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摘要：本实验通过构建CDA1基因与PET－22b载体的重组体，成功地使其在大肠杆菌BL21中进行原核表达，并对表达后的产物做分析鉴定，得出如下结果： CDA1重组蛋白分子量约为47kD；重组质粒PET22b-CDA1的表达产物以包涵体形式存在。结论：实验成功构建了原核表达载体PET22b-CDA1，并获得重组CDA1蛋白。
关键词：原核表达；甲壳素脱乙酰酶；CDA1；重组质粒
前言
甲壳素的生物合成和分解代谢是在甲壳素相关酶的催化下进行的。这些酶存在于动物、植物和微生物中，在生物体内控制着各种生理功能，如机体保护和支持、防御机制、致病性、消化作用和生态平衡。近几年来，对这些酶的研究日益增多并十分活跃。今天甲壳素酶学研究比起甲壳素研究中其它专题进展更快，已成为甲壳素学中的一个重要分支。
本实验选取处于对数生长期末期的毛霉，通过构建原核表达载体PET22b-CDA1，诱导表达重组质粒以获得CDA1重组蛋白，并对其进行相应的鉴定。
1. 方法
1.1 PET22b 质粒的获得和质粒的双酶切。使用获得的PET22b 质粒，对于试剂盒抽提所得质粒溶液，进行双酶切反应，37℃保温反应3h以上，进行1.0%琼脂糖凝胶电泳后，回收、纯化双酶切的质粒片段。
1.2 重组质粒的构建。制备感受态大肠杆菌DH5α并转化将双酶切的DNA片段、双酶切的质粒混合，进行连接反应。22℃反应2h以上，转化入感受态大肠杆菌DH5α。将获得的DH5α菌液倒入含氨苄青霉素的抗性平板中。对抗性平板（不涂步IPTG和X-Gal）长出的单菌落进行PCR检验。
1.3 基因工程菌的构建。将含重组质粒的阳性单菌落，在抗性LB培养基中过夜培养后，抽提重组质粒，转化入感受态BL21（DE3）。抗性平板上长出白色菌落，用两套不同的引物，进行PCR验证，以确定阳性菌落。从阳性菌落（BL21-重组质粒）培养液中抽提重组质粒，重新用BamHⅠ、XhoⅠ两种内切酶进行双酶切反应，采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定双酶切产物。
1.4 重组质粒表达区域测序鉴定。将含有重组质粒的阳性单菌落（BL21-重组质粒）过夜培养，用8%甘油保存后送上海生工生物有限公司进行测序。对于PET22b系列重组质粒，选用：CDA1基因特异性引物（CDA1-SEQU-R） 5’-CCCAACTTGCGAACAGTGATA-3’，反向测序，获得表达区域部分序列。
1.5 基因工程菌的诱导表达。挑取重组菌落BL21(DE3)-PET-CDA1单菌落，于5ml抗性LB培养液中37℃ 、200rpm培养过夜。次日吸取菌液0.5ml，加入50ml抗性LB液体培养基的锥形烧瓶中，37℃、200rpm培养2h至细菌OD600约为0.6左右，采集1 ml菌液于EP管中，剩余菌液中加入IPTG，诱导培养4-6h，分别于诱导后一定时间间隔，测定OD600值后采集1ml菌液于EP管中，12000rpm离心30s后弃上清，沉淀菌体中加入100?l 1×蛋白电泳上样缓冲液，混匀后煮沸5 min，4℃保存待用。同时以相同方法诱导表达 BL21(DE3)-PET（空质粒）、BL21(DE3)（不含质粒）作对照。
1.6 重组蛋白表达形式鉴定。收集10ml IPTG诱导培养2-4h的细菌菌体，12,000rpm离心30s后弃上清，沉淀菌体中加入1ml PBS缓冲液，用枪头混匀重悬菌体，在冰浴中进行超声破碎。细菌破碎液以4℃、12，000rpm离心10 min，分别收集上清和沉淀；取100ul上清液于EP管中，加入等体积2×蛋白电泳上样缓冲液混匀后煮沸5 min，同时在沉淀中加入一定量的1×蛋白电泳上样缓冲液混匀后煮沸5 min，用于SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式[李立家，2002]。
1.7 重组蛋白表达的SDS-PAGE电泳分析。参照《PET system manual》、根据诱导后不同时间采集菌体前OD600值，将样品进行标准化处理，得到各样品的标准上样体积。浓缩胶（浓度是5%）电压为8V/cm，分离胶（浓度是12%）电压为15 V/cm，电泳至溴酚蓝到达分离胶底部，关闭电源取出凝胶，以考马斯亮蓝G-250染色液室温下染色4 h，然后以脱色液平缓摇动、充分脱色后观察蛋白条带。观察、拍照并分析实验结果。
