行长度测定。结果表明（表5），试验序号c1、c4、c5和c6号培养基的植株生根率较高，均超过了80%，试验序号c4培养基的成活率和平均根长均是最高的，分别达93.3%、 9.7 mm。
的影响极显著高于1.0和2.0 mg/L的6BA，0.1 mg/L的IBA对连翘组织平均根长形成的影响极显著高于0.2和0.3 mg/L的IBA。
3 结论
通过不同激素种类及浓度水平配比，经过正交试验法以及方差分析筛选出连翘的最佳组织培养体系为初代培养基（MS+6BA 10 mg/L+IBA 0.3 mg/L+蔗糖 25 g/L）、增殖培养基（MS+6BA 10 mg/L+IBA 0.1 mg/L+蔗糖 35 g/L）、生根培养基（MS+6BA 1.5 mg/L+ IBA 0.1 mg/L+蔗糖 25 g/L），生根率可达90%以上，生根根数较多，适合大规模栽植。张红梅等研究表明MS+6BA 1 mg/L+IBA 0.1 mg/L+3%蔗糖的培养基是最适合花叶连翘的增殖培养基，能够诱导出大量丛生苗[11]，该研究与其在激素浓度配比以及在基本培养基选择上的结果均相同。孙海龙研究认为6BA的浓度对连翘分化影响很大，浓度过低会使分化效果差，而浓度过高则会导致玻璃化现象严重[12]。该研究筛选出来三类培养基的6BA的浓度均在其研究的适宜范围内，能够与其保持一致。
参考文献
[1]白雅鹃，章林，陈建军，等.金叶连翘组培快繁技术的研究[J].吉林林业科技，2006，35（1）： 15-19.
[2] 王金玲，杜凤国.金钟连翘组织培养与快速繁殖[J].北方园艺，2012（8）： 138-139.
[3] 李卫建，李先恩.连翘有效成分含量与土壤养分的量化关系研究[J].中国中药杂志，2005，30（20）： 1577-1580.
[4] 徐皓.贯叶连翘的化学成分及药理作用研究[J].安徽农业科学，2011，9（2）： 48-49.
[5] 王桂荣.植物组织培养中的常见问题与对策[J].宿州学院学报，2010，25（11）： 54-57.
[6] 任露泉.试验优化设计与分析[M].2版.北京：高等教育出版社，2003.
[7] 肖关丽，杨清辉.植物组织培养过程中内源激素研究进展[J].云南农业大学学报，2001，16（2）： 136-138.
[8] 李代丽，康向阳.植物愈伤组织培养中内外源激素效应的研究现状与展望[J].生物技术通讯，2007，17（3）： 546-548.
[9] 明道绪.田间试验与统计分析[M].3版.北京：科学出版社，2013.
[10] 王玉顺.试验统计与统计分析SAS实践教程[M].西安：西安电子科技大学出版社，2012.
[11] 张红梅，肖小琴，及华，等.花叶连翘的组织培养和快速繁殖[J].植物生理学通讯，2002，38（5）： 453-454.
[12] 孙海龙.金叶连翘组培快繁技术研究[J].黑龙江农业科学，2014 （5）： 38-41.
关键词 连翘；正交试验；组织培养；快速繁育；方差分析
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）12-041-02
Abstract [Objective]The research aimed to select Shanxi trueborn medicinal material to study the rapid propagation technique for Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl by tissue culture.[Method]Stems with two axillary buds， Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl was used as explants for comparison by means of the orthogonal test in different hormone types and concentrations.The optimal tissue culture system of rapid propagation of Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl by variance analysis were established as follow.[Result]The optimal tissue culture system of rapid propagation of Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl were initial medium （ MS+6BA 1.0 mg/L+IBA 0.3 mg/L+ surcourse 25 g/L），enrichment medium（MS+6BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L+ surcourse 35 g/L），rooting medium（MS+6BA 1.5 mg/L+ IBA 0.1 mg/L+ surcourse 25 g/L）. The rooting rate was high as 93.3%. The average root length was long as 9.7 mm， which was the longest one. It was suitable for largescale propagation. [Conclusion]The study provides the technical support for large-scale development of Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl.
