论文部分内容阅读
热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室 海南海口570228
摘 要 为提高诺丽果肉中的多酚提取量，对诺丽果粉进行超声波辅助提取并进行抗氧化活性测试。在单因素试验基础上，运用中心组合设计，通过4因素5水平的响应曲面分析法优化超声波辅助提取诺丽果多酚工艺。结果表明：最优提取工艺条件为乙醇浓度53%、液料比为1‥32、提取时间为33 min、提取温度为50 ℃。在此工艺条件下多酚提取量为6.19 mg/g，抗氧化能力为149.36 μmol/（L trolox当量），还原能力为13.5 μmol/（g抗坏血酸当量）。
关键词 诺丽；多酚；超声波辅助提取；响应曲面法
中图分类号 TS201.1 文献标识码 A
Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of
Polyphenol from NONI Using Response Surface Methodology
MENG Qixuan， WU Yougen*， CUI Mengyuan， YUAN Langxing， ZHANG Junfeng
College of Horticulture and Landscape， Hainan University/Key Laboratory of Protection， Development and Utilization
of Tropical Crop Germplasm Resources， Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228，China
Abstract To increase the extraction rate of polyphenol from noni， ultrasonic-assisted ethanol was applied. The antioxidant activity of noni extract was analyzed based on free radical scavenging activity using DPPH assay. Based on the single factor experiments， the interactive effects of four crucial parameters， including ethanol concentration， ratio of solvent to material， extraction time and temperature， were studied by central composite design and were assessed by response surface methodology（RSM）. The optimal process parameters for total extraction of polyphenol from noni were as follows： ethanol concentration was 53%，ratio of solvent to material was 1 ∶ 32， extraction time was 33 min， extraction temperature was 50 ℃. The extraction rate of polyphenol from noni was 6.19 mg/g， antioxidant activities was 149.36 μmol/L trolox equivalent， reducing ability was 13.5 μmol/g ascorbic acid equivalent.
Key words NONI；Polyphenol；Ultrasonic assisted extraction；Response surface methodology
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.09.021
诺丽（Morinda citrifolia L.）又称海巴戟，是茜草科巴戟天属植物，一种常绿小乔木或灌木，原产南太平洋诸岛，在中国海南、云南等地有分布。诺丽果实作为一种传统的药用植物，被波利尼西亚人食用已有2 000多年历史[1]。诺丽果实富含丰富的活性物质，有蒽醌类、萜类、生物碱、β-谷甾醇、多酚等[2]，具有抗菌、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、抗血栓、降血糖、消炎等功效[3]。近期研究表明，不同的干燥方法、萃取溶剂和存储条件对提取物的总酚含量和抗氧化活性有显著影响[4-6]。尽管一些研究致力于诺丽多酚成分的提取，但少有涉及其提取工艺的优化。近年来，人们对“新的提取技术、自动化提取过程、缩短提取次数、减少有机溶剂的消耗量”需求日益增加。超声波辅助提取技术已广泛地应用于紫菜[7]、鸡血藤[8]、余甘子果[9]等植物的多酚提取中。该技术简单快速、提取效率高、能耗低，并减少溶剂的消耗[10-11]。本试验通过4组单因素试验探讨了乙醇浓度、液料比、提取时间和提取温度对诺丽果中多酚提取效果的影响，并运用Central Composite Design（CCD）设计，采用4因素5水平的响应曲面分析法，优化超声波辅助提取诺丽果多酚工艺，为进一步研究诺丽果多酚的生物活性及结构提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试原料及处理 2014年6月中旬于海南儋州热科院试验农场采集生长健康，外皮呈青白色的诺丽果实，超纯水清洗后切片、晒干、粉碎后于干燥避光环境中保存备用。
