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摘要： 从土壤中分离一株纤维素降解菌HIT-3，其降解纤维素还原糖产率可达16.34%。将其用于农作物秸秆预处理，使其中的纤维素大分子物质降解为小分子底物，降解产物再用于生产生物絮凝剂。试验证明，秸秆生物降解产物用于生产生物絮凝剂，絮凝效果良好，与葡萄糖底物发酵效果基本相同，最高絮凝率可达80.5%。采用秸秆生产生物絮凝剂，为降低生物絮凝剂的工业化生产成本提供了理论依据。
关键词： 秸秆；纤维素降解菌；两段式发酵；生物絮凝剂
Abstract: a strain isolated from soil cellulose degradation bacterium HIT-3, the reducing sugar cellulolytic yield can reach 16.34%. On the crops straw pretreatment, that its cellulose degradation soluble materials for small molecular the substrate, the degradation products and to the production of flocculation agent. The experiment proved that straw biological degradation products used in the production of biological flocculating agent, flocculation effect is good, and glucose fermentation substrate effect basic same, the highest flocculation rate can amount to 80.5%. The straw production of flocculant, in order to reduce the biological flocculant of industrial production cost provides theory basis.
Keywords: straw; Cellulose degradation bacterium; Two stages fermentation; Biological flocculant
中图分类号：TU74文献标识码：A 文章编号：
0 引言
秸秆是地球上丰富而廉价的可再生资源[1]。我国是世界第一秸稈大国，仅2005年全国秸秆年产量就达到84183.12万吨[2]。除部分用作饲料外，大部分秸秆都被燃烧或腐烂掉。这样做首先是燃烧不完全的，热值低，造成严重的浪费；其次是对环境造成了严重污染。所以，开发利用这种廉价的可再生资源具有深远的意义和实用价值。
生物絮凝剂作为一种新型、高效、无毒、无二次污染的绿色水处理剂，发酵成本高，制约了生物絮凝剂的工业化生产和大规模应用[3,4]。若是能利用廉价的、可再生的秸秆作为原材料，生产生物絮凝剂。这样既可降低生产成本，实现工业化生产，又可保护环境，给我们带来巨大的社会效益、经济效益和环境效益，具有很好的开发前景。但是秸秆中含有大量的纤维素，絮凝菌并不能直接利用，必须先通过预处理手段将其转化成小分子物质。本试验的目的就是分离高效的纤维素降解菌，通过两段式发酵，验证此思路的可行性。
1 材料和方法
1.1 原料和菌种
菌种：HIT-3是从土壤中分离的纤维素降解菌；F6是本实验室原有的一株高效絮凝菌。
土壤、玉米秸秆：取自郊区农田
培养基：
① 浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基[5]
