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摘要 [目的]研究内生细菌TF28对番茄灰霉病的诱导抗性。[方法] 采用生化测定方法研究内生细菌TF28对番茄叶片6种防御酶活性和2种抗病信号分子含量的影响。[结果]内生细菌处理后番茄叶片苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、脂氧合酶（LOX）、几丁质酶和β1，3葡聚糖酶活性明显增强，6种防御酶最大活性分别为对照的2.7、2.5、1.6、1.5、2.7和4.1倍。水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）含量明显上升，SA含量第7天最高，JA含量第3天最高，分别为对照的2.1和2.9倍。[结论]内生细菌TF28可诱导提高防御酶活性抵抗番茄灰霉病侵染，诱导抗病信号传导途径可能与SA和JA介导有关。
关键词 内生细菌；番茄；灰霉病；诱导抗性
中图分类号 S476 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03253-04
Abstract [Objective] To elucidate the mechanism of induced resistance of tomato to grey mold by endophytic bacterium TF28. [Method] the activity of defensive enzymes and the contents of defensive signals were determined. After the treatment with TF28， the activity of phenylalanine ammonialyase （PAL）， polyphenol oxidase （PPO）， peroxidase （POD）， lipoxygenase （LOX）， chitinase and β1，3glucanase increased significantly. [Result] The maximum of PAL， PPO， POD， LOX， chitinase and β1，3glucanase was 2.7， 2.5， 1.6， 1.5， 2.7 and 4.1times higher than that in control， respectively. The contents of salicylic acid （SA） and jasmonic acid （JA） were also improved significantly. The contents of SA reached the peak 7 days after inoculation while JA reached the maximum 3 days after treatment， which was 2.1 and 2.9 times higher than that in control， respectively. [Conclusion] Results demonstrated that endophytic bacterium TF28 could improve the activity of defensive enzymes to prevent Botrytis cinerea. The defense pathway might include SA and JA signal transmission.
Key words Endophytic bacterium； Tomato； Grey mould； Induced resistance