1.1.2 试剂及溶液 Folin-Ciocalteu试剂、没食子酸标准品（纯度为98%）、抗坏血酸标准品、DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基）、Trolox（水溶性维生素E）、盐酸、乙醇、Na2CO3等均购于国药集团化学试剂有限公司，试验用水均为超纯水。 1.1.3 仪器与设备 XB120A电子天平（Precisa公司）、KQ-300VDE 型三频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、Certeifuge 5424R离心机（Eppendorf公司）、S53紫外分光光度计（上海棱光仪器厂）、JFSD-100粉碎机（上海淀久中药机械制造有限公司）等。
1.2 方法
1.2.1 工艺流程 诺丽果粉→过80目筛→称重→超声波提取→抽滤→离心（5 000 r/min）10 min→取清液浓缩→定容→测定吸光度（760 nm）→计算含量。
1.2.2 没食子酸标准曲线 多酚的测定以没食子酸为标准品，采用Folin-Ciocalteu比色法，参照蔡文国[12]的方法略有改动。称取0.050 g没食子酸，用蒸馏水定容至100 mL，即得到500 μg/mL的没食子酸溶液，分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL上述溶液加入到50 mL容量瓶中，加入10 mL水，摇匀。分别加入1.5 mL Folin-Cioealteu试剂，2.0 mL 20% Na2CO3，用蒸馏水定容，置于50 ℃恒温水浴锅中显色30 min，显色后于760 nm波长处测定吸光度。
1.2.3 多酚含量的测定 按1.2.1工艺流程提取诺丽果多酚，将提取后的多酚提取液适当稀释后，按照1.2.2进行检测，根据标准曲线计算诺丽果多酚含量。
1.2.4 Trolox标准曲线 参照Li[13]等研究的方法，于517 nm波长测定吸光度。
1.2.5 抗氧化能力的测定 以DPPH清除自由基活性为依据测定诺丽提取物抗氧化活性[14]。将稀释后的多酚提取液，按1.2.4测定吸光度，根据标准曲线计算诺丽果多酚的抗氧化活性。根据标准曲线，将诺丽果提取物的抗氧化能力值表示为μmol/（L TE当量）。
1.2.6 还原能力的测定 参照陈师莹等[6]研究方法，以抗坏血酸为标准品，于700 nm波长处测定吸光值，提取物还原力以标准曲线计算，表示为μmol/（g抗坏血酸当量）。
1.2.7 单因素试验 选取乙醇浓度、液料比、提取时间和提取温度4个因素，以诺丽果多酚提取量作为评价指标，进行单因素试验。固定其它条件，分别探讨乙醇浓度（25%～85%）、液料比（1‥10～1‥50）、提取时间（10～50 min）、提取温度（30～70 ℃）对诺丽果多酚提取量的影响，各因素试验重复3次，取平均值并计算标准差，各因素水平见表1。
1.2.8 响应面法优化 超声波辅助提取诺丽果中的多酚，在单因素试验的基础上，选取乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温度4个因素，采用中心组合试验CCD设计方案，进行4因素5水平试验，优化提取工艺，重复3次，取平均值并计算标准差，因素水平见表2。
1.3 数据分析
采用SPSS Statistics 20分析单因素试验结果，运用Design Expert 8.0.6建立响应曲面模型，并对超声波辅助提取试验结果，进行参数优化及统计分析。
2 结果与分析
2.1 标准曲线
没食子酸浓度y（mg/mL）与吸光度x的标准方程为：y=8.109 8x-0.079 4，相关系数R2=0.999 0，说明该检测方法下没食子酸溶液浓度与吸光度呈良好的线性关系。
trolox浓度C（μmol/L）与吸光度A的标准方程：C=-146.82A+186.84，R2=0.999 1，表明该线性关系良好。
抗坏血酸酸浓度y（μmol/g）与吸光度x的标准方程为：y=22.372x-1.692 5，R2=0.999 1。
2.2 单因素试验结果与分析
2.2.1 乙醇浓度 由表1可知，随着乙醇浓度的升高，多酚提取量呈上升趋势，当乙醇浓度为55%时，多酚提取量达最大值，随后逐渐下降。因此，乙醇浓度以55%为最佳。
2.2.2 液料比 由表1可知多酚提取量随液料比的增加而增大，当液料比达到1‥30和1‥50时，多酚提取量达最大。因此，结合溶剂用量及浓缩工艺考虑，最佳液料比为1‥30。
2.2.3 提取时间 由表1可知，随着提取时间的延长，诺丽果中多酚含量呈“先增后降”趋势，当提取时间达到30 min时，溶出的可溶性成分最多，多酚含量达到最大值。随着提取液黏度增大，损耗有所增强，故呈现出降低趋势。因此，提取时间以30 min为佳。
2.2.4 提取温度 由表1可知，提取温度为50 ℃时，诺丽果中多酚提取量最大值为5.35 mg/g。多酚提取量随着提取温度的升高而逐渐增加，达到最大值后，继而下降，但整个过程变化幅度较小。温度升高使得多酚氧化，提取量下降。因此，提取温度为50 ℃较适宜。
2.3 响应曲面分析法结果与分析
