论文部分内容阅读
摘要细菌菌壳（Bacterial ghosts，BGs）是一种不含细胞质和核酸成分的细菌空壳。近年来，研究证实BGs表面保留了大量完整的天然免疫模式识别受体的激动剂，可作为免疫佐剂诱导机体免疫或非免疫细胞分泌细胞因子，进而激活适应性免疫应答。除此之外，BGs还可装配蛋白和核酸以提高外源抗原的免疫原性。主要介绍了BGs制备技术、佐剂效应机制以及应用潜能的最新研究进展。
关键词细菌菌壳；制备技术；免疫佐剂；应用潜能
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2017）31-0151-03
AbstractBacterial ghosts （BGs） are a group of hollow bacterial envelopes containing neither cytoplasm nor nucleotide contents. BGs are proved to retain large amounts of intact ligands of pattern recognition receptors， which functions as adjuvants to induce proinflammatory cytokine production by immune and nonimmune cell. These cytokines will further assist the activation of adaptive immune response. In addition， proteins and nucleotides can also be equipped into BGs to achieve elevated immunogenicity. In this review， recent advances in BGs production， adjuvant function mechanisms and new applications were discussed in detail.
Key wordsBacterial ghosts；Preparation techniques；Immune adjuvants；Application potential
早在1982年，Henrich B等[1]就已经发现大肠杆菌噬菌体裂解酶可使大肠杆菌裂解死亡并且在电镜显示下呈现鬼影（Ghosts）模样，并进一步证实其中的裂解E蛋白具有在细菌细胞膜上打孔的功能，其被命名为Bacterial Ghosts（BGs）。我国于2004年才开始有BGs的研究报道，有专家学者将其意译为细菌菌影、菌蜕或菌壳[2-4]。如今的BGs是由噬菌体phiX174裂解E蛋白作用革兰氏阴性菌细胞膜后而形成的细菌空壳形态[5]。电镜下的BGs展现了其完整结构，如外膜蛋白、黏附素、脂多糖和肽聚糖等[6]，保留了细菌表面的有效抗原表位，可作为新型灭活细菌预防细菌性传染病。目前，已制备了多种不同革兰氏阴性菌菌壳并证实其具有良好的免疫原性[4，7-25]，而随着BGs研究的深入，BGs介导的免疫佐剂效应机制以及新型载体递送平台的应用也越来越受到研究人员的关注[26]。该研究主要介绍了BGs的制备技术、佐剂效应机制以及应用潜能的最新研究进展。
1细菌菌壳的制备技术
目前，BGs的制备技术已应用于多种革兰氏阴性菌，如大肠杆菌[7，14，23，27]、沙门氏菌[12，18-19，25]、布鲁氏菌[4，8，28-29]、维氏气单胞菌[15]、霍乱弧菌[20]、克雷伯氏菌[13]、副猪嗜血杆菌[13，17]、胸膜肺炎放线杆菌[16，21]、迟缓爱德华菌[24]、多杀性巴氏杆菌[22]、柱状黄杆菌[11]等，均可达到可观的裂解效果，通常再采取反复冻融或高渗溶液处理即可获得细菌菌壳，以此作为非变性灭活菌苗相比传统甲醛灭活菌苗具有理想的免疫原性。
BGs的制备主要基于噬菌体phiX174裂解E基因的表达，在细菌的两极或中部形成1～2个直径为40～200 nm的跨膜孔道[5]，通过温控敏感部件cI857阻遏蛋白在常温28 ℃及以下可抑制E基因的表达，通过提高培养温度致使阻遏蛋白失活，进而促使裂解酶发挥活性。这通常依赖特定或广宿主重组质粒的导入进而诱导目的基因的表达。吴幼[27]基于蓝白斑筛选技术将裂解E基因插入大肠杆菌LacZ序列中，利用菌落颜色筛选获得非智力依赖性的菌壳株。钱晶等[4，30]采用同源重组技术经正、负向筛选后将温控裂解部件插入犬布鲁氏菌基因组中的B0419基因，通过42 ℃诱导表达获得非質粒依赖型的布鲁氏菌菌壳；与此同时，付立霞[10]采用同源重组技术制备获得嗜水气单胞菌菌壳。上述2种菌壳制备技术克服了过去依赖抗性标记质粒表达的局限性，如抗生素抗性基因的残留和重组质粒的遗传不稳定等因素。另外，管玲玉[31]报道了一种营养诱导型的裂解系统，即通过限铁诱导启动子PviuB控制裂解E基因的表达效率，最终基于该系统制备了鳗弧菌菌壳。除了通过裂解E基因表达系统以外，胡本钢[13]采用抗菌肽配合超高压装置，分别制备了副猪嗜血杆菌菌壳和肺炎克雷伯氏菌菌壳，其免疫原性均优于常规灭活菌苗。然而，无论是采用基因工程手段还是物理化学方法制备菌壳，其目的都是获得完整的细菌空壳，这是保证细菌本身的免疫原性及其表面免疫激动分子功能活性的重要前提。
2细菌菌壳作为佐剂的作用机制
免疫佐剂通常是通过刺激宿主机体免疫细胞表面的天然免疫受体进而增强疫苗的免疫原性[32]。其中，天然免疫细胞通过一系列模式识别受体，如Toll样受体（TLR）识别细菌、病毒、寄生虫以及霉菌感染等多种刺激进而介导免疫应答反应[33]。例如TLR2/4识别细菌脂多糖（LPS）和脂磷壁酸质（TLR-2/4）、TLR9识别CpGDNA、TLR5识别鞭毛蛋白等[34-36]。近些年，细菌的某些成分具有增强弱抗原性疫苗的免疫应答能力，已经被应用到疫苗的研制当中。 BGs的产生属于非变性，保留了完整的细胞膜和细胞壁结构，这其中包含已知的免疫刺激成分（LPS、鞭毛等），是一类十分有潜力的高效免疫佐剂[6，37]。BGs的这些胞外结构能够有效地被免疫细胞或非免疫细胞所识别与递呈[38]，主要通过TLR2和TLR4信号通路激活免疫细胞，包括诱导树突状细胞（Dendritic cells，DCs）的活化与成熟，进而促使其向淋巴器官T细胞区域的募集；BGs通过TLR2和TLR4接头分子经依赖MyD88或TRIF途径（非依赖MyD88）将信号传递给下游MAPK或IkB级联分子，激活核内转录因子，如NF-kB、AP-1、IRF3/7，最终产生各种促炎细胞因子和趋化因子等[39-41]。