番茄灰霉病是番茄生产中的主要病害，严重影响番茄的产量和品质[1]。目前对于灰霉病的防治仍以化学农药为主，然而化学农药的毒性和残留等问题日益突出，严重威胁人畜健康和环境安全。近年来利用拮抗细菌防治番茄灰霉病研究较多，主要侧重于生防菌株筛选、防效、定殖以及抗菌物质方面，所报道的菌株以芽孢杆菌为主，其生防机制主要包括营养和位点竞争、抗菌物质的拮抗和诱导植物抗病性[2-8]。近年来，由于植物诱导抗病性具有广谱性，被认为是植物病害防治新方式，因此对于芽孢杆菌诱导植物抗病性的研究日益增多[9-10]。研究表明，芽孢杆菌诱导植物抗病性因菌株而异，其诱导抗病性反应的信号识别与传导途径、生理生化反应模式等复杂多样。植物防御酶系活性变化是生防细菌诱导植物产生抗病性的重要生理生化反应，涉及的主要防御酶包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、几丁质酶（Chitinase）、β 1，3葡聚糖酶（β 1，3 Glucanase）和脂氧合酶（LOX）等，大量研究表明，植物受诱导因子刺激后这些酶活性增强[11]。水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）是植物抗病信号转导途径中的2个重要信号分子，其含量与植物抗病性成正相关[12]。
内生细菌因与植物具有很好的亲和性，成为近年来备受关注的一类重要生防菌株。内生细菌TF28是笔者从大豆根部分离到的一株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，对大豆根腐病菌、水稻恶苗病菌、番茄灰霉病菌等10多种植物病原真菌具有很好的拮抗作用，能够产生抗菌蛋白和脂肽类抗生素等多种抗菌物质[13]。温室试验发现苗期喷洒TF28菌液能够提高番茄抗灰霉病能力。笔者以苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、过氧化物酶、脂氧合酶、几丁质酶和β-1，3葡聚糖酶以及水杨酸和茉莉酸为指标，明确内生细菌TF28处理后番茄叶片6种防御酶活性和2种抗病信号分子含量变化情况，为阐明内生细菌TF28诱导番茄抗灰霉病机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
内生细菌Bacillus amyloliquefaciens TF28分离自大豆根部，是一株具有广谱抑菌作用的生防菌株。番茄灰霉病菌Botrytis cinerea分离自感病番茄果实。番茄品种为东农713。 1.2 番茄灰霉病菌孢子悬浮液的制备
将活化后的番茄灰霉病菌菌丝块接种至PDA平板，25 ℃培养7～10 d，用无菌水洗涤。洗涤液经5 000 r/min 离心5 min后，弃沉淀，上清液用血球计数板计算孢子数，用无菌水稀释至1.5×107cfu/ml的孢子悬液，添加0.02%吐温80备用。
1.3 TF28菌液制备
挑取一环-70 ℃保存的TF28菌液划线接种至NYD平板，30 ℃过夜培养，次日取单菌落转接于5 ml NYD液体培养基中，30 ℃、200 r/min 振荡培养18 h，作为种子液。将种子液按2%接种量转接于100 ml NYD液体培养基中，30 ℃、200 r/min振荡培养36 h，活菌计数后用无菌水稀释至2×108 cfu/ml的菌悬液备用。
1.4 盆栽试验设计
挑选饱满番茄种子，用清水浸泡5 h，催芽后播种，每盆1粒，保持适宜温度、湿度和栽培管理，用第5片真叶作为研究对象，设4个处理，每个处理20株。①病菌处理：喷洒灰霉病菌孢子悬液；②内生细菌处理：将TF28菌液添加0.02%吐温80后喷施番茄叶片；③先接病菌后接内生细菌处理：喷施番茄灰霉病菌孢子1d后再喷洒TF28菌液；④空白对照：只喷洒清水。处理后分别在1、2、3、4、5、6、7 d取各处理叶片测定防御酶活性和抗病分子含量。
1.5 防御酶活性测定
取0.2 g番茄叶片用于提取粗酶。苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）活性测定参照文献[14]，几丁质酶（Chitinaes）和β1，3葡聚糖酶（β1，3glucanase）活性测定参照文献[15]，脂氧合酶活性测定参照文献[16]。
1.6 水杨酸和茉莉酸含量测定
取0.2 g番茄叶片，参照文献[17]方法提取水杨酸，参照文献[18]方法提取茉莉酸，用上海裕平生物科技有限公司的酶联免疫试剂盒测定水杨酸和茉莉酸含量，按照说明书进行。
2 结果与分析
2.1 内生细菌TF28对番茄叶片PAL活性的影响
由图1可知，内生细菌TF28和灰霉病菌单独以及共同处理后PAL活性显著增强。3个处理酶活性变化规律相似，均在第2天活性最大，分别为对照的2.7、2.3和3.6倍，第7天活性最小，分别为对照的1.6、1.1和1.8倍。TF28和灰霉病菌共同处理PAL活性显著高于两者单独处理，其最大活性比TF28和灰霉病菌单独处理高29.3%和55.2%。TF28单独处理PAL活性高于灰霉病菌单独处理。表明内生细菌TF28和灰霉病菌均能诱导番茄叶片PAL活性增强，TF28的诱导能力强于灰霉病菌，TF28和灰霉病菌共同诱导具有协同增效作用。
