【摘 要】
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目的 研究足细胞分子podocin、nephrin和α-actinin之间的相互作用和联系.方法将针对podocin分子设计的特异RNA干扰(RNAi)质粒导入体外培养的小鼠足细胞系(MPC5);应用免疫荧光染色及双标记在共聚焦显微镜下观察nephrin、podocin和α-actinin的分布方式;半定量RT-PCR和免疫蛋白印迹检测podocin、nephrin,α-actinin-4及内参照
【机 构】
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目的 研究足细胞分子podocin、nephrin和α-actinin之间的相互作用和联系.方法将针对podocin分子设计的特异RNA干扰(RNAi)质粒导入体外培养的小鼠足细胞系(MPC5);应用免疫荧光染色及双标记在共聚焦显微镜下观察nephrin、podocin和α-actinin的分布方式;半定量RT-PCR和免疫蛋白印迹检测podocin、nephrin,α-actinin-4及内参照GAPDH/β-actin在mRNA水平和蛋白水平的表达量.结果(1)干扰组podocin的荧光强度显著低于对照组,其mRNA和蛋白的表达量分别下降了65%和89%.免疫双标记显示podocin的分布发生了明显变化:对照组podocin不但分布在胞核的周围,而且在胞浆呈放射性沿着细胞骨架分布,以及主要在胞膜上呈连续性的线状分布;干扰组podocin呈点状分布在胞核周围.(2)干扰组nephrin的荧光强度亦明显减低,其mRNA及蛋白的表达量分别减少了70%和78%.免疫双标记显示nephrin的分布也发生了显著变化:干扰组nephrin亦呈点状分布在胞核周围;在对照组,nephrin和podocin的分布方式相同.(3)干扰组和对照组α-actinin的分布及在mRNA和蛋白水平上的表达量无明显差异,呈细丝状均匀分布于胞质内,亦呈放射性分布于足细胞伸出的突起中.结论通过RNAi成功地使MPC5的podocin表达下调.Podocin和nephrin分子关系紧密,可能存在着直接的分子间反应;podocin与α-actinin无直接的作用和联系。
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