② 无淀粉滤纸：滤纸用1％的醋酸浸泡一夜后用2％的苏打水洗至中性，晾干后剪成直径为8cm左右的圆形滤纸片，放在一干净的平皿中，用报纸包好，采用湿热或干热的方法灭菌备用。
③ 羧甲基纤维素培养基：取250ml三角瓶，称取1.0g羧甲基纤维素放入其中，再加入赫奇逊液体培养基100ml，121℃灭菌20min。
④ 秸秆培养基：玉米秸秆用剪刀剪成3cm左右的小段，用清水漂洗干净，再用0.5%的NaOH溶液常温下浸泡10个小时，除去部分木质素，使纤维素暴露出来，有利于微生物和酶的作用[6]。浸泡后漂洗、烘干、粉碎。取250ml三角瓶，称取1.5g秸秆粉放入其中，再加入赫奇逊液体培养基100ml， 121℃灭菌20min。
1.2 方法
1.2.1 还原糖测定
还原糖浓度的测定采用DNS法[7]。还原糖产率的计算方法：
1.2.2两段式发酵
采用两段式发酵法制取生物絮凝剂[8]，第一段发酵：秸秆糖化段。将纤维素降解菌接入秸秆培养基中，合适的培养条件下完成秸秆糖化过程；第二阶段发酵：制取生物絮凝剂段。将絮凝菌接入秸秆糖化液中，制取生物絮凝剂。
1.2.3絮凝效果测定
采用5‰的高岭土悬浊液进行絮凝效果烧杯试验。具体过程见文献[3]，絮凝效果用絮凝率[9]表征：
其中，A为空白水样上清液浊度，B为待测水样上清液浊度。
2 结果与分析
2.1增值培养
把采集的土壤编号，室温风干，用20目和40目的筛子筛选土样，取两筛中间的土粒备用。
赫奇逊固体培养基倒平板，待其凝固后，无菌操作取上述滤纸片放在固体培养基上，再用1ml无菌生理盐水润湿滤纸，将上述处理过的土粒用无菌牙签或镊子进行点种，每皿点9个土粒。放32℃生化培养箱中保湿培养，每天观察土粒周围滤纸变化情况。培养2～3天后，土粒周围有黄色菌苔出现，到第6～7天时，菌苔扩大，在土粒周围形成淡黄色的降解圈。
2.2初筛
从出现降解圈的土粒周围挑取菌苔在赫奇逊固体平板上划线，然后盖一层灭菌滤纸，再加1ml生理盐水润湿滤纸，待滤纸上有黄色降解圈出现，再重复划线2～3次，使能降解秸秆类纤维素的细菌被进一步纯化出来。划线培养的照片：
把上述划线分离出来的降解速度快的菌苔挑取1～2环到100ml带有玻璃珠的灭菌生理盐水中（每瓶同时加灭菌的土温80两滴，目的是使菌团能被充分打散），放在140转的摇床上摇3个小时，然后进行无菌稀释，稀释到1～10个菌/mL，吸取1ml稀释菌液到赫奇逊固体平板上，用手晃动平板，待稀释菌液均匀平铺后，在平板上加盖一张无菌滤纸，32℃保湿培养6天。稀释培养的照片：
该类纤维素降解菌比较粘稠，滤纸本身又具有吸附性，很难通过划线把它们分纯。稀释分离通过加入的土温－80降低了菌与菌之间的粘附性，再加上玻璃珠的打散作用，菌体比较分散，再通过无菌稀释，滤纸的吸附性不会影响分离结果。所以，稀释培养的方法克服了划线培养的一些弊端，能够筛出单个菌株。根据每株菌的土样来源、在滤纸板上生长的颜色、大小、生长快慢等共分离筛选出126株菌。
2.3复筛
初筛分离得到的126株菌分别接入羧甲基纤维素培养基中进行液体发酵产糖试验，32℃，140r/min摇床培养7天，每天测其还原糖浓度变化，从中选出还原糖产率相对高的菌。目前，大多数的研究都集中在纤维素酶的提取与结构分析上，产酶与酶水解是分开进行的，文章的研究集中在使产酶和酶水解在同一体系中进行，所以在液体发酵试验中，直接测还原糖浓度变化，筛选能实现产酶和酶水解在同一体系中进行的高效菌株。要求所筛选的菌株能产生纤维素复合酶系，具有很强的纤维素降解活性，降解后的产物中还原糖的浓度较高，有利于后续发酵的进行。126株菌连续发酵七天，每天定时取样测得的还原糖浓度变化情况。这些菌最高还原糖产糖率出现的时间并不相同，有的在第二天，大部分在第三天到第四天，也有的甚至达到七天或更多天数。从实际应用的角度考虑天数越少越有利于生产。根据测得数据，选择126株菌第三天的产糖率绘制126株菌的还原糖产率柱状图，见图1.。
根据图1可统计出，126株菌发酵三天还原糖产率在不同的范围内，见表1：