3 结论与讨论
PAL、POD、PPO、LOX、Chitinase和β-1，3Glucanase是植物诱导抗病反应中的主要防御酶，PAL、POD、PPO和LOX参与抗菌物质植保素和木质素合成，Chitinase和β-1，3Glucanase水解病原真菌细胞壁[19-20]，研究发现防御酶活性与植物诱导抗病性呈正相关性。薛玉潇等[21]研究发现香蕉根部接种生防枯草芽孢杆菌后，香蕉叶片PAL、POD和PPO活性显著提高；王淑霞等研究发现哈茨木霉Tr-92处理黄瓜根部，黄瓜叶片PAL、POD、PPO、Chitinase和β-1，3Glucanase活性显著提高[22]。该研究用内生细菌TF28喷洒番茄叶片后，番茄叶片PAL、POD、PPO、LOX、Chitinase和β-1，3Glucanase活性显著提高，与已有报道一致，说明这些防御酶在内生细菌诱导番茄抗灰霉病过程中起重要作用。6种防御酶活性变化规律和最高活性峰出现时间不同，PPO活性在接种后1 d立即达到最大，POD活性缓慢升高，在第7天达到最大，PAL活性在第2天达到最大，LOX、Chitinase和Glucanase活性均在第5天达到最大，这些酶活性高峰出现时间的异同可能与其在抗病反应中所起作用早晚有关。在酶活性增加幅度上，除Chitinase之外，内生细菌TF28处理后其他5种酶活性高于灰霉病菌单独接种；内生细菌与灰霉病菌共同处理PAL、PPO和Chitinase活性高于TF28单独处理，POD、LOX和Glucanase活性与TF28单独处理相当，说明先接种灰霉病菌可增强内生细菌对番茄灰霉病诱导抗性。
PAL和LOX除参与抗菌物质生成，还参与抗病信号分子合成，PAL参与SA合成，LOX参与JA合成[23]。内生细菌TF28处理后， PAL活性和SA含量均提高，PAL活性在第2天最大，然后下降，SA含量在第3天最大；LOX活性在第2天活性较高，第5天活性最高，而JA含量在第3天最高，然后下降，推测喷洒内生细菌1～3 d PAL主要参与SA合成，LOX主要参与JA合成，4～7 d两者主要参与抗菌物质合成。
植物体内存在多条抗病信号传导途径，水杨酸和茉莉酸介导途径是植物诱导抗病信号传导2个主要途径，不同诱导因子诱导的植物抗病信号传导途径不同， 2种途径存在拮抗和协同现象[24]。水杨酸和茉莉酸是植物抗病信号传导途径中的2个重要抗病信号分子，其含量与植物抗病性呈正相关。内生细菌TF28诱导后番茄叶片中水杨酸和茉莉酸含量均升高，推测内生细菌TF28诱导番茄抗灰霉病信号传导途径包括水杨酸和茉莉酸2种途径，且2种途径具有协同作用。
参考文献
[1]
何美仙.番茄灰霉病的生物防治研究进展[J].中国蔬菜，2004（5）：29-31.
[2] 李桂霞，马汇泉，刘婧，等.番茄灰霉病高效拮抗菌株鉴定及抗菌活性研究[J]. 山东农业科学，2007（2）：69-72.
[3] 谷祖敏，王芳，纪明山，等.拮抗细菌B9对灰霉病菌的影响及在番茄叶表的定殖[J].云南农业大学学报，2006，21（6）：842-845. [4] 张玉芬，于秀英，张丽娟.番茄灰霉病拮抗菌B26抑菌蛋白的分离纯化与鉴定[J].江苏农业科学，2008（5）：96-98.
[5] 谷祖敏，纪明山，魏松红，等.三株拮抗菌对番茄灰霉病的防治效果[J].北方园艺，2008（9）：174-175.
[6] 徐大勇，李峰.番茄灰霉病拮抗内生细菌的筛选、鉴定及其活性[J].生态学杂志，2012，31（4）：994-999.
[7] 王美琴，贺运春，刘慧平，等.内生菌株Thhy1和Jcxy8的鉴定及对番茄灰霉病的防治[J].植物保护学报，2010，37（2）：191-192.
[8] 刘晓光， 高克祥，康振生，等.生防菌诱导植物系统抗性及其生化和细胞学机制[J].应用生态学报，2007，18（8）：1861-1868.
[9] KLOEPPER J W，RYU C M，ZHANG S.Induced systemic resistance and promoti on of plant growth by Bacillus sp[J].Phytopathology，2004，94 （11）：1259-1266.