DCs作为专职的抗原递呈细胞，能有效摄取和加工BGs，介导促炎细胞因子的产生，随后上调DC细胞的共刺激因子表达，进而有利于将外源抗原高效地递呈给未致敏T细胞[42-43]。研究发现BGs能向DCs提供有效的早期成熟信号，大量分泌Th1细胞因子（特别是IL-12），进而激活NK和Th1细胞[43]。另外，在DCs接触BGs 12 h后，DCs表面MHC-II的表达水平显著上调[42-43]，表明BGs具有激发早期免疫应答反应的潜力，这对于紧急免疫接种策略或许又是一个新发现。不仅如此，BGs的LPS还能够增强DCs细胞MHC-I的表达，使DCs将抗原多肽交叉递呈给CD8+T细胞，从而有助于诱导有效的细胞毒性T细胞应答[44-45]。菌壳能够上调DCs表面细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的表达，这为激发高效CD8+T细胞反应提供必要基础[46]。研究发现沙门氏菌BGs和肠炎沙门氏菌BGs均引起有效的CD8+T细胞应答，并保护免疫的禽免受致死性剂量强毒株的攻击[18-19]。除了能够作用于DC细胞，BGs也能有效地激活单核细胞和巨噬细胞，并且能促进免疫反应趋向Th1型应答发展[47]。此外，BGs诱导许多淋巴和非淋巴细胞产生细胞因子和趋化因子，促使T、B淋巴细胞和免疫细胞向淋巴结的回流和迁移，从而充分与同源抗原接触激发免疫应答。这些结果表明BGs的自身免疫佐剂效应使其能有效地诱导机体产生体液免疫及细胞免疫反应。
BGs也可以刺激非专职抗原递呈细胞，如结膜上皮细胞、成纤维细胞、角蛋白细胞、黑色素瘤细胞等[38，48-50]。因此，BGs能够提供非特异性的抗病原微生物的能力，并且BGs也能利用TLR5分子（識别鞭毛）激活下游信号通路。Abtin等发现野生型大肠杆菌（NK9373）的菌壳比突变的无鞭毛大肠杆菌菌壳更容易被角蛋白细胞所捕获[48]，这表明细菌鞭毛蛋白能够通过TLR5或炎症小体介导细胞活化途径进而激活任意一种信号通路[51]。另外，BGs还能作用于淋巴细胞。利用放线杆菌BGs体外刺激T细胞以后，能够检测到特异性的T细胞应答反应。Felnerova等[52]研究结果也表明，BGs能够诱导T细胞增殖，并且在抗原递呈细胞的辅助下其激活T细胞增殖能力强于单独BGs刺激组。因此，BGs不仅可以通过抗原递呈细胞活化T细胞，还可以通过TLR分子直接活化T细胞。
目前，BGs作为免疫佐剂的最大原因主要是包含LPS。Means等[53]研究发现，经过鞭毛处理的DCs相比LPS处理的DCs具有较弱的递呈T细胞能力，但也能介导T细胞分泌细胞因子。Jawale等[54]研究发现含有大肠杆菌热不稳定B亚基肠毒素的沙门氏菌BGs比单独BGs具有更有效地诱导体液和细胞免疫应答的能力。
3细菌菌壳的应用潜能
大多免疫细胞或上皮细胞普遍表达TLR4和TLR5，作为其配体的LPS和鞭毛在BGs上固有存在，这使得BGs能够有效地诱导黏膜免疫应答。BGs本身的佐剂属性使之成为潜在的载体平台，可在其表面装配外源蛋白或在其内部装载DNA片段。另外，BGs的靶向性也使其成为装载小分子药物的良好载体[26]。
目前，已报道用于装载DNA疫苗的BGs有溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica，M.haemolytica）和伤寒沙门氏杆菌（Salmonella typhi，S.typhi）[47]。Ebensen等[42]于2004年证明在M.haemolytica BGs中装载DNA可显著增强APC对DNA的摄取，且能诱导更强的特异性体液和细胞免疫反应，并使初始型Th细胞向Th2型细胞分化，这有利于机体消除持续性感染。另外S.typhi Ty21a BGs可以协助HIV gp140 DNA被小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬，在体内试验中诱导小鼠产生更好的黏膜免疫反应，这对HIV疫苗的研制具有重要的意义[55]。
然而，BGs作为蛋白载体平台的应用更为常见，Chan等[56]在S.typhi BGs表面分别表达产肠毒性大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）的菌毛蛋白 K88ab、K88ac、K99和 FasA，该嵌合BGs免疫小鼠后14 d，血清IgG和粪便IgA都有显著上升，且肠道抗原特异性B淋巴细胞、脾脏淋巴细胞均有显著上升。Cai等[57]在E.coli外膜表面表达线性Stx2Am-Stx1B，该嵌合BGs不仅能诱导更高水平的血液IgA或IgG，还较单独BGs组提供更好的免疫保护效果。
通过黏膜免疫途径对机体进行免疫是当前黏膜疫苗研究的热点，但由于缺乏通过此途径激发足够有效的免疫原，因此一直处于瓶颈阶段。BGs作为候选疫苗的一大优势就在于其能够引起有效的抗原特异性黏膜免疫和系统性免疫反应[26，57]。其中以幽门螺旋杆菌为载体的口服疫苗研究尤为突出，Talebkhan等[58]在幽门螺旋杆菌BGs表面装载了其自身的一种保护性抗原Omp18蛋白，经口服免疫小鼠后，小鼠产生高水平抗Omp18抗体，另外还发现活的幽门螺旋杆菌在胃部的数量也显著减少。 BGs这类微小颗粒同样易于被抗原递呈细胞摄取，因此也常被用作装载酶类、抗生素、抗肿瘤药物[26，37，42]。研究表明，BGs装载的酶类仍具有其酶活性，通过装载特定的酶类，BGs不但有助于治疗酶类缺失造成的代谢紊乱，还能通过装载带有偏嗜性的酶类调节肠道菌群[59]。除此之外，Paukner等[60]成功借助M.haemolytica BGs装载抗肿瘤因子doxorubicin（DOX），使其靶向人结肠腺癌细胞，其抗癌效果显著优于单独使用DOX，并未对健康细胞造成病理性损伤。由此可见，保留了细菌生物学活性的BGs的应用潜能在不断被挖掘。
4展望
BGs是一类具有良好安全性和免疫原性的新型灭活细菌，完整保留了其表面结构，使其具备自体免疫佐剂的特征，基于BGs载体平台为开发多联嵌合疫苗、靶向疫苗以及肿瘤免疫治疗提供了新策略。
参考文献
[1] HENRICH B，LUBITZ W，PLAPP R.Lysis of Escherichia coli by induction of cloned X174 genes[J].Molecular & general genetics，1982，185（3）：493-497.