2 结果及分析
2.1 重组质粒的双酶切鉴定。实验中构建了1个重组质粒，经过双酶切反应后，电泳结果均显示了预期的一大和一小两个亮带，其片段大小分别为>4kb和1.1-1.2kb，大片段为空质粒的双酶切产物，呈线形结构；而对照为直接抽提得到的重组质粒，片段稍大于前者，但主要呈超螺旋结构，所以两者的电泳速率仍然相当，在图中均未有明显区别。
2.2 重组质粒的测序鉴定。在得到了含PET22b-CDA1重组质粒的阳性菌落后，针对其表达区域，进行了序列测定，所测得序列与对应的序列比对。密码子是由3个连续的核苷酸所组成的，代表一种氨基酸。比较发现连接了CDA2-DNA片段以后，氨基酸表达并未出错，接入部分前面的第598（G），599（A），600（T）个碱基所表达的氨基酸仍为天冬氨酸（Asp）。由此可知，CDA1基因正确地接入了表达区域，未产生移码突变。
2.3 重組质粒在大肠杆菌中的表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳，在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小。实验中若不加入诱导物IPTG，阻遏蛋白处于活性状态，从而使重组质粒的BL21蛋白质不能表达；在诱导物IPTG存在的情况下，IPTG同阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白发生构象变化而处于失活状态，此时重组质粒的BL21才能够实现蛋白质表达。
3 讨论与小结
本实验把总状毛霉的CDA1基因经过双酶切后接入PET22b双酶切质粒，经过PCR鉴定、双酶切鉴定及序列测定分析后表明：已成功构建了PET22b-CDA1 这个重组质粒。将PET22b-CDA1这个重组质粒转化宿主菌大肠杆菌BL21（DE3）后，采用37℃、终浓度为0.5mmol/L 的IPTG诱导重组蛋白表达。实验结果表明：所得的重组蛋白或融合蛋白的分子量Mr值与预计的理论值相符（约为47.0KD），表达量较高。
由此得出：实验选用了BL21（DE3）/PET作为表达体系，可使 PET22b-CDA1这个外源基因在大肠杆菌中有较高的表达效率。
参考文献
[1]杜予民.甲壳素化学与应用的新进展[J]
[2]柴平海，张文清，金鑫荣. 甲壳素/壳聚糖开发研究的新动向[J]
[3]蔡俊,杜予民,生物法制备壳聚糖的研究进展,现代食品科技
关键词：原核表达；甲壳素脱乙酰酶；CDA1；重组质粒
前言
甲壳素的生物合成和分解代谢是在甲壳素相关酶的催化下进行的。这些酶存在于动物、植物和微生物中，在生物体内控制着各种生理功能，如机体保护和支持、防御机制、致病性、消化作用和生态平衡。近几年来，对这些酶的研究日益增多并十分活跃。今天甲壳素酶学研究比起甲壳素研究中其它专题进展更快，已成为甲壳素学中的一个重要分支。
本实验选取处于对数生长期末期的毛霉，通过构建原核表达载体PET22b-CDA1，诱导表达重组质粒以获得CDA1重组蛋白，并对其进行相应的鉴定。
1. 方法
1.1 PET22b 质粒的获得和质粒的双酶切。使用获得的PET22b 质粒，对于试剂盒抽提所得质粒溶液，进行双酶切反应，37℃保温反应3h以上，进行1.0%琼脂糖凝胶电泳后，回收、纯化双酶切的质粒片段。
1.2 重组质粒的构建。制备感受态大肠杆菌DH5α并转化将双酶切的DNA片段、双酶切的质粒混合，进行连接反应。22℃反应2h以上，转化入感受态大肠杆菌DH5α。将获得的DH5α菌液倒入含氨苄青霉素的抗性平板中。对抗性平板（不涂步IPTG和X-Gal）长出的单菌落进行PCR检验。
1.3 基因工程菌的构建。将含重组质粒的阳性单菌落，在抗性LB培养基中过夜培养后，抽提重组质粒，转化入感受态BL21（DE3）。抗性平板上长出白色菌落，用两套不同的引物，进行PCR验证，以确定阳性菌落。从阳性菌落（BL21-重组质粒）培养液中抽提重组质粒，重新用BamHⅠ、XhoⅠ两种内切酶进行双酶切反应，采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定双酶切产物。
1.4 重组质粒表达区域测序鉴定。将含有重组质粒的阳性单菌落（BL21-重组质粒）过夜培养，用8%甘油保存后送上海生工生物有限公司进行测序。对于PET22b系列重组质粒，选用：CDA1基因特异性引物（CDA1-SEQU-R） 5’-CCCAACTTGCGAACAGTGATA-3’，反向测序，获得表达区域部分序列。