Key words Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl；Orthogonal test； Tissue culture； Rapid propagation； Variance analysis
连翘[Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl]，木犀科连翘属植物，园林中常应用于公园绿地、庭院和街道，可丛植、孤植，病虫害较少，易于管理[1-2]。同时连翘具有清热止吐、清肝利胆、除湿退黄、通调三焦、畅达血脉、保肝护心等作用[3]，含有金丝桃素类等重要药用价值和具有抗病毒、抗癌和治疗AIDS 的应用前景[4]。
随着人们对连翘药用价值研究的不断深入和园林绿化建设事业的快速发展，连翘传统的繁殖方式越来越不能满足市场的需求，再加上培育出了许多观赏价值更高的新品种，有些新品种用传统的繁殖方法繁殖比较困难。山西省凭借在道地药材党参、黄芪和苦参3个品种药材的研究利用，获得国家中药材GAP基地认证。目前全国近年来已公布共有63家企业48个品种得到GAP认证，山西在48个品种中占有三席位置，这为山西从事中药材工作的同仁提供了坚定道地药材品种选育的信心，加快了培育道地资源品种，提升了山西道地药材品种繁育及推广进程，也为山西道地药材连翘进一步开发利用提供方向。
该研究利用组织培养的无性繁殖技术拟筛选出一种高效的连翘快繁方法，通过正交试验法利用不同激素种类和浓度水平进行比较，最终通过方差分析筛选出最适宜连翘的组织培养体系，从而为连翘的大规模发展提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料及处理
从春季品种纯正、生长健壮、无病虫害的连翘采集所萌发抽生的一年生嫩枝，将剪取的嫩枝蘸取适量洗衣粉仔细清洗2遍，再用流水冲洗后，放入无菌水中浸泡备用。在超净台上将枝条切成 3～4 cm 的含有2个腋芽的嫩茎茎段，放置在70%的酒精中消毒 30 s，用无菌水冲洗3次，每次3 min。转入0.1% 氯化汞溶液中消毒7 min[5]，用无菌水漂洗3次，每次3 min，然后接种到培养基上。
1.2 培养条件
温度为22～26 ℃，培养基pH为5.8，光照度为1 500～2 000 lx，光照周期为10～12 h/d。
1.3 试验方法 1.3.1
初代培养。采用四因素三水平L9（34）正交试验设计[6]。每个处理接种20瓶，重复3次。接种21 d后，开始统计结果。
1.3.2
增殖培养。以MS为基本培养基，加入不同浓度水平的6BA、IBA和蔗糖，将经过初代培养筛选出来的最佳培养基的植物材料转接，采用三因素三水平L9（34）进行增殖培养。每个处理接种20瓶，重复3次。接种23 d后，统计试验结果。
1.3.3
生根培养。由于激素水平对连翘生根起着主要作用[7-8]，所以生根培养以MS、25 g/L的蔗糖为基本培养基，加入不同浓度的6BA和IBA作为生根培养基。将增殖培养筛选出来的最适培养基生长良好的芽转接到生根培养基中进行生根培养。每个处理接种20瓶，重复3次。接种27 d后，统计生根率，对生长出的根进行长度测定。
2 结果与分析
2.1 初代培养
接种7 d，培养基上茎段开始萌芽生长。在接种21 d后，统计成活率，结果表明（表1），以MS为基本培养基（试验序号a4、a5、a6号培养基）的植株在初代培养成活率较高，均超过了70%，其中a5号培养基的成活率最高，达80.0%。
将初代培养的统计结果通过SAS软件进行方差分析[9-10]，方差分析结果（表2）显示，1MS培养基对连翘初代培养成活率的影响极显著高于3/2MS、1/2 MS培养基；1.0 mg/L 6BA对连翘初代培养成活率的影响极显著高于1.5、0.5 mg/L 6BA；0.3 mg/L IBA对连翘初代培养成活率的影响极显著高于0.2、0.1 mg/L IBA；25 g/L蔗糖对连翘初代培养成活率的影响极显著高于35、30 g/L蔗糖。
2.2 增殖培养
接种23 d后，统计试验结果（表3）显示，加入1.0 mg/L 6BA的MS基本培养基（试验序号b4、b5、b6号培养基）的植株在增殖培养成活率较高，均超过了70%，试验序号b4培养基的成活率最高，达88.3%。
增殖培养方差分析结果（表4）显示，1.0 mg/L 6BA对连翘增殖培养成活率的影响极显著高于0.5、1.5 mg/L 6BA；01 mg/L IBA对连翘增殖培养成活率的影响极显著高于02 mg/L IBA；35、25 g/L蔗糖对连翘增殖培养成活率的影响极显著高于30 g/L蔗糖。
2.3 生根培养
接种7 d后，部分培养基芽基部开始出现白色小突起。接种27 d后，统计生根率，然后对部分根进行长度测定。结果表明（表5），试验序号c1、c4、c5和c6号培养基的植株生根率较高，均超过了80%，试验序号c4培养基的成活率和平均根长均是最高的，分别达93.3%、 9.7 mm。
的影响极显著高于1.0和2.0 mg/L的6BA，0.1 mg/L的IBA对连翘组织平均根长形成的影响极显著高于0.2和0.3 mg/L的IBA。
3 结论
通过不同激素种类及浓度水平配比，经过正交试验法以及方差分析筛选出连翘的最佳组织培养体系为初代培养基（MS+6BA 10 mg/L+IBA 0.3 mg/L+蔗糖 25 g/L）、增殖培养基（MS+6BA 10 mg/L+IBA 0.1 mg/L+蔗糖 35 g/L）、生根培养基（MS+6BA 1.5 mg/L+ IBA 0.1 mg/L+蔗糖 25 g/L），生根率可达90%以上，生根根数较多，适合大规模栽植。张红梅等研究表明MS+6BA 1 mg/L+IBA 0.1 mg/L+3%蔗糖的培养基是最适合花叶连翘的增殖培养基，能够诱导出大量丛生苗[11]，该研究与其在激素浓度配比以及在基本培养基选择上的结果均相同。孙海龙研究认为6BA的浓度对连翘分化影响很大，浓度过低会使分化效果差，而浓度过高则会导致玻璃化现象严重[12]。该研究筛选出来三类培养基的6BA的浓度均在其研究的适宜范围内，能够与其保持一致。
参考文献
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[8] 李代丽，康向阳.植物愈伤组织培养中内外源激素效应的研究现状与展望[J].生物技术通讯，2007，17（3）： 546-548.
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[11] 张红梅，肖小琴，及华，等.花叶连翘的组织培养和快速繁殖[J].植物生理学通讯，2002，38（5）： 453-454.
[12] 孙海龙.金叶连翘组培快繁技术研究[J].黑龙江农业科学，2014 （5）： 38-41.