[2] 蔡昆，王慧.细菌菌蜕的研究进展[J].中国生物制品学杂志，2009，22（3）：297-300.
[3] 张瑞平，张兆山.细菌菌蜕作为新颖药物递送体系的研究进展[J].生物化学与生物物理进展，2006，33（7）：622-626.
[4] 钱晶.犬布鲁氏菌菌壳疫苗株的构建及实验免疫研究[D].长春：吉林农业大学，2014.
[5] WITTE A，WANNER G，HALFMANN G，et al.Endogenous transmembrane tunnel formation mediated by phi X174 lysis protein E[J].Journal of bacteriology，1990，172（7）：4109-4114.
[6] LUBITZ W，HUTER V.Bacterial ghosts as carrier and targeting vehicles[J].Expert review of vaccines，2003，2（1）：45-51.
[7] 王文东.致病性大肠杆菌菌壳的研究[D].长春：吉林大学，2010.
[8] 劉爽.布氏杆菌菌壳的制备及其特性研究[D].长春：吉林大学，2011.
[9] 钱晶，尹秋丹，卜昭阳，等.犬布鲁氏菌菌壳疫苗的制备[J].中国畜牧兽医，2014，41（1）：38-43.
[10] 付立霞.嗜水气单胞菌非质粒依赖性菌蜕疫苗的研制及评价[D].南京：南京农业大学，2012.
[11] 祝文兴.柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）菌蜕疫苗的研究[D].济南：山东师范大学，2012.
[12] 温晶，寇志华，于虹，等.人伤寒沙门菌Ty21a菌蜕的制备[J].中国人兽共患病学报，2011，27（6）：479-483.
[13] 胡本钢.应用抗菌肽-超高压制备肺炎克雷伯菌和副猪嗜血杆菌菌影方法的建立[D].长春：吉林大学，2012.
[14] 马跃.大肠杆菌菌蜕技术及其初步应用研究[D].广州：中山大学，2009.
[15] 徐展.维氏气单胞菌菌蜕的构建及免疫效力评价[D].长春：吉林农业大学，2014.
[16] 常月红.胸膜肺炎放线杆菌菌影（Ghost）的制备及其免疫效力评价[D].哈尔滨：东北农业大学，2008.
[17] 胡明明，常月红，张艳禾，等.副猪嗜血杆菌菌影的制备[J].中国预防兽医学报，2011，33（1）：11-14.
[18] JAWALE C V，JOHN HWA L.Comparative evaluation of Salmonella Enteritidis ghost vaccines with a commercial vaccine for protection against internal egg contamination with Salmonella[J].Vaccine，2014，32（45）：5925-5930.
[19] CHAUDHARI A A，JAWALE C V，WOONG K S，et al.Construction of a Salmonella Gallinarum ghost as a novel inactivated vaccine candidate and its protective efficacy against fowl typhoid in chickens[J].Veterinary research，2012，43（1）：44.
[20] EKO F O，LUBITZ W，MCMILLAN L，et al.Recombinant Vibrio cholerae ghosts as a delivery vehicle for vaccinating against Chlamydia trachomatis[J].Vaccine，2003，21（15）：1694-1703.
[21] HENSEL A，HUTER V，KATINGER A，et al.Intramuscular immunization with genetically inactivated（ghosts）Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 9 protects pigs against homologous aerosol challenge and prevents carrier state[J].Vaccine，2000，18（26）：2945-2955. [22] MARCHART J，DROPMANN G，LECHLEITNER S，et al.Pasteurella multocidaand Pasteurella haemolyticaghosts：New vaccine candidates[J].Vaccine，2003，21（25/26）：3988-3997.
[23] MAYR U B，HALLER C，HAIDINGER W，et al.Bacterial ghosts as an oral vaccine：A single dose of Escherichia coli O157：H7 bacterial ghosts protects mice against lethal challenge[J].Infection & immunity，2005，73（8）：4810-4817.
[24] KWON S R，NAM Y K，KIM S K，et al.Protection of tilapia（Oreochromis mosambicus）from edwardsiellosis by vaccination with Edwardsiella tarda ghosts[J].Fish & shellfish immunology，2006，20（4）：621-626.
[25] PENG W，SI W，YIN L，et al.Salmonella enteritidis ghost vaccine induces effective protection against lethal challenge in specificpathogenfree chicks[J].Immunobiology，2011，216（5）：558-565.
[26] HAJAM I A，DAR P A，WON G，et al.Bacterial ghosts as adjuvants：Mechanisms and potential[J].Veterinary research，2017，48（1）：37.
[27] 吳幼.非质粒依赖型菌蜕疫苗及其中药免疫佐剂的研究[D].重庆：西南大学，2008.
[28] 张瑞安.粗糙型布鲁氏菌菌壳的制备及其免疫学特性研究[D].长春：吉林农业大学，2013.
[29] 卜昭阳.羊布鲁氏菌UGPase缺失株的构建及菌壳的免疫特性研究[D].长春：吉林农业大学，2016.
[30] QIAN J，BU Z Y，LANG X L，et al.A safe and moleculartagged Brucella canis ghosts confers protection against virulent challenge in mice[J].Veterinary microbiology，2017，204：121-128.