2.3.1 响应曲面试验结果及分析 运用CCD设计，根据单因素试验结果分析，以诺丽果多酚提取量为响应值，通过4因素5水平的响应曲面法优化超声波辅助提取诺丽果多酚的工艺，结果见表3。回归模型拟合将所得数据用Design Expert 8.0.6软件进行响应面分析，以多酚含量（Y）为响应值与乙醇浓度（X1）、液料比（X2）、提取时间（X3）及提取温度（X4）4因素间的回归方程为：Y=6.27-0.22X1+0.15X2+0.17X3-0.06X4+0.21X1X2+0.29X1X3+0.34X1X4 +0.13X2X3+0.13X2X4-0.13X3X4-1.73X12-0.48X22-0.35X32-0.19X42。由回归方程分析可知（表4），以多酚含量建立的回归整体模型为极显著（p<0.01）。同时模型的决定系数R2=0.909 3，F=10.03，变异系数为6.32%（<10%），失拟项=0.347 4（p>0.05），不显著，模型的Adeq Precision=10.212，该值是模型信噪比的反映。Adeq Precision>4即表明模型的响应信号足够强，可以用来拟合试验结果。综合表明该模型是合适的，可以用来分析和预测诺丽果中多酚的提取量。该模型中的一次项X2、X3显著（p<0.05），二次项X12、X22、X32、X42极显著（p<0.01），这表明此4个因素对诺丽果多酚提取量均有一定影响。经响应曲面法分析，最佳提取条件为乙醇浓度（X1）=53.37%、液料比（X2）=1‥31.54、提取时间（X3）=32.88 min、提取温度（X4）=47.50 ℃，此时诺丽果多酚提取量为6.32 mg/g。 2.3.2 响应曲面分析与优化 在其它因素不变的情况下，分析各因素间的两两交互作用对多酚提取量的影响，利用Design Expert 8.0.6软件拟合绘制模型。由图1～3可知，多酚提取量随乙醇浓度的增大快速升高，达到峰值后又迅速降低，当乙醇浓度为45%～55%，多酚提取量达到最大值。图4中等高线近似圆形，表明提取时间和液料比的交互作用不显著，与方差分析结果一致。当乙醇浓度和提取温度一定时，多酚提取量随提取时间的延长或液料比增加呈先增后减趋势，当提取时间为30～35 min，液料比为1‥30～1‥35时，多酚提取量最大。当乙醇浓度和提取时间一定时，多酚提取量随提取温度的增加或液料比增加呈先升后降趋势（图5）。固定乙醇浓度和液料比，多酚提取量随提取温度的增加或提取时间的延长呈抛物线型缓慢变化（图6）。交互作用的响应曲面变化平缓，等高线为近圆形，表明提取温度、提取时间、液料比3因素对多酚提取量影响较小，因素间的交互作用不显著，与方差分析结果一致（图5～6）。
2.3.3 最优条件验证 为检验模型的可靠性，根据响应曲面试验所得的优化工艺进行验证。同时根据实际操作的局限性，修正后的最佳提取条件为乙醇浓度53%、液料比1‥32、提取时间33 min、提取温度50℃，在此条件下进行3次重复试验，多酚平均提取量为6.19 mg/g，相对标准偏差为1.26%，与理论预测值（6.32 mg/g）的相对误差为-2.06%，预测值与实测值接近，说明该模型所得的优化条件参数是准确可靠的，采用响应面法得到的诺丽果多酚提取工艺参数可靠、重现性好，具有实用价值。
2.4 抗氧化能力及还原力测定结果
对验证试验所提取的诺丽果多酚进行抗氧化活性及还原力测定结果表明，采用该响应曲面模型所提取的诺丽果多酚的抗氧化能力为149.36 μmol/（L TE 当量），还原力为13.5 μmol/（g抗坏血酸当量）。由此可见，该工艺条件下提取的诺丽果中多酚具有较高的抗氧化能力及一定的还原能力。
3 讨论与结论
本试验采用单因素和响应曲面优化试验对超声波辅助提取诺丽果多酚的工艺进行优化，并建立回归模型。通过单因素试验、响应面和等高线图分析探讨各因素对提取量的作用。史运杰等[15]采用响应面法优化花红叶多酚提取工艺结果表明，当乙醇浓度过高多酚提取率下降，与本试验结果一致。这一变化的原因是由于有机溶剂浓度过高使细胞膜变性，降低细胞膜的通透性，阻碍了多酚类物质的溶出[16]。另一方面，当温度高于50 ℃，多酚提取量开始下降，这可能是由于高温促使多酚降解造成的[17]。但Karacabey等[18]认为过高的温度会导致植物组织的软化，破坏酚类化合物与蛋白质、多糖之间的相互作用，使酚类化合物的溶解度上升，提高扩散速率，从而提取量升高。因此，笔者认为这2种原因使温度对提取量的影响作用相互阻抑，多酚提取量随温度的变化呈较平缓趋势。
响应曲面法不仅克服了单因素忽视因素间互作关系的缺点，并且能够弥补其它一些试验不能在给出的整个区内找到因素和响应值之间明确回归方程的缺点[19]。经回归模型预测及验证，超声波辅助提取诺丽果多酚的最佳工艺条件为：乙醇浓度53%、液料比1‥32、提取时间33 min、提取温度50 ℃，其多酚提取量为6.19 mg/g。采用该方法提取的诺丽果多酚具有较强的抗氧化能力，抗氧化能力为149.36 μmol/（L TE当量），还原能力为13.5 μmol/（g抗坏血酸当量）。该提取工艺操作方便，减少提取时间，降低耗能，节约成本，提取产品抗氧化能力良好，是较为理想的提取多酚的方法，可以在诺丽酚类物质提取工艺筛选研究中进一步推广。
参考文献
[1] Bussmann R W， Hennig L， Giannis A， et al. Anthraquinone Content in Noni（Morinda citrifolia L.）[J]. Evidence Based Complementary and Alternative Medicine， 2013， 25（7）： 5.