表1 126株菌的还原糖产率范围
Table1 The range of reduced sugar output rate of 126 bacteria
产糖率范围(％) ≥15 10－15 5－10 0－5
菌株数 1 1 31 93
从图1和表1中，我们很容易发现编号为3和71的两株菌的产糖率明显高于其他124株菌。其他大部分的菌株的最高还原糖产率多集中在0～10％之间。3号和71号菌的还原糖产率分别为16.34％和13.54％，将它们重新命名为HIT-3和HIT-71。
2.4絮凝效果的测定
将HIT-3接入上述秸秆培养基中，32℃，140r/min摇床培养3天后，糖化产物121℃灭菌20min，接入絮凝剂产生菌F6。为了验证秸秆底物与葡萄糖底物是否具有同样的效果，同时做了葡萄糖发酵对比试验。30℃，140rpm摇床培养，每12小时测一次絮凝率。
图2为絮凝率比较结果：
从图中可以看出，不论是秸秆还是葡萄糖用于生产生物絮凝剂都有很好的絮凝效果，最高絮凝率分别为80.5%和90.2%。以秸秆为底物生产生物絮凝剂，发酵前期絮凝效果并不理想，直到发酵36小时之后絮凝率才达到一个较好的效果，并趋于稳定。而葡萄糖发酵生产絮凝剂12个小时就能达到很好的絮凝效果。主要的原因是：絮凝菌F6本来就是利用葡萄糖培养基分离出来的，对葡萄糖底物有很好的适应能力，表现较好的絮凝效果。
3结论
秸秆经微生物降解后的产物用作生物絮凝剂的生产底物，具有很好的絮凝效果。但是需要根据秸秆底物的特性，筛选絮凝效果更理想的菌株。因此开发秸秆等廉价资源，实现微生物絮凝剂的大规模生产，是一项非常有意义的研究。
参考文献：
[1] 余燕春.加快纤维素资源开发利用的思考[J].技术经济与管理研究，1999（4）：42-43
[2] 毕于运等.中国秸秆资源数量估算[J].农业工程学报，2009，25（12）：211-217
[3] 马放等.复合型微生物絮凝剂的开发[J].中国给水排水，2003，19（4）：1-4
作者简介：吴波（1975—），女，汉族，黑龙江省 西门子（天津）水技术工程有限公司工程师 硕士
注：文章内所有公式及图表请用PDF形式查看。
关键词： 秸秆；纤维素降解菌；两段式发酵；生物絮凝剂
Abstract: a strain isolated from soil cellulose degradation bacterium HIT-3, the reducing sugar cellulolytic yield can reach 16.34%. On the crops straw pretreatment, that its cellulose degradation soluble materials for small molecular the substrate, the degradation products and to the production of flocculation agent. The experiment proved that straw biological degradation products used in the production of biological flocculating agent, flocculation effect is good, and glucose fermentation substrate effect basic same, the highest flocculation rate can amount to 80.5%. The straw production of flocculant, in order to reduce the biological flocculant of industrial production cost provides theory basis.