[10] 童蕴慧，郭桂萍，徐敬友，等.拮抗细菌诱导番茄植株抗灰霉病机理研究[J].植物病理学报，2004，34（6）：507-511.
[11] CHEN F，WANG M，ZHENG Y，et al.Quantitative changes of plant defense enzymes and phytohormone in biocontrol of cucumber Fusarium wilt by Bacillus subtilis B579[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2010，26（4）：675-684.
[12] 徐刚，姚银安.水杨酸、茉莉酸和乙烯介导的防卫信号途径相互作用的研究进展[J].生物学杂志，2009，26（1）：48-51.
[13] ZHANG S M，WANG Y X，MENG L Q，et al.Isolation and characterization of antifungal lipopeptides produced by endophytic Bacillus amyloliquefaciens TF28[J]. African Journal of Microbiology Research，2012，6（8）：1747-1755.
[14] 曹建康，姜微波，赵玉梅.果蔬采后生理生化实验指导[M].北京：中国轻工业出版社，2001.
[15] 张少英，王俊斌，王海凤，等.甜菜几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性与其对丛根病抗性的关系[J].植物生理与分子生物学学报，2005，31 （3）：281-286.
[16] 李强，吴晓露，李红伟，等.黄瓜果实脂氧合酶活性测定方法的建立[J].东北农业大学学报，2008，39（5）：62-65.
[17] MARIANNE C W，NYNKE B，FEDERICA D，et al.Method for the extraction of the volatile compound salicylic acid from tobacco leaf material[J].Phytochemmical，Analysis，2002，13：45-50.
[18] 陈华君，张风娟，任琴，等.植物材料中茉莉酸的提取、纯化及其定量方法的研究[J].分析测试学报，2005（24）：138-140.
[19] 刘晓光，高克祥，康振生，等.生防菌诱导植物系统抗性及其生化和细胞学机制[J].应用生态学报，2007，18（8）：1861-1868.
[20] 秦引萍，彭友良.脂氧合酶的侵染诱导在植物抗病反应中的可能作用[J].农业生物技术学报，1995，3（4）：1-8.
[21] 薛玉潇，贾慧升，王国芬，等.接种生防菌和病原菌对香蕉抗枯萎病的诱导[J].热带生物学报，2012，3（1）：62-65.
[22] 王淑霞，张丽萍，黄亚丽，等.哈茨木霉Tr-92诱导黄瓜对灰霉病系统抗性的研究[J].中国生物防治学报，2013，29（2）：242-247.
[23] 李国猜，周燮.植物防御反应中水杨酸与茉莉酸的“对话” 机制[J].细胞生物学杂志，2002，24（2）：101-105.
[24] 徐刚，姚银安.水杨酸、茉莉酸和乙烯介导的防卫信号途径相互作用的研究进展[J].生物学杂志，2009，21（1）：48-51.
关键词 内生细菌；番茄；灰霉病；诱导抗性
中图分类号 S476 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03253-04
Abstract [Objective] To elucidate the mechanism of induced resistance of tomato to grey mold by endophytic bacterium TF28. [Method] the activity of defensive enzymes and the contents of defensive signals were determined. After the treatment with TF28， the activity of phenylalanine ammonialyase （PAL）， polyphenol oxidase （PPO）， peroxidase （POD）， lipoxygenase （LOX）， chitinase and β1，3glucanase increased significantly. [Result] The maximum of PAL， PPO， POD， LOX， chitinase and β1，3glucanase was 2.7， 2.5， 1.6， 1.5， 2.7 and 4.1times higher than that in control， respectively. The contents of salicylic acid （SA） and jasmonic acid （JA） were also improved significantly. The contents of SA reached the peak 7 days after inoculation while JA reached the maximum 3 days after treatment， which was 2.1 and 2.9 times higher than that in control， respectively. [Conclusion] Results demonstrated that endophytic bacterium TF28 could improve the activity of defensive enzymes to prevent Botrytis cinerea. The defense pathway might include SA and JA signal transmission.