[2] Wang M Y， West B J， Jensen C J， et al. Morinda citrifolia （Noni）： a literature review and recent advances in Noni research[J]. Acta Pharmacologica Sinica， 2002， 23（12）： 1 127-1 141.
[3] 孟蕲翾， 崔孟媛， 吴友根，等. 诺丽营养器官内的总黄酮含量及消长规律[J]. 热带生物学报， 2014， 5（3）： 286-289.
[4] Ramamoorthy P K， Bono A. Antioxidant activity， total phenolic and flavonoid content of Morinda citrifolia fruit extracts from various extraction processes[J]. J Eng Sci Technol， 2007， 2（1）： 70-80.
[5] Krishnaiah D， Sarbatly R， Rao Z S R M， et al. Optimal operating conditions of spray ddried Noni fruit extract using K-carrageenan as adjuvant[J]. Journal of Applied Sciences， 2009， 9（17）： 3 062-3 067.
[6] 陈师莹， 陈静慧， 陈姿秀，等. 储藏条件对海巴戟天叶萃取物之抗氧化活性与总酚类含量的影响[J]. 嘉南学报（科技类）， 2007（33）： 40-53. [7] 李颖畅， 张 笑， 吕艳芳， 等. 响应面优化超声波辅助提取紫菜多酚[J]. 中国食品学报， 2014（9）： 17-20.
[8] 马瑞丽， 张 蓉， 徐秀泉，等. 响应面分析法优化大血藤中总酚的超声提取工艺[J]. 中成药， 2013， 35（2）： 404-407.
[9] 周 辉. 响应面法优化超声波辅助乙醇提取余甘多酚的工艺研究[J]. 热带作物学报， 2013， 34（12）： 2 489-2 494.
[10] Pan Z， Qu W， Ma H， et al. Continuous and pulsed ultrasound-assisted extractions of antioxidants from pomegranate peel[J]. Ultrasonics Sonochemistry， 2012， 19（2）： 365-372.
[11] Bhadra S， Mukherjee P K， Kumar N S， et al. Anticholinesterase activity of standardized extract of Illicium verum Hook. f. fruits[J]. Fitoterapia， 2011， 82（3）： 342-346.
[12] 蔡文国. 鱼腥草总酚和黄酮含量测定及其体外抗氧化能力研究[D]. 成都： 四川农业大学，2011.
[13] Li H， Wang X， Li Y， et al. Polyphenolic compounds and antioxidant properties of selected China wines[J]. Food Chemistry， 2009， 112（2）： 454-46.
[14] Orak H H. Total antioxidant activities， phenolics， anthocyanins， polyphenoloxidase activities of selected red grape cultivars and their correlations[J]. Scientia Horticulturae， 2007， 111（3）：235-241.
[15] 史运杰， 何传波， 魏好程，等. 响应面法优化花红叶多酚提取工艺的研究[J]. 热带作物学报， 2013， 34（8）： 1 592-1 597.
[16] Ilaiyaraja N， Likhith K R， Babu G R S， et al. Optimisation of extraction of bioactive compounds from Feronia limonia （wood apple） fruit using response surface methodology（RSM）[J]. Food chemistry， 2015（173）： 348-354.
[17] Gan C Y， Latiff A A. Optimisation of the solvent extraction of bioactive compounds from Parkia speciosa pod using response surface methodology[J]. Food Chemistry， 2011， 124（3）： 1 277-1 283.
[18] Karacabey E， Mazza G. Optimisation of antioxidant activity of grape cane extracts using response surface methodology[J]. Food Chemistry， 2010， 119（1）： 343-348.
[19] Maran J P， Manikandan S， Nivetha C V， et al. Ultrasound assisted extraction of bioactive compounds from Nephelium lappaceum L. fruit peel using central composite face centered response surface design[J/OL]. Arabian Journal of Chemistry，2013. http：//www.sciencedirect.com