[31] 管玲玉.基于体内诱导裂解系统的大肠杆菌和鳗弧菌载体疫苗设计与构建[D].上海：华东理工大学，2013.
[32] HAJAM I A，DAR P A，CHANDRASEKAR S，et al.Coadministration of flagellin augments immune responses to inactivated footandmouth disease virus（FMDV）antigen[J].Research in veterinary science，2013，95（3）：936-941.
[33] KUMAR H，KAWAI T S.Tolllike receptors and innate immunity[J].Journal of molecular medicine，2009，388（4）：621-625.
[34] MEDZHITOV R，JANEWAY C Jr.Innate immune recognition：Mechanisms and pathways[J].Immunoical reviews，2000，173（1）：89-97.
[35] KAWAI T，AKIRA S.Tolllike receptors and their crosstalk with other innate receptors in infection and immunity[J].Immunity，2011，34（5）：637-650.
[36] AKIRA S，HEMMI H.Recognition of pathogenassociated molecular patterns by TLR family[J].Immunology letters，2003，85（2）：85-95.
[37] MAYR U B，WALCHER P，AZIMPOUR C，et al.Bacterial ghosts as antigen delivery vehicles[J].Advanced drug delivery reviews，2005，57（9）：1381-1391.
[38] STEIN E，INICKANADA A，BELIJ S，et al.In vitro and in vivo uptake study of Escherichia coli Nissle 1917 bacterial ghosts：Cellbased delivery system to target ocular surface diseases[J].Investigative ophthalmology & visual science，2013，54（9）：6326-6333. [39] BENKO S，MAGYARICS Z，SZAB A，et al.Dendritic cell subtypes as primary targets of vaccines：The emerging role and crosstalk of pattern recognition receptors[J].Biological chemistry，2008，389（5）：469-485.
[40] ADAM E，DELBRASSINNE L，BOUILLOT C，et al.Probiotic Escherichia coli Nissle 1917 activates DC and prevents house dust mite allergy through a TLR4dependent pathway[J].European journal of immunology，2010，40（7）：1995-2005.
[41] QUEVEDODIAZ M A，SONG C，XIONG Y，et al.Involvement of TLR2 and TLR4 in cell responses to Rickettsia akari[J].Journal of leukocyte biology，2010，88（4）：675-685.
[42] EBENSEN T，PAUKNER S，LINK C，et al.Bacterial ghosts are an efficient delivery system for DNA vaccines[J].Journal of immunology，2004，172（11）：6858-6865.
[43] AHMED H I，AHMAD D P，ELAMURUGAN A，et al.Bacterial ghosts of Escherichia coli drive efficient maturation of bovine monocytederived dendritic cells[J].PLoS One，2015，10（12）：144397.
[44] TROMBETTA E S，EBERSOLD M，GARRETT W，et al.Activation of lysosomal function during dendritic cell maturation[J].Science，2003，299（5611）：1400-1403.
[45] TROMBETTA E S，MELLMAN I.Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo[J].Annual review of immunology，2005，23：975-1028.
[46] LEFOR A T，FABIAN D F.Enhanced cytolytic activity of tumor infiltrating lymphocytes（TILs）derived from an ICAM1 transfected tumor in a murine model[J].Journal of surgical research，1998，75（1）：49-53.
[47] TABRIZI C A，WALCHER P，MAYR U B，et al.Bacterial ghostsbiological particles as delivery systems for antigens，nucleic acids and drugs[J].Current opinion in biotechnology，2004，15（6）：530-537.
[48] ABTIN A，KUDELA P，MAYR U B，et al.Escherichia coli ghosts promote innate immune responses in human keratinocytes[J].Biochemical & biophysical research communications，2010，400（1）：78-82.
[49] KUDELA P，PAUKNER S，MAYR U B，et al.Effective gene transfer to melanoma cells using bacterial ghosts[J].Cancer letters，2008，262（1）：54-63.
[50] LANGEMANN T，KOLLER V J，MUHAMMAD A，et al.The bacterial ghost platform system：Production and applications[J].Bioengineered bugs，2010，1（5）：326-336.
[51] HYNES N.Bacterial flagellin：A novel adjuvant for vaccine strategies[M].Troms：University of Troms，2011.
[52] FELNEROVA D，KUDELA P，BIZIK J，et al.T cellspecific immune response induced by bacterial ghosts[J].Medical science monitor international medical journal of experimental & clinical research，2004，10（10）：362-370. [53] MEANS T K，HAYASHI F，SMITH K D，et al.The tolllike receptor 5 stimulus bacterial flagellin induces maturation and chemokine production in human dendritic cells[J].Journal of immunology，2003，170（10）：5165-5175.
[54] JAWALE C V，LEE J H.Salmonella enterica serovar enteritidis ghosts carrying the Escherichia coli heatlabile enterotoxin B subunit are capable of inducing enhanced protective immune responses[J].Clinical & vaccine immunology，2014，21（6）：799-807.
[55] WEN J，YANG Y，ZHAO G Y，et al.Salmonella typhi Ty21a bacterial ghost vector augments HIV1 gp140 DNA vaccineinduced peripheral and mucosal antibody responses via TLR4 pathway[J].Vaccine，2012，30（39）：5733-5739.
[56] CHAN S K，JIN H，EO S K，et al.Generation of Salmonella ghost cells expressing fimbrial antigens of enterotoxigenic Escherichia coli and evaluation of their antigenicity in a murine model[J].Canadian journal of veterinary research，2016，80（1）：40-48.
[57] CAI K，WEI T，LIU Y N，et al.Novel fusion antigen displayedbacterial ghosts vaccine candidate against infection of Escherichia coli O157：H7[J].Scientific reports，2015，5：17479.
[58] TALEBKHAN Y，BABABEIK M，ESMAEILI M，et al.Helicobacter pylori bacterial ghost containing recombinant Omp18 as a putative vaccine[J].Journal of microbiological methods，2010，82（3）：334-337.
[59] WITTE A，WANNER G，SULZNER M，et al.Dynamics of PhiX174 protein Emediated lysis of Escherichia coli[J].Archives of microbiology，1992，157（4）：381-388.
