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摘要[目的]采用响应面法优化超声提取黄荆叶总黄酮的工艺条件及月周期规律研究，为其开发利用提供技术参考。[方法]以9月份的黄荆叶粗粉为原料进行优化提取工艺研究，乙醇为提取溶剂，在单因素试验结果的基础上，以黄荆叶总黄酮提取率为响应值，应用响应面法考察提取次数、料液比、乙醇浓度和超声功率对黄荆叶总黄酮提取率的影响，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，设计4因素3水平响应面试验，建立回归模型，进行响应面分析，并根据最优提取工艺提取4—11月黄荆叶的总黄酮，确定总黄酮含量的变化规律。[结果]9月份黄荆叶总黄酮超声提取最佳工艺条件为：提取次数为3次，料液比为1.00∶50.25，乙醇浓度为50.59%，超声功率比为41.94%，总黄酮提取得率可达10.48%;4—11月份中8月份的黄荆叶总黄酮含量最高，可达11.22%。[结论]响应面法优化黄荆叶总黄酮的提取条件切实可行，得到的回归方程与试验结果拟合性好，方法稳定可靠，可为工业大生产提取黄荆叶总黄酮提供一定的技术参考。
关键词黄荆叶;总黄酮;响应面法;超声提取;月周期规律
中图分类号R284.2文献标识码A
文章编号0517-6611（2019）03-0158-05
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.050
黄荆（Vitex negundo L.），又名蚊子柴、五指柑、五指风、布荆、荆条，为马鞭草科植物的全株，主要分布于广西各地，长江流域及南部其他省各有分布[1]。味苦、微辛，平;疏风清热，止咳化痰，截疟[2];用于风湿性关节炎、水肿、流感、慢性支气管炎、胃溃疡、慢性胃炎、急性肠炎、头风痛、毒蛇咬伤[3]、脚癣[4]。黄荆叶含紫花牡丹素、黄酮、木犀草素-7-葡萄糖苷、四羟基-甲氧基黄酮-α-D-葡萄糖苷、挥发油、杜荆定碱及维生素C等[5]。现代药理研究表明，黄荆叶提取物具有抗炎镇痛作用[6]，在体外抑菌作用，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、青霉和酵母有一定的抗菌作用[7-8]。黄酮作为黄荆叶中重要的生物活性成分之一，具有抑菌、抗氧化[9-10]、抗肿瘤[11]等药理作用。笔者在单因素试验基础上，采用响应面法[12-15]优化超声提取黄荆叶总黄酮工艺条件，在4—11月中确定总黄酮含量最高的月份，以期获得适合工业大生产黄荆叶的总黄酮的提取方法和提取月份，并为该成分药理活性的深入研究和黄荆叶资源的有效利用提供试验依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试材。
黄荆叶采自重庆医科大学药植园，4—11月每月15日中午采集黄荆叶，去除杂质，阴干，粉碎封装于塑料袋备用。
1.1.2试剂。
芦丁标准品（UV≥92.5%，ID：RKP7-7SN4，中国食品药品检定研究院）、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠和无水乙醇均为分析纯。
1.1.3仪器。
UV-1200型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）;FA2004电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）;SHZ-DⅢ型循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）;KQ5200DA超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。
1.2方法
1.2.1黄荆叶总黄酮提取工艺。
1.2.1.1芦丁标准溶液的配制及标准曲线的绘制。