Keywords: straw; Cellulose degradation bacterium; Two stages fermentation; Biological flocculant
中图分类号：TU74文献标识码：A 文章编号：
0 引言
秸秆是地球上丰富而廉价的可再生资源[1]。我国是世界第一秸稈大国，仅2005年全国秸秆年产量就达到84183.12万吨[2]。除部分用作饲料外，大部分秸秆都被燃烧或腐烂掉。这样做首先是燃烧不完全的，热值低，造成严重的浪费；其次是对环境造成了严重污染。所以，开发利用这种廉价的可再生资源具有深远的意义和实用价值。
生物絮凝剂作为一种新型、高效、无毒、无二次污染的绿色水处理剂，发酵成本高，制约了生物絮凝剂的工业化生产和大规模应用[3,4]。若是能利用廉价的、可再生的秸秆作为原材料，生产生物絮凝剂。这样既可降低生产成本，实现工业化生产，又可保护环境，给我们带来巨大的社会效益、经济效益和环境效益，具有很好的开发前景。但是秸秆中含有大量的纤维素，絮凝菌并不能直接利用，必须先通过预处理手段将其转化成小分子物质。本试验的目的就是分离高效的纤维素降解菌，通过两段式发酵，验证此思路的可行性。
1 材料和方法
1.1 原料和菌种
菌种：HIT-3是从土壤中分离的纤维素降解菌；F6是本实验室原有的一株高效絮凝菌。
土壤、玉米秸秆：取自郊区农田
培养基：
① 浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基[5]
② 无淀粉滤纸：滤纸用1％的醋酸浸泡一夜后用2％的苏打水洗至中性，晾干后剪成直径为8cm左右的圆形滤纸片，放在一干净的平皿中，用报纸包好，采用湿热或干热的方法灭菌备用。
③ 羧甲基纤维素培养基：取250ml三角瓶，称取1.0g羧甲基纤维素放入其中，再加入赫奇逊液体培养基100ml，121℃灭菌20min。
④ 秸秆培养基：玉米秸秆用剪刀剪成3cm左右的小段，用清水漂洗干净，再用0.5%的NaOH溶液常温下浸泡10个小时，除去部分木质素，使纤维素暴露出来，有利于微生物和酶的作用[6]。浸泡后漂洗、烘干、粉碎。取250ml三角瓶，称取1.5g秸秆粉放入其中，再加入赫奇逊液体培养基100ml， 121℃灭菌20min。
1.2 方法
1.2.1 还原糖测定
还原糖浓度的测定采用DNS法[7]。还原糖产率的计算方法：
1.2.2两段式发酵
采用两段式发酵法制取生物絮凝剂[8]，第一段发酵：秸秆糖化段。将纤维素降解菌接入秸秆培养基中，合适的培养条件下完成秸秆糖化过程；第二阶段发酵：制取生物絮凝剂段。将絮凝菌接入秸秆糖化液中，制取生物絮凝剂。
1.2.3絮凝效果测定
采用5‰的高岭土悬浊液进行絮凝效果烧杯试验。具体过程见文献[3]，絮凝效果用絮凝率[9]表征：
其中，A为空白水样上清液浊度，B为待测水样上清液浊度。
2 结果与分析
2.1增值培养
把采集的土壤编号，室温风干，用20目和40目的筛子筛选土样，取两筛中间的土粒备用。
赫奇逊固体培养基倒平板，待其凝固后，无菌操作取上述滤纸片放在固体培养基上，再用1ml无菌生理盐水润湿滤纸，将上述处理过的土粒用无菌牙签或镊子进行点种，每皿点9个土粒。放32℃生化培养箱中保湿培养，每天观察土粒周围滤纸变化情况。培养2～3天后，土粒周围有黄色菌苔出现，到第6～7天时，菌苔扩大，在土粒周围形成淡黄色的降解圈。
2.2初筛
从出现降解圈的土粒周围挑取菌苔在赫奇逊固体平板上划线，然后盖一层灭菌滤纸，再加1ml生理盐水润湿滤纸，待滤纸上有黄色降解圈出现，再重复划线2～3次，使能降解秸秆类纤维素的细菌被进一步纯化出来。划线培养的照片：