[60] PAUKNER S，KOHL G，LUBITZ W.Bacterial ghosts as novel advanced drug delivery systems：Antiproliferative activity of loaded doxorubicin in human Caco2 cells[J].Journal of controlled release，2004，94（1）：63-74.
关键词细菌菌壳；制备技术；免疫佐剂；应用潜能
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2017）31-0151-03
AbstractBacterial ghosts （BGs） are a group of hollow bacterial envelopes containing neither cytoplasm nor nucleotide contents. BGs are proved to retain large amounts of intact ligands of pattern recognition receptors， which functions as adjuvants to induce proinflammatory cytokine production by immune and nonimmune cell. These cytokines will further assist the activation of adaptive immune response. In addition， proteins and nucleotides can also be equipped into BGs to achieve elevated immunogenicity. In this review， recent advances in BGs production， adjuvant function mechanisms and new applications were discussed in detail.
Key wordsBacterial ghosts；Preparation techniques；Immune adjuvants；Application potential
早在1982年，Henrich B等[1]就已经发现大肠杆菌噬菌体裂解酶可使大肠杆菌裂解死亡并且在电镜显示下呈现鬼影（Ghosts）模样，并进一步证实其中的裂解E蛋白具有在细菌细胞膜上打孔的功能，其被命名为Bacterial Ghosts（BGs）。我国于2004年才开始有BGs的研究报道，有专家学者将其意译为细菌菌影、菌蜕或菌壳[2-4]。如今的BGs是由噬菌体phiX174裂解E蛋白作用革兰氏阴性菌细胞膜后而形成的细菌空壳形态[5]。电镜下的BGs展现了其完整结构，如外膜蛋白、黏附素、脂多糖和肽聚糖等[6]，保留了细菌表面的有效抗原表位，可作为新型灭活细菌预防细菌性传染病。目前，已制备了多种不同革兰氏阴性菌菌壳并证实其具有良好的免疫原性[4，7-25]，而随着BGs研究的深入，BGs介导的免疫佐剂效应机制以及新型载体递送平台的应用也越来越受到研究人员的关注[26]。该研究主要介绍了BGs的制备技术、佐剂效应机制以及应用潜能的最新研究进展。
1细菌菌壳的制备技术
目前，BGs的制备技术已应用于多种革兰氏阴性菌，如大肠杆菌[7，14，23，27]、沙门氏菌[12，18-19，25]、布鲁氏菌[4，8，28-29]、维氏气单胞菌[15]、霍乱弧菌[20]、克雷伯氏菌[13]、副猪嗜血杆菌[13，17]、胸膜肺炎放线杆菌[16，21]、迟缓爱德华菌[24]、多杀性巴氏杆菌[22]、柱状黄杆菌[11]等，均可达到可观的裂解效果，通常再采取反复冻融或高渗溶液处理即可获得细菌菌壳，以此作为非变性灭活菌苗相比传统甲醛灭活菌苗具有理想的免疫原性。
BGs的制备主要基于噬菌体phiX174裂解E基因的表达，在细菌的两极或中部形成1～2个直径为40～200 nm的跨膜孔道[5]，通过温控敏感部件cI857阻遏蛋白在常温28 ℃及以下可抑制E基因的表达，通过提高培养温度致使阻遏蛋白失活，进而促使裂解酶发挥活性。这通常依赖特定或广宿主重组质粒的导入进而诱导目的基因的表达。吴幼[27]基于蓝白斑筛选技术将裂解E基因插入大肠杆菌LacZ序列中，利用菌落颜色筛选获得非智力依赖性的菌壳株。钱晶等[4，30]采用同源重组技术经正、负向筛选后将温控裂解部件插入犬布鲁氏菌基因组中的B0419基因，通过42 ℃诱导表达获得非質粒依赖型的布鲁氏菌菌壳；与此同时，付立霞[10]采用同源重组技术制备获得嗜水气单胞菌菌壳。上述2种菌壳制备技术克服了过去依赖抗性标记质粒表达的局限性，如抗生素抗性基因的残留和重组质粒的遗传不稳定等因素。另外，管玲玉[31]报道了一种营养诱导型的裂解系统，即通过限铁诱导启动子PviuB控制裂解E基因的表达效率，最终基于该系统制备了鳗弧菌菌壳。除了通过裂解E基因表达系统以外，胡本钢[13]采用抗菌肽配合超高压装置，分别制备了副猪嗜血杆菌菌壳和肺炎克雷伯氏菌菌壳，其免疫原性均优于常规灭活菌苗。然而，无论是采用基因工程手段还是物理化学方法制备菌壳，其目的都是获得完整的细菌空壳，这是保证细菌本身的免疫原性及其表面免疫激动分子功能活性的重要前提。
2细菌菌壳作为佐剂的作用机制
免疫佐剂通常是通过刺激宿主机体免疫细胞表面的天然免疫受体进而增强疫苗的免疫原性[32]。其中，天然免疫细胞通过一系列模式识别受体，如Toll样受体（TLR）识别细菌、病毒、寄生虫以及霉菌感染等多种刺激进而介导免疫应答反应[33]。例如TLR2/4识别细菌脂多糖（LPS）和脂磷壁酸质（TLR-2/4）、TLR9识别CpGDNA、TLR5识别鞭毛蛋白等[34-36]。近些年，细菌的某些成分具有增强弱抗原性疫苗的免疫应答能力，已经被应用到疫苗的研制当中。 BGs的产生属于非变性，保留了完整的细胞膜和细胞壁结构，这其中包含已知的免疫刺激成分（LPS、鞭毛等），是一类十分有潜力的高效免疫佐剂[6，37]。BGs的这些胞外结构能够有效地被免疫细胞或非免疫细胞所识别与递呈[38]，主要通过TLR2和TLR4信号通路激活免疫细胞，包括诱导树突状细胞（Dendritic cells，DCs）的活化与成熟，进而促使其向淋巴器官T细胞区域的募集；BGs通过TLR2和TLR4接头分子经依赖MyD88或TRIF途径（非依赖MyD88）将信号传递给下游MAPK或IkB级联分子，激活核内转录因子，如NF-kB、AP-1、IRF3/7，最终产生各种促炎细胞因子和趋化因子等[39-41]。