精确称取干燥至恒重的芦丁对照品5.000 mg，用60%乙醇溶解并定容于50 mL容量瓶中，摇匀，即得浓度为0.1 mg/mL芦丁标准溶液。准确移取芦丁标准溶液5.00 mL在450～600 nm处测定吸收度，在510 nm处有最大吸收，故选510 nm为测定波长。分别移取芦丁标准溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于6個25 mL容量瓶中，用60%乙醇稀释至10 mL，加入0.6 mL 5%NaNO2溶液摇匀，放置6 min;然后加入0.6 mL 10%Al（NO3）3摇匀，放置6 min;然后加入6 mL浓度为1.0 mo1/L的NaOH溶液，用60%乙醇定容，混合后摇匀，放置15 min。以试剂空白为参比，在510 nm处测吸光度。以芦丁浓度C（mg/mL）为横坐标、吸光度A为纵坐标绘制标准曲线[16-17]，得到标准曲线方程为A=12.730 8C+0.034 1（R2=0.999 9），表明在0.005～0.045 mg/mL吸光度与浓度的线性关系良好。
1.2.1.2黄荆叶总黄酮的提取。
将总黄酮阴干，粉碎后过40目筛，准确称取0.5 g置于50 mL烧杯中，按照一定的料液比、乙醇浓度、提取次数和超声功率进行超声提取。提取完成后，过滤，合并滤液，浓缩，用50%乙醇定容至100 mL容量瓶中，即为样品溶液，备用。
1.2.1.3总黄酮的含量测定。
取“1.2.1.2”项下定容后的样品溶液0.5 mL于10 mL试管中，按照“1.2.1.1”项下的方法显色后加60%乙醇溶液至10 mL刻度，在510 nm处测量吸光度，计算总黄酮的提取得率。
总黄酮提取得率=[（C×V×n）/m ]×100%，其中C由回归方程计算出总黄酮浓度（mg/mL）;V为浓缩液定容体积（mL）;n为表示稀释倍数;m为样品质量。
1.2.2单因素试验。
1.2.2.1乙醇浓度对总黄酮得率的影响。
固定料液比为1∶30（g∶mL），20%功率比超声提取2次，每次提取5 min，考察乙醇浓度（30%、40%、50%、60%、70%、80%）对黄荆叶总黄酮提取率的影响。
1.2.2.2提取次数对总黄酮得率的影响。
固定1∶30料液比加入50%乙醇，20%功率比超声5 min，考察提取次数（1、2、3、4次）对黄荆叶总黄酮提取率的影响。 1.2.2.3料液比对总黄酮得率的影响。
固定乙醇50%，20%功率比超声提取2次和每次提取5 min，考察料液比（1∶1、 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60）对黄荆叶总黄酮提取率的影响。
1.2.2.4超声功率对总黄酮得率的影响。
固定1∶30料液比加入50%乙醇和超声提取2次，考察超声功率比（20%、40%、60%、80%、100%）每次提取5 min，对黄荆叶总黄酮提取率的影响。
安徽农业科学2019年
1.2.3响应面法优化黄荆叶总黄酮提取工艺。
根据Box-Behnken试验设计原理，采用Design-Expert 8.0.6.1软件进行试验结果分析，选用提取次数、料液比、乙醇浓度、超声功率等4个影响因素为自变量，以黄荆叶总黄酮提取率为响应值，在单因素试验的基础上，设计4因素3水平响应面试验方案，进行黄荆叶总黄酮提取工艺优化。
1.2.4一年中4—11月黄荆叶总黄酮含量的变化规律。
根据响应面分析结果，采用黄荆叶最佳提取工艺，提取4—11月黄荆叶总黄酮，明确4—11月份中黄荆叶总黄酮的含量变化规律。
2结果与分析
2.1单因素试验
2.1.1乙醇浓度对黄荆叶总黄酮得率的影响。
在固定提取次数、超声功率和料液比的条件下，乙醇浓度对黄荆叶总黄酮得率的影响见图1。从30%增加到50%时，总黄酮得率最大，故选择乙醇浓度为50%。
2.1.2提取次数对黄荆叶总黄酮得率的影响。
在固定乙醇浓度、超声功率和料液比的条件下，提取次数对黄荆叶总黄酮得率的影响见图2。随着提取次数的增加，黄荆叶总黄酮提取得率呈先增加后平缓的趋势，当提取次数为3次时，总黄酮提取得率达到最大值，故选择提取次数为3次。
2.1.3料液比对黄荆叶总黄酮得率的影响。
在固定提取次数、超声功率和乙醇浓度的条件下，料液比对黄荆叶总黄酮得率的影响见图3。在一定料液比范围内随着料液比的增大，黄荆叶总黄酮类成分的溶出量不断增加，当料液比为1∶50时，黄荆叶总黄酮得率达到最大值，随后下降，故选择料液比为1∶50。
2.1.4超声功率比对黄荆叶总黄酮得率的影响。