Key words Endophytic bacterium； Tomato； Grey mould； Induced resistance
番茄灰霉病是番茄生产中的主要病害，严重影响番茄的产量和品质[1]。目前对于灰霉病的防治仍以化学农药为主，然而化学农药的毒性和残留等问题日益突出，严重威胁人畜健康和环境安全。近年来利用拮抗细菌防治番茄灰霉病研究较多，主要侧重于生防菌株筛选、防效、定殖以及抗菌物质方面，所报道的菌株以芽孢杆菌为主，其生防机制主要包括营养和位点竞争、抗菌物质的拮抗和诱导植物抗病性[2-8]。近年来，由于植物诱导抗病性具有广谱性，被认为是植物病害防治新方式，因此对于芽孢杆菌诱导植物抗病性的研究日益增多[9-10]。研究表明，芽孢杆菌诱导植物抗病性因菌株而异，其诱导抗病性反应的信号识别与传导途径、生理生化反应模式等复杂多样。植物防御酶系活性变化是生防细菌诱导植物产生抗病性的重要生理生化反应，涉及的主要防御酶包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、几丁质酶（Chitinase）、β 1，3葡聚糖酶（β 1，3 Glucanase）和脂氧合酶（LOX）等，大量研究表明，植物受诱导因子刺激后这些酶活性增强[11]。水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）是植物抗病信号转导途径中的2个重要信号分子，其含量与植物抗病性成正相关[12]。
内生细菌因与植物具有很好的亲和性，成为近年来备受关注的一类重要生防菌株。内生细菌TF28是笔者从大豆根部分离到的一株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，对大豆根腐病菌、水稻恶苗病菌、番茄灰霉病菌等10多种植物病原真菌具有很好的拮抗作用，能够产生抗菌蛋白和脂肽类抗生素等多种抗菌物质[13]。温室试验发现苗期喷洒TF28菌液能够提高番茄抗灰霉病能力。笔者以苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、过氧化物酶、脂氧合酶、几丁质酶和β-1，3葡聚糖酶以及水杨酸和茉莉酸为指标，明确内生细菌TF28处理后番茄叶片6种防御酶活性和2种抗病信号分子含量变化情况，为阐明内生细菌TF28诱导番茄抗灰霉病机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
内生细菌Bacillus amyloliquefaciens TF28分离自大豆根部，是一株具有广谱抑菌作用的生防菌株。番茄灰霉病菌Botrytis cinerea分离自感病番茄果实。番茄品种为东农713。 1.2 番茄灰霉病菌孢子悬浮液的制备
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1.3 TF28菌液制备
挑取一环-70 ℃保存的TF28菌液划线接种至NYD平板，30 ℃过夜培养，次日取单菌落转接于5 ml NYD液体培养基中，30 ℃、200 r/min 振荡培养18 h，作为种子液。将种子液按2%接种量转接于100 ml NYD液体培养基中，30 ℃、200 r/min振荡培养36 h，活菌计数后用无菌水稀释至2×108 cfu/ml的菌悬液备用。
1.4 盆栽试验设计
挑选饱满番茄种子，用清水浸泡5 h，催芽后播种，每盆1粒，保持适宜温度、湿度和栽培管理，用第5片真叶作为研究对象，设4个处理，每个处理20株。①病菌处理：喷洒灰霉病菌孢子悬液；②内生细菌处理：将TF28菌液添加0.02%吐温80后喷施番茄叶片；③先接病菌后接内生细菌处理：喷施番茄灰霉病菌孢子1d后再喷洒TF28菌液；④空白对照：只喷洒清水。处理后分别在1、2、3、4、5、6、7 d取各处理叶片测定防御酶活性和抗病分子含量。
1.5 防御酶活性测定