DCs作为专职的抗原递呈细胞，能有效摄取和加工BGs，介导促炎细胞因子的产生，随后上调DC细胞的共刺激因子表达，进而有利于将外源抗原高效地递呈给未致敏T细胞[42-43]。研究发现BGs能向DCs提供有效的早期成熟信号，大量分泌Th1细胞因子（特别是IL-12），进而激活NK和Th1细胞[43]。另外，在DCs接触BGs 12 h后，DCs表面MHC-II的表达水平显著上调[42-43]，表明BGs具有激发早期免疫应答反应的潜力，这对于紧急免疫接种策略或许又是一个新发现。不仅如此，BGs的LPS还能够增强DCs细胞MHC-I的表达，使DCs将抗原多肽交叉递呈给CD8+T细胞，从而有助于诱导有效的细胞毒性T细胞应答[44-45]。菌壳能够上调DCs表面细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的表达，这为激发高效CD8+T细胞反应提供必要基础[46]。研究发现沙门氏菌BGs和肠炎沙门氏菌BGs均引起有效的CD8+T细胞应答，并保护免疫的禽免受致死性剂量强毒株的攻击[18-19]。除了能够作用于DC细胞，BGs也能有效地激活单核细胞和巨噬细胞，并且能促进免疫反应趋向Th1型应答发展[47]。此外，BGs诱导许多淋巴和非淋巴细胞产生细胞因子和趋化因子，促使T、B淋巴细胞和免疫细胞向淋巴结的回流和迁移，从而充分与同源抗原接触激发免疫应答。这些结果表明BGs的自身免疫佐剂效应使其能有效地诱导机体产生体液免疫及细胞免疫反应。
BGs也可以刺激非专职抗原递呈细胞，如结膜上皮细胞、成纤维细胞、角蛋白细胞、黑色素瘤细胞等[38，48-50]。因此，BGs能够提供非特异性的抗病原微生物的能力，并且BGs也能利用TLR5分子（識别鞭毛）激活下游信号通路。Abtin等发现野生型大肠杆菌（NK9373）的菌壳比突变的无鞭毛大肠杆菌菌壳更容易被角蛋白细胞所捕获[48]，这表明细菌鞭毛蛋白能够通过TLR5或炎症小体介导细胞活化途径进而激活任意一种信号通路[51]。另外，BGs还能作用于淋巴细胞。利用放线杆菌BGs体外刺激T细胞以后，能够检测到特异性的T细胞应答反应。Felnerova等[52]研究结果也表明，BGs能够诱导T细胞增殖，并且在抗原递呈细胞的辅助下其激活T细胞增殖能力强于单独BGs刺激组。因此，BGs不仅可以通过抗原递呈细胞活化T细胞，还可以通过TLR分子直接活化T细胞。
目前，BGs作为免疫佐剂的最大原因主要是包含LPS。Means等[53]研究发现，经过鞭毛处理的DCs相比LPS处理的DCs具有较弱的递呈T细胞能力，但也能介导T细胞分泌细胞因子。Jawale等[54]研究发现含有大肠杆菌热不稳定B亚基肠毒素的沙门氏菌BGs比单独BGs具有更有效地诱导体液和细胞免疫应答的能力。
3细菌菌壳的应用潜能
大多免疫细胞或上皮细胞普遍表达TLR4和TLR5，作为其配体的LPS和鞭毛在BGs上固有存在，这使得BGs能够有效地诱导黏膜免疫应答。BGs本身的佐剂属性使之成为潜在的载体平台，可在其表面装配外源蛋白或在其内部装载DNA片段。另外，BGs的靶向性也使其成为装载小分子药物的良好载体[26]。
目前，已报道用于装载DNA疫苗的BGs有溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica，M.haemolytica）和伤寒沙门氏杆菌（Salmonella typhi，S.typhi）[47]。Ebensen等[42]于2004年证明在M.haemolytica BGs中装载DNA可显著增强APC对DNA的摄取，且能诱导更强的特异性体液和细胞免疫反应，并使初始型Th细胞向Th2型细胞分化，这有利于机体消除持续性感染。另外S.typhi Ty21a BGs可以协助HIV gp140 DNA被小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬，在体内试验中诱导小鼠产生更好的黏膜免疫反应，这对HIV疫苗的研制具有重要的意义[55]。
然而，BGs作为蛋白载体平台的应用更为常见，Chan等[56]在S.typhi BGs表面分别表达产肠毒性大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）的菌毛蛋白 K88ab、K88ac、K99和 FasA，该嵌合BGs免疫小鼠后14 d，血清IgG和粪便IgA都有显著上升，且肠道抗原特异性B淋巴细胞、脾脏淋巴细胞均有显著上升。Cai等[57]在E.coli外膜表面表达线性Stx2Am-Stx1B，该嵌合BGs不仅能诱导更高水平的血液IgA或IgG，还较单独BGs组提供更好的免疫保护效果。
通过黏膜免疫途径对机体进行免疫是当前黏膜疫苗研究的热点，但由于缺乏通过此途径激发足够有效的免疫原，因此一直处于瓶颈阶段。BGs作为候选疫苗的一大优势就在于其能够引起有效的抗原特异性黏膜免疫和系统性免疫反应[26，57]。其中以幽门螺旋杆菌为载体的口服疫苗研究尤为突出，Talebkhan等[58]在幽门螺旋杆菌BGs表面装载了其自身的一种保护性抗原Omp18蛋白，经口服免疫小鼠后，小鼠产生高水平抗Omp18抗体，另外还发现活的幽门螺旋杆菌在胃部的数量也显著减少。 BGs这类微小颗粒同样易于被抗原递呈细胞摄取，因此也常被用作装载酶类、抗生素、抗肿瘤药物[26，37，42]。研究表明，BGs装载的酶类仍具有其酶活性，通过装载特定的酶类，BGs不但有助于治疗酶类缺失造成的代谢紊乱，还能通过装载带有偏嗜性的酶类调节肠道菌群[59]。除此之外，Paukner等[60]成功借助M.haemolytica BGs装载抗肿瘤因子doxorubicin（DOX），使其靶向人结肠腺癌细胞，其抗癌效果显著优于单独使用DOX，并未对健康细胞造成病理性损伤。由此可见，保留了细菌生物学活性的BGs的应用潜能在不断被挖掘。
4展望
BGs是一类具有良好安全性和免疫原性的新型灭活细菌，完整保留了其表面结构，使其具备自体免疫佐剂的特征，基于BGs载体平台为开发多联嵌合疫苗、靶向疫苗以及肿瘤免疫治疗提供了新策略。
参考文献
[1] HENRICH B，LUBITZ W，PLAPP R.Lysis of Escherichia coli by induction of cloned X174 genes[J].Molecular & general genetics，1982，185（3）：493-497.