在固定提取次数、料液比和乙醇浓度的条件下，超声功率比对黄荆叶总黄酮得率的影响见图4。随着超声功率比的增加，黄荆叶总黄酮提取得率呈先升高后下降趋势，当超声功率比为40%时，总黄酮的提取得率达到最大值，故选择超声功率比为40%。
2.2响应面优化提取工艺结果
2.2.1试验方案及结果。在单因素试验的基础上，设计4因素3水平响应面试验方案，进行黄荆叶总黄酮提取工艺优化。中心组合设计的因素与水平见表1，试验结果见表2。
2.2.2黄酮得率回归模型的建立和方差分析。
以黄荆叶总黄酮得率为响应值的线性回归方程为Y=10.47+0.12A-0.13B+0.18C+4.283E-003D+0.37AB+0.15AC+0.12AD+0.081BC-0.14BD+0.37CD-1.07A2-1.40B2-1.00C2-1.05D2。
模型分析结果表明，模型F=16.40（P<0.000 1），回归模型极显著。失拟项P=0.034 3（P<0.05），失拟项显著，对试验拟合性较差。R2=0.999 9，模型拟合程度较好。显著性检验表明，乙醇浓度、提取次数、超声功率比、料液比对黄荆叶总黄酮得率的影响不显著，影响顺序为超声功率比>提取次数>乙醇浓度>料液比。乙醇浓度与提取次数的交互项AB和超声功率比與料液比的交互项CD的P值均小于0.05，表明乙醇浓度与提取次数和超声功率比与料液比的交互作用对黄荆叶总黄酮得率有显著影响。乙醇浓度的二次项A2、提取次数的二次项B2、超声功率比的二次项C2和料液比的二次项D2对黄荆叶总黄酮的得率都有极显著的影响（P<0.001）。
2.2.3响应曲面分析。
两两因素的交互作用对黄荆叶总黄酮得率影响的响应面分析见图5。
由图5可见，乙醇浓度、提取次数对应的响应面3D图曲面变化陡峭，其等高线稀疏呈椭圆形，且椭圆弧度较大，表明乙醇浓度与提取次数的交互作用显著，两者对黄荆叶总黄酮得率的影响明显。
乙醇浓度、超声功率比对应的响应面3D图曲面变化较平缓，其等高线较密集呈微椭圆形，表明乙醇浓度与超声功率比的交互作用不显著，两者对黄荆叶总黄酮得率的影响较小。
乙醇浓度、料液比对应的响应面3D图曲面较为平缓，其等高线较密集呈圆形，表明乙醇浓度与料液比的交互作用不显著。
提取次数、超声功率比对应的响应面3D图曲面较为陡峭，其等高线呈近圆形，表明提取次数与超声功率比的交互作用不显著。
超声功率比、料液比对应的响应面3D图曲面陡峭，且其等高线呈椭圆形，表明超声功率比与料液比的交互作用显著，两者对黄荆叶总黄酮得率的影响显著。
提取次数、料液比对应的响应面3D图曲面较陡峭，其等高线稀疏且呈近圆形，表明提取次数与液料比的交互作用不显著。
通过响应面优化，最终确定提取黄荆叶总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇浓度为50.59%，提取次数为2.96次，超声功率比为41.94%，料液比为1.00∶50.25，总黄酮含量理论值应为10.482 4%。为方便操作，最终黄荆叶药材以1∶50的比例与51%乙醇混合后在40%超声功率比下提取3次。
2.3验证试验
按优化后工艺条件，进行3次平行试验，测得黄荆叶总黄酮的平均得率为10.485 8%，与理论值基本一致。 2.4黄荆叶总黄酮一年内月周期变化规律
采用优选的最佳提取方案进行4—11月份黄荆叶总黄酮含量的提取，从图6可以看出，4—8月份总黄酮含量一直在增加，8月份的黄荆叶总黄酮含量达到最高，为11.223 5%;9月份后开始下降，特别是11月份总黄酮含量急剧下降，主要是因为10月份后气温下降，黄荆叶不再生长，11月15日时黄荆叶开始枯黄脱落。
3结论与讨论
根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，选择乙醇浓度、提取次数、超声功率比、料液比4个考察因素，设计4因素3水平响应面分析法，确定提取黄荆叶总黄酮的最佳提取工艺。结果得出最佳提取工艺：乙醇浓度为51%，提取次数为3次，超声功率比为40%，料液比为1∶50，黄荆叶总黄酮得率的理论值达10.482 4%。3次验证试验所得的黄荆叶总黄酮得率为10.485 8%，与理论值基本一致。
利用最佳提取工艺提取4—11月的黄荆叶总黄酮，发现