把上述划线分离出来的降解速度快的菌苔挑取1～2环到100ml带有玻璃珠的灭菌生理盐水中（每瓶同时加灭菌的土温80两滴，目的是使菌团能被充分打散），放在140转的摇床上摇3个小时，然后进行无菌稀释，稀释到1～10个菌/mL，吸取1ml稀释菌液到赫奇逊固体平板上，用手晃动平板，待稀释菌液均匀平铺后，在平板上加盖一张无菌滤纸，32℃保湿培养6天。稀释培养的照片：
该类纤维素降解菌比较粘稠，滤纸本身又具有吸附性，很难通过划线把它们分纯。稀释分离通过加入的土温－80降低了菌与菌之间的粘附性，再加上玻璃珠的打散作用，菌体比较分散，再通过无菌稀释，滤纸的吸附性不会影响分离结果。所以，稀释培养的方法克服了划线培养的一些弊端，能够筛出单个菌株。根据每株菌的土样来源、在滤纸板上生长的颜色、大小、生长快慢等共分离筛选出126株菌。
2.3复筛
初筛分离得到的126株菌分别接入羧甲基纤维素培养基中进行液体发酵产糖试验，32℃，140r/min摇床培养7天，每天测其还原糖浓度变化，从中选出还原糖产率相对高的菌。目前，大多数的研究都集中在纤维素酶的提取与结构分析上，产酶与酶水解是分开进行的，文章的研究集中在使产酶和酶水解在同一体系中进行，所以在液体发酵试验中，直接测还原糖浓度变化，筛选能实现产酶和酶水解在同一体系中进行的高效菌株。要求所筛选的菌株能产生纤维素复合酶系，具有很强的纤维素降解活性，降解后的产物中还原糖的浓度较高，有利于后续发酵的进行。126株菌连续发酵七天，每天定时取样测得的还原糖浓度变化情况。这些菌最高还原糖产糖率出现的时间并不相同，有的在第二天，大部分在第三天到第四天，也有的甚至达到七天或更多天数。从实际应用的角度考虑天数越少越有利于生产。根据测得数据，选择126株菌第三天的产糖率绘制126株菌的还原糖产率柱状图，见图1.。
根据图1可统计出，126株菌发酵三天还原糖产率在不同的范围内，见表1：
表1 126株菌的还原糖产率范围
Table1 The range of reduced sugar output rate of 126 bacteria
产糖率范围(％) ≥15 10－15 5－10 0－5
菌株数 1 1 31 93
从图1和表1中，我们很容易发现编号为3和71的两株菌的产糖率明显高于其他124株菌。其他大部分的菌株的最高还原糖产率多集中在0～10％之间。3号和71号菌的还原糖产率分别为16.34％和13.54％，将它们重新命名为HIT-3和HIT-71。
2.4絮凝效果的测定
将HIT-3接入上述秸秆培养基中，32℃，140r/min摇床培养3天后，糖化产物121℃灭菌20min，接入絮凝剂产生菌F6。为了验证秸秆底物与葡萄糖底物是否具有同样的效果，同时做了葡萄糖发酵对比试验。30℃，140rpm摇床培养，每12小时测一次絮凝率。
图2为絮凝率比较结果：
从图中可以看出，不论是秸秆还是葡萄糖用于生产生物絮凝剂都有很好的絮凝效果，最高絮凝率分别为80.5%和90.2%。以秸秆为底物生产生物絮凝剂，发酵前期絮凝效果并不理想，直到发酵36小时之后絮凝率才达到一个较好的效果，并趋于稳定。而葡萄糖发酵生产絮凝剂12个小时就能达到很好的絮凝效果。主要的原因是：絮凝菌F6本来就是利用葡萄糖培养基分离出来的，对葡萄糖底物有很好的适应能力，表现较好的絮凝效果。
3结论
秸秆经微生物降解后的产物用作生物絮凝剂的生产底物，具有很好的絮凝效果。但是需要根据秸秆底物的特性，筛选絮凝效果更理想的菌株。因此开发秸秆等廉价资源，实现微生物絮凝剂的大规模生产，是一项非常有意义的研究。
参考文献：
[1] 余燕春.加快纤维素资源开发利用的思考[J].技术经济与管理研究，1999（4）：42-43
[2] 毕于运等.中国秸秆资源数量估算[J].农业工程学报，2009，25（12）：211-217
[3] 马放等.复合型微生物絮凝剂的开发[J].中国给水排水，2003，19（4）：1-4
作者简介：吴波（1975—），女，汉族，黑龙江省 西门子（天津）水技术工程有限公司工程师 硕士
注：文章内所有公式及图表请用PDF形式查看。