[2] 蔡昆，王慧.细菌菌蜕的研究进展[J].中国生物制品学杂志，2009，22（3）：297-300.
[3] 张瑞平，张兆山.细菌菌蜕作为新颖药物递送体系的研究进展[J].生物化学与生物物理进展，2006，33（7）：622-626.
[4] 钱晶.犬布鲁氏菌菌壳疫苗株的构建及实验免疫研究[D].长春：吉林农业大学，2014.
[5] WITTE A，WANNER G，HALFMANN G，et al.Endogenous transmembrane tunnel formation mediated by phi X174 lysis protein E[J].Journal of bacteriology，1990，172（7）：4109-4114.
[6] LUBITZ W，HUTER V.Bacterial ghosts as carrier and targeting vehicles[J].Expert review of vaccines，2003，2（1）：45-51.
[7] 王文东.致病性大肠杆菌菌壳的研究[D].长春：吉林大学，2010.
[8] 劉爽.布氏杆菌菌壳的制备及其特性研究[D].长春：吉林大学，2011.
[9] 钱晶，尹秋丹，卜昭阳，等.犬布鲁氏菌菌壳疫苗的制备[J].中国畜牧兽医，2014，41（1）：38-43.
[10] 付立霞.嗜水气单胞菌非质粒依赖性菌蜕疫苗的研制及评价[D].南京：南京农业大学，2012.
[11] 祝文兴.柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）菌蜕疫苗的研究[D].济南：山东师范大学，2012.
[12] 温晶，寇志华，于虹，等.人伤寒沙门菌Ty21a菌蜕的制备[J].中国人兽共患病学报，2011，27（6）：479-483.
[13] 胡本钢.应用抗菌肽-超高压制备肺炎克雷伯菌和副猪嗜血杆菌菌影方法的建立[D].长春：吉林大学，2012.
[14] 马跃.大肠杆菌菌蜕技术及其初步应用研究[D].广州：中山大学，2009.
[15] 徐展.维氏气单胞菌菌蜕的构建及免疫效力评价[D].长春：吉林农业大学，2014.
[16] 常月红.胸膜肺炎放线杆菌菌影（Ghost）的制备及其免疫效力评价[D].哈尔滨：东北农业大学，2008.
[17] 胡明明，常月红，张艳禾，等.副猪嗜血杆菌菌影的制备[J].中国预防兽医学报，2011，33（1）：11-14.
[18] JAWALE C V，JOHN HWA L.Comparative evaluation of Salmonella Enteritidis ghost vaccines with a commercial vaccine for protection against internal egg contamination with Salmonella[J].Vaccine，2014，32（45）：5925-5930.
[19] CHAUDHARI A A，JAWALE C V，WOONG K S，et al.Construction of a Salmonella Gallinarum ghost as a novel inactivated vaccine candidate and its protective efficacy against fowl typhoid in chickens[J].Veterinary research，2012，43（1）：44.
[20] EKO F O，LUBITZ W，MCMILLAN L，et al.Recombinant Vibrio cholerae ghosts as a delivery vehicle for vaccinating against Chlamydia trachomatis[J].Vaccine，2003，21（15）：1694-1703.
[21] HENSEL A，HUTER V，KATINGER A，et al.Intramuscular immunization with genetically inactivated（ghosts）Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 9 protects pigs against homologous aerosol challenge and prevents carrier state[J].Vaccine，2000，18（26）：2945-2955. [22] MARCHART J，DROPMANN G，LECHLEITNER S，et al.Pasteurella multocidaand Pasteurella haemolyticaghosts：New vaccine candidates[J].Vaccine，2003，21（25/26）：3988-3997.
[23] MAYR U B，HALLER C，HAIDINGER W，et al.Bacterial ghosts as an oral vaccine：A single dose of Escherichia coli O157：H7 bacterial ghosts protects mice against lethal challenge[J].Infection & immunity，2005，73（8）：4810-4817.
[24] KWON S R，NAM Y K，KIM S K，et al.Protection of tilapia（Oreochromis mosambicus）from edwardsiellosis by vaccination with Edwardsiella tarda ghosts[J].Fish & shellfish immunology，2006，20（4）：621-626.
[25] PENG W，SI W，YIN L，et al.Salmonella enteritidis ghost vaccine induces effective protection against lethal challenge in specificpathogenfree chicks[J].Immunobiology，2011，216（5）：558-565.
[26] HAJAM I A，DAR P A，WON G，et al.Bacterial ghosts as adjuvants：Mechanisms and potential[J].Veterinary research，2017，48（1）：37.
[27] 吳幼.非质粒依赖型菌蜕疫苗及其中药免疫佐剂的研究[D].重庆：西南大学，2008.
[28] 张瑞安.粗糙型布鲁氏菌菌壳的制备及其免疫学特性研究[D].长春：吉林农业大学，2013.
[29] 卜昭阳.羊布鲁氏菌UGPase缺失株的构建及菌壳的免疫特性研究[D].长春：吉林农业大学，2016.
[30] QIAN J，BU Z Y，LANG X L，et al.A safe and moleculartagged Brucella canis ghosts confers protection against virulent challenge in mice[J].Veterinary microbiology，2017，204：121-128.
[31] 管玲玉.基于体内诱导裂解系统的大肠杆菌和鳗弧菌载体疫苗设计与构建[D].上海：华东理工大学，2013.