黄荆叶总黄酮变化的基本规律，随着黄荆叶的生长，总黄酮含量在不断增加，在8月份黄荆叶基本不再长大时总黄酮含量也达到最高（11.223 5%），以后随着黄荆叶的逐渐老化，总黄酮含量叶逐渐减少，在11月黄荆叶枯萎发黄要脱落时，总黄酮的含量急剧下降，这也为开发利用黄荆叶总黄酮提供了理论依据，在采集黄荆叶时应该以8月份为最佳采收期，这个时间段黄荆叶的产量高，黄酮含量也最高，枯萎落地的叶片含总黄酮低，所以不能收集落地的叶片作为药材。
参考文献
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关键词黄荆叶;总黄酮;响应面法;超声提取;月周期规律
中图分类号R284.2文献标识码A
文章编号0517-6611（2019）03-0158-05
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.050
黄荆（Vitex negundo L.），又名蚊子柴、五指柑、五指风、布荆、荆条，为马鞭草科植物的全株，主要分布于广西各地，长江流域及南部其他省各有分布[1]。味苦、微辛，平;疏风清热，止咳化痰，截疟[2];用于风湿性关节炎、水肿、流感、慢性支气管炎、胃溃疡、慢性胃炎、急性肠炎、头风痛、毒蛇咬伤[3]、脚癣[4]。黄荆叶含紫花牡丹素、黄酮、木犀草素-7-葡萄糖苷、四羟基-甲氧基黄酮-α-D-葡萄糖苷、挥发油、杜荆定碱及维生素C等[5]。现代药理研究表明，黄荆叶提取物具有抗炎镇痛作用[6]，在体外抑菌作用，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、青霉和酵母有一定的抗菌作用[7-8]。黄酮作为黄荆叶中重要的生物活性成分之一，具有抑菌、抗氧化[9-10]、抗肿瘤[11]等药理作用。笔者在单因素试验基础上，采用响应面法[12-15]优化超声提取黄荆叶总黄酮工艺条件，在4—11月中确定总黄酮含量最高的月份，以期获得适合工业大生产黄荆叶的总黄酮的提取方法和提取月份，并为该成分药理活性的深入研究和黄荆叶资源的有效利用提供试验依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试材。
黄荆叶采自重庆医科大学药植园，4—11月每月15日中午采集黄荆叶，去除杂质，阴干，粉碎封装于塑料袋备用。
1.1.2试剂。
芦丁标准品（UV≥92.5%，ID：RKP7-7SN4，中国食品药品检定研究院）、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠和无水乙醇均为分析纯。
1.1.3仪器。
UV-1200型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）;FA2004电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）;SHZ-DⅢ型循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）;KQ5200DA超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。
1.2方法
1.2.1黄荆叶总黄酮提取工艺。
1.2.1.1芦丁标准溶液的配制及标准曲线的绘制。
精确称取干燥至恒重的芦丁对照品5.000 mg，用60%乙醇溶解并定容于50 mL容量瓶中，摇匀，即得浓度为0.1 mg/mL芦丁标准溶液。准确移取芦丁标准溶液5.00 mL在450～600 nm处测定吸收度，在510 nm处有最大吸收，故选510 nm为测定波长。分别移取芦丁标准溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于6個25 mL容量瓶中，用60%乙醇稀释至10 mL，加入0.6 mL 5%NaNO2溶液摇匀，放置6 min;然后加入0.6 mL 10%Al（NO3）3摇匀，放置6 min;然后加入6 mL浓度为1.0 mo1/L的NaOH溶液，用60%乙醇定容，混合后摇匀，放置15 min。以试剂空白为参比，在510 nm处测吸光度。以芦丁浓度C（mg/mL）为横坐标、吸光度A为纵坐标绘制标准曲线[16-17]，得到标准曲线方程为A=12.730 8C+0.034 1（R2=0.999 9），表明在0.005～0.045 mg/mL吸光度与浓度的线性关系良好。