1.5 基因工程菌的诱导表达。挑取重组菌落BL21(DE3)-PET-CDA1单菌落，于5ml抗性LB培养液中37℃ 、200rpm培养过夜。次日吸取菌液0.5ml，加入50ml抗性LB液体培养基的锥形烧瓶中，37℃、200rpm培养2h至细菌OD600约为0.6左右，采集1 ml菌液于EP管中，剩余菌液中加入IPTG，诱导培养4-6h，分别于诱导后一定时间间隔，测定OD600值后采集1ml菌液于EP管中，12000rpm离心30s后弃上清，沉淀菌体中加入100?l 1×蛋白电泳上样缓冲液，混匀后煮沸5 min，4℃保存待用。同时以相同方法诱导表达 BL21(DE3)-PET（空质粒）、BL21(DE3)（不含质粒）作对照。
1.6 重组蛋白表达形式鉴定。收集10ml IPTG诱导培养2-4h的细菌菌体，12,000rpm离心30s后弃上清，沉淀菌体中加入1ml PBS缓冲液，用枪头混匀重悬菌体，在冰浴中进行超声破碎。细菌破碎液以4℃、12，000rpm离心10 min，分别收集上清和沉淀；取100ul上清液于EP管中，加入等体积2×蛋白电泳上样缓冲液混匀后煮沸5 min，同时在沉淀中加入一定量的1×蛋白电泳上样缓冲液混匀后煮沸5 min，用于SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式[李立家，2002]。
1.7 重组蛋白表达的SDS-PAGE电泳分析。参照《PET system manual》、根据诱导后不同时间采集菌体前OD600值，将样品进行标准化处理，得到各样品的标准上样体积。浓缩胶（浓度是5%）电压为8V/cm，分离胶（浓度是12%）电压为15 V/cm，电泳至溴酚蓝到达分离胶底部，关闭电源取出凝胶，以考马斯亮蓝G-250染色液室温下染色4 h，然后以脱色液平缓摇动、充分脱色后观察蛋白条带。观察、拍照并分析实验结果。
2 结果及分析
2.1 重组质粒的双酶切鉴定。实验中构建了1个重组质粒，经过双酶切反应后，电泳结果均显示了预期的一大和一小两个亮带，其片段大小分别为>4kb和1.1-1.2kb，大片段为空质粒的双酶切产物，呈线形结构；而对照为直接抽提得到的重组质粒，片段稍大于前者，但主要呈超螺旋结构，所以两者的电泳速率仍然相当，在图中均未有明显区别。
2.2 重组质粒的测序鉴定。在得到了含PET22b-CDA1重组质粒的阳性菌落后，针对其表达区域，进行了序列测定，所测得序列与对应的序列比对。密码子是由3个连续的核苷酸所组成的，代表一种氨基酸。比较发现连接了CDA2-DNA片段以后，氨基酸表达并未出错，接入部分前面的第598（G），599（A），600（T）个碱基所表达的氨基酸仍为天冬氨酸（Asp）。由此可知，CDA1基因正确地接入了表达区域，未产生移码突变。
2.3 重組质粒在大肠杆菌中的表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳，在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小。实验中若不加入诱导物IPTG，阻遏蛋白处于活性状态，从而使重组质粒的BL21蛋白质不能表达；在诱导物IPTG存在的情况下，IPTG同阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白发生构象变化而处于失活状态，此时重组质粒的BL21才能够实现蛋白质表达。
3 讨论与小结
本实验把总状毛霉的CDA1基因经过双酶切后接入PET22b双酶切质粒，经过PCR鉴定、双酶切鉴定及序列测定分析后表明：已成功构建了PET22b-CDA1 这个重组质粒。将PET22b-CDA1这个重组质粒转化宿主菌大肠杆菌BL21（DE3）后，采用37℃、终浓度为0.5mmol/L 的IPTG诱导重组蛋白表达。实验结果表明：所得的重组蛋白或融合蛋白的分子量Mr值与预计的理论值相符（约为47.0KD），表达量较高。
由此得出：实验选用了BL21（DE3）/PET作为表达体系，可使 PET22b-CDA1这个外源基因在大肠杆菌中有较高的表达效率。
参考文献
[1]杜予民.甲壳素化学与应用的新进展[J]
[2]柴平海，张文清，金鑫荣. 甲壳素/壳聚糖开发研究的新动向[J]
[3]蔡俊,杜予民,生物法制备壳聚糖的研究进展,现代食品科技