[32] HAJAM I A，DAR P A，CHANDRASEKAR S，et al.Coadministration of flagellin augments immune responses to inactivated footandmouth disease virus（FMDV）antigen[J].Research in veterinary science，2013，95（3）：936-941.
[33] KUMAR H，KAWAI T S.Tolllike receptors and innate immunity[J].Journal of molecular medicine，2009，388（4）：621-625.
[34] MEDZHITOV R，JANEWAY C Jr.Innate immune recognition：Mechanisms and pathways[J].Immunoical reviews，2000，173（1）：89-97.
[35] KAWAI T，AKIRA S.Tolllike receptors and their crosstalk with other innate receptors in infection and immunity[J].Immunity，2011，34（5）：637-650.
[36] AKIRA S，HEMMI H.Recognition of pathogenassociated molecular patterns by TLR family[J].Immunology letters，2003，85（2）：85-95.
[37] MAYR U B，WALCHER P，AZIMPOUR C，et al.Bacterial ghosts as antigen delivery vehicles[J].Advanced drug delivery reviews，2005，57（9）：1381-1391.
[38] STEIN E，INICKANADA A，BELIJ S，et al.In vitro and in vivo uptake study of Escherichia coli Nissle 1917 bacterial ghosts：Cellbased delivery system to target ocular surface diseases[J].Investigative ophthalmology & visual science，2013，54（9）：6326-6333. [39] BENKO S，MAGYARICS Z，SZAB A，et al.Dendritic cell subtypes as primary targets of vaccines：The emerging role and crosstalk of pattern recognition receptors[J].Biological chemistry，2008，389（5）：469-485.
[40] ADAM E，DELBRASSINNE L，BOUILLOT C，et al.Probiotic Escherichia coli Nissle 1917 activates DC and prevents house dust mite allergy through a TLR4dependent pathway[J].European journal of immunology，2010，40（7）：1995-2005.
[41] QUEVEDODIAZ M A，SONG C，XIONG Y，et al.Involvement of TLR2 and TLR4 in cell responses to Rickettsia akari[J].Journal of leukocyte biology，2010，88（4）：675-685.
[42] EBENSEN T，PAUKNER S，LINK C，et al.Bacterial ghosts are an efficient delivery system for DNA vaccines[J].Journal of immunology，2004，172（11）：6858-6865.
[43] AHMED H I，AHMAD D P，ELAMURUGAN A，et al.Bacterial ghosts of Escherichia coli drive efficient maturation of bovine monocytederived dendritic cells[J].PLoS One，2015，10（12）：144397.
[44] TROMBETTA E S，EBERSOLD M，GARRETT W，et al.Activation of lysosomal function during dendritic cell maturation[J].Science，2003，299（5611）：1400-1403.
[45] TROMBETTA E S，MELLMAN I.Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo[J].Annual review of immunology，2005，23：975-1028.
[46] LEFOR A T，FABIAN D F.Enhanced cytolytic activity of tumor infiltrating lymphocytes（TILs）derived from an ICAM1 transfected tumor in a murine model[J].Journal of surgical research，1998，75（1）：49-53.
[47] TABRIZI C A，WALCHER P，MAYR U B，et al.Bacterial ghostsbiological particles as delivery systems for antigens，nucleic acids and drugs[J].Current opinion in biotechnology，2004，15（6）：530-537.
[48] ABTIN A，KUDELA P，MAYR U B，et al.Escherichia coli ghosts promote innate immune responses in human keratinocytes[J].Biochemical & biophysical research communications，2010，400（1）：78-82.
[49] KUDELA P，PAUKNER S，MAYR U B，et al.Effective gene transfer to melanoma cells using bacterial ghosts[J].Cancer letters，2008，262（1）：54-63.
[50] LANGEMANN T，KOLLER V J，MUHAMMAD A，et al.The bacterial ghost platform system：Production and applications[J].Bioengineered bugs，2010，1（5）：326-336.
[51] HYNES N.Bacterial flagellin：A novel adjuvant for vaccine strategies[M].Troms：University of Troms，2011.
[52] FELNEROVA D，KUDELA P，BIZIK J，et al.T cellspecific immune response induced by bacterial ghosts[J].Medical science monitor international medical journal of experimental & clinical research，2004，10（10）：362-370. [53] MEANS T K，HAYASHI F，SMITH K D，et al.The tolllike receptor 5 stimulus bacterial flagellin induces maturation and chemokine production in human dendritic cells[J].Journal of immunology，2003，170（10）：5165-5175.
[54] JAWALE C V，LEE J H.Salmonella enterica serovar enteritidis ghosts carrying the Escherichia coli heatlabile enterotoxin B subunit are capable of inducing enhanced protective immune responses[J].Clinical & vaccine immunology，2014，21（6）：799-807.
[55] WEN J，YANG Y，ZHAO G Y，et al.Salmonella typhi Ty21a bacterial ghost vector augments HIV1 gp140 DNA vaccineinduced peripheral and mucosal antibody responses via TLR4 pathway[J].Vaccine，2012，30（39）：5733-5739.
[56] CHAN S K，JIN H，EO S K，et al.Generation of Salmonella ghost cells expressing fimbrial antigens of enterotoxigenic Escherichia coli and evaluation of their antigenicity in a murine model[J].Canadian journal of veterinary research，2016，80（1）：40-48.
[57] CAI K，WEI T，LIU Y N，et al.Novel fusion antigen displayedbacterial ghosts vaccine candidate against infection of Escherichia coli O157：H7[J].Scientific reports，2015，5：17479.
[58] TALEBKHAN Y，BABABEIK M，ESMAEILI M，et al.Helicobacter pylori bacterial ghost containing recombinant Omp18 as a putative vaccine[J].Journal of microbiological methods，2010，82（3）：334-337.
[59] WITTE A，WANNER G，SULZNER M，et al.Dynamics of PhiX174 protein Emediated lysis of Escherichia coli[J].Archives of microbiology，1992，157（4）：381-388.
[60] PAUKNER S，KOHL G，LUBITZ W.Bacterial ghosts as novel advanced drug delivery systems：Antiproliferative activity of loaded doxorubicin in human Caco2 cells[J].Journal of controlled release，2004，94（1）：63-74.