1.2.1.2黄荆叶总黄酮的提取。
将总黄酮阴干，粉碎后过40目筛，准确称取0.5 g置于50 mL烧杯中，按照一定的料液比、乙醇浓度、提取次数和超声功率进行超声提取。提取完成后，过滤，合并滤液，浓缩，用50%乙醇定容至100 mL容量瓶中，即为样品溶液，备用。
1.2.1.3总黄酮的含量测定。
取“1.2.1.2”项下定容后的样品溶液0.5 mL于10 mL试管中，按照“1.2.1.1”项下的方法显色后加60%乙醇溶液至10 mL刻度，在510 nm处测量吸光度，计算总黄酮的提取得率。
总黄酮提取得率=[（C×V×n）/m ]×100%，其中C由回归方程计算出总黄酮浓度（mg/mL）;V为浓缩液定容体积（mL）;n为表示稀释倍数;m为样品质量。
1.2.2单因素试验。
1.2.2.1乙醇浓度对总黄酮得率的影响。
固定料液比为1∶30（g∶mL），20%功率比超声提取2次，每次提取5 min，考察乙醇浓度（30%、40%、50%、60%、70%、80%）对黄荆叶总黄酮提取率的影响。
1.2.2.2提取次数对总黄酮得率的影响。
固定1∶30料液比加入50%乙醇，20%功率比超声5 min，考察提取次数（1、2、3、4次）对黄荆叶总黄酮提取率的影响。 1.2.2.3料液比对总黄酮得率的影响。
固定乙醇50%，20%功率比超声提取2次和每次提取5 min，考察料液比（1∶1、 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60）对黄荆叶总黄酮提取率的影响。
1.2.2.4超声功率对总黄酮得率的影响。
固定1∶30料液比加入50%乙醇和超声提取2次，考察超声功率比（20%、40%、60%、80%、100%）每次提取5 min，对黄荆叶总黄酮提取率的影响。
安徽农业科学2019年
1.2.3响应面法优化黄荆叶总黄酮提取工艺。
根据Box-Behnken试验设计原理，采用Design-Expert 8.0.6.1软件进行试验结果分析，选用提取次数、料液比、乙醇浓度、超声功率等4个影响因素为自变量，以黄荆叶总黄酮提取率为响应值，在单因素试验的基础上，设计4因素3水平响应面试验方案，进行黄荆叶总黄酮提取工艺优化。
1.2.4一年中4—11月黄荆叶总黄酮含量的变化规律。
根据响应面分析结果，采用黄荆叶最佳提取工艺，提取4—11月黄荆叶总黄酮，明确4—11月份中黄荆叶总黄酮的含量变化规律。
2结果与分析
2.1单因素试验
2.1.1乙醇浓度对黄荆叶总黄酮得率的影响。
在固定提取次数、超声功率和料液比的条件下，乙醇浓度对黄荆叶总黄酮得率的影响见图1。从30%增加到50%时，总黄酮得率最大，故选择乙醇浓度为50%。
2.1.2提取次数对黄荆叶总黄酮得率的影响。
在固定乙醇浓度、超声功率和料液比的条件下，提取次数对黄荆叶总黄酮得率的影响见图2。随着提取次数的增加，黄荆叶总黄酮提取得率呈先增加后平缓的趋势，当提取次数为3次时，总黄酮提取得率达到最大值，故选择提取次数为3次。
2.1.3料液比对黄荆叶总黄酮得率的影响。
在固定提取次数、超声功率和乙醇浓度的条件下，料液比对黄荆叶总黄酮得率的影响见图3。在一定料液比范围内随着料液比的增大，黄荆叶总黄酮类成分的溶出量不断增加，当料液比为1∶50时，黄荆叶总黄酮得率达到最大值，随后下降，故选择料液比为1∶50。
2.1.4超声功率比对黄荆叶总黄酮得率的影响。
在固定提取次数、料液比和乙醇浓度的条件下，超声功率比对黄荆叶总黄酮得率的影响见图4。随着超声功率比的增加，黄荆叶总黄酮提取得率呈先升高后下降趋势，当超声功率比为40%时，总黄酮的提取得率达到最大值，故选择超声功率比为40%。
2.2响应面优化提取工艺结果
2.2.1试验方案及结果。在单因素试验的基础上，设计4因素3水平响应面试验方案，进行黄荆叶总黄酮提取工艺优化。中心组合设计的因素与水平见表1，试验结果见表2。
2.2.2黄酮得率回归模型的建立和方差分析。