取0.2 g番茄叶片用于提取粗酶。苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）活性测定参照文献[14]，几丁质酶（Chitinaes）和β1，3葡聚糖酶（β1，3glucanase）活性测定参照文献[15]，脂氧合酶活性测定参照文献[16]。
1.6 水杨酸和茉莉酸含量测定
取0.2 g番茄叶片，参照文献[17]方法提取水杨酸，参照文献[18]方法提取茉莉酸，用上海裕平生物科技有限公司的酶联免疫试剂盒测定水杨酸和茉莉酸含量，按照说明书进行。
2 结果与分析
2.1 内生细菌TF28对番茄叶片PAL活性的影响
由图1可知，内生细菌TF28和灰霉病菌单独以及共同处理后PAL活性显著增强。3个处理酶活性变化规律相似，均在第2天活性最大，分别为对照的2.7、2.3和3.6倍，第7天活性最小，分别为对照的1.6、1.1和1.8倍。TF28和灰霉病菌共同处理PAL活性显著高于两者单独处理，其最大活性比TF28和灰霉病菌单独处理高29.3%和55.2%。TF28单独处理PAL活性高于灰霉病菌单独处理。表明内生细菌TF28和灰霉病菌均能诱导番茄叶片PAL活性增强，TF28的诱导能力强于灰霉病菌，TF28和灰霉病菌共同诱导具有协同增效作用。
3 结论与讨论
PAL、POD、PPO、LOX、Chitinase和β-1，3Glucanase是植物诱导抗病反应中的主要防御酶，PAL、POD、PPO和LOX参与抗菌物质植保素和木质素合成，Chitinase和β-1，3Glucanase水解病原真菌细胞壁[19-20]，研究发现防御酶活性与植物诱导抗病性呈正相关性。薛玉潇等[21]研究发现香蕉根部接种生防枯草芽孢杆菌后，香蕉叶片PAL、POD和PPO活性显著提高；王淑霞等研究发现哈茨木霉Tr-92处理黄瓜根部，黄瓜叶片PAL、POD、PPO、Chitinase和β-1，3Glucanase活性显著提高[22]。该研究用内生细菌TF28喷洒番茄叶片后，番茄叶片PAL、POD、PPO、LOX、Chitinase和β-1，3Glucanase活性显著提高，与已有报道一致，说明这些防御酶在内生细菌诱导番茄抗灰霉病过程中起重要作用。6种防御酶活性变化规律和最高活性峰出现时间不同，PPO活性在接种后1 d立即达到最大，POD活性缓慢升高，在第7天达到最大，PAL活性在第2天达到最大，LOX、Chitinase和Glucanase活性均在第5天达到最大，这些酶活性高峰出现时间的异同可能与其在抗病反应中所起作用早晚有关。在酶活性增加幅度上，除Chitinase之外，内生细菌TF28处理后其他5种酶活性高于灰霉病菌单独接种；内生细菌与灰霉病菌共同处理PAL、PPO和Chitinase活性高于TF28单独处理，POD、LOX和Glucanase活性与TF28单独处理相当，说明先接种灰霉病菌可增强内生细菌对番茄灰霉病诱导抗性。
PAL和LOX除参与抗菌物质生成，还参与抗病信号分子合成，PAL参与SA合成，LOX参与JA合成[23]。内生细菌TF28处理后， PAL活性和SA含量均提高，PAL活性在第2天最大，然后下降，SA含量在第3天最大；LOX活性在第2天活性较高，第5天活性最高，而JA含量在第3天最高，然后下降，推测喷洒内生细菌1～3 d PAL主要参与SA合成，LOX主要参与JA合成，4～7 d两者主要参与抗菌物质合成。
植物体内存在多条抗病信号传导途径，水杨酸和茉莉酸介导途径是植物诱导抗病信号传导2个主要途径，不同诱导因子诱导的植物抗病信号传导途径不同， 2种途径存在拮抗和协同现象[24]。水杨酸和茉莉酸是植物抗病信号传导途径中的2个重要抗病信号分子，其含量与植物抗病性呈正相关。内生细菌TF28诱导后番茄叶片中水杨酸和茉莉酸含量均升高，推测内生细菌TF28诱导番茄抗灰霉病信号传导途径包括水杨酸和茉莉酸2种途径，且2种途径具有协同作用。
参考文献
[1]
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