以黄荆叶总黄酮得率为响应值的线性回归方程为Y=10.47+0.12A-0.13B+0.18C+4.283E-003D+0.37AB+0.15AC+0.12AD+0.081BC-0.14BD+0.37CD-1.07A2-1.40B2-1.00C2-1.05D2。
模型分析结果表明，模型F=16.40（P<0.000 1），回归模型极显著。失拟项P=0.034 3（P<0.05），失拟项显著，对试验拟合性较差。R2=0.999 9，模型拟合程度较好。显著性检验表明，乙醇浓度、提取次数、超声功率比、料液比对黄荆叶总黄酮得率的影响不显著，影响顺序为超声功率比>提取次数>乙醇浓度>料液比。乙醇浓度与提取次数的交互项AB和超声功率比與料液比的交互项CD的P值均小于0.05，表明乙醇浓度与提取次数和超声功率比与料液比的交互作用对黄荆叶总黄酮得率有显著影响。乙醇浓度的二次项A2、提取次数的二次项B2、超声功率比的二次项C2和料液比的二次项D2对黄荆叶总黄酮的得率都有极显著的影响（P<0.001）。
2.2.3响应曲面分析。
两两因素的交互作用对黄荆叶总黄酮得率影响的响应面分析见图5。
由图5可见，乙醇浓度、提取次数对应的响应面3D图曲面变化陡峭，其等高线稀疏呈椭圆形，且椭圆弧度较大，表明乙醇浓度与提取次数的交互作用显著，两者对黄荆叶总黄酮得率的影响明显。
乙醇浓度、超声功率比对应的响应面3D图曲面变化较平缓，其等高线较密集呈微椭圆形，表明乙醇浓度与超声功率比的交互作用不显著，两者对黄荆叶总黄酮得率的影响较小。
乙醇浓度、料液比对应的响应面3D图曲面较为平缓，其等高线较密集呈圆形，表明乙醇浓度与料液比的交互作用不显著。
提取次数、超声功率比对应的响应面3D图曲面较为陡峭，其等高线呈近圆形，表明提取次数与超声功率比的交互作用不显著。
超声功率比、料液比对应的响应面3D图曲面陡峭，且其等高线呈椭圆形，表明超声功率比与料液比的交互作用显著，两者对黄荆叶总黄酮得率的影响显著。
提取次数、料液比对应的响应面3D图曲面较陡峭，其等高线稀疏且呈近圆形，表明提取次数与液料比的交互作用不显著。
通过响应面优化，最终确定提取黄荆叶总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇浓度为50.59%，提取次数为2.96次，超声功率比为41.94%，料液比为1.00∶50.25，总黄酮含量理论值应为10.482 4%。为方便操作，最终黄荆叶药材以1∶50的比例与51%乙醇混合后在40%超声功率比下提取3次。
2.3验证试验
按优化后工艺条件，进行3次平行试验，测得黄荆叶总黄酮的平均得率为10.485 8%，与理论值基本一致。 2.4黄荆叶总黄酮一年内月周期变化规律
采用优选的最佳提取方案进行4—11月份黄荆叶总黄酮含量的提取，从图6可以看出，4—8月份总黄酮含量一直在增加，8月份的黄荆叶总黄酮含量达到最高，为11.223 5%;9月份后开始下降，特别是11月份总黄酮含量急剧下降，主要是因为10月份后气温下降，黄荆叶不再生长，11月15日时黄荆叶开始枯黄脱落。
3结论与讨论
根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，选择乙醇浓度、提取次数、超声功率比、料液比4个考察因素，设计4因素3水平响应面分析法，确定提取黄荆叶总黄酮的最佳提取工艺。结果得出最佳提取工艺：乙醇浓度为51%，提取次数为3次，超声功率比为40%，料液比为1∶50，黄荆叶总黄酮得率的理论值达10.482 4%。3次验证试验所得的黄荆叶总黄酮得率为10.485 8%，与理论值基本一致。
利用最佳提取工艺提取4—11月的黄荆叶总黄酮，发现
黄荆叶总黄酮变化的基本规律，随着黄荆叶的生长，总黄酮含量在不断增加，在8月份黄荆叶基本不再长大时总黄酮含量也达到最高（11.223 5%），以后随着黄荆叶的逐渐老化，总黄酮含量叶逐渐减少，在11月黄荆叶枯萎发黄要脱落时，总黄酮的含量急剧下降，这也为开发利用黄荆叶总黄酮提供了理论依据，在采集黄荆叶时应该以8月份为最佳采收期，这个时间段黄荆叶的产量高，黄酮含量也最高，枯萎落地的叶片含总黄酮低，所以不能收集落地的叶片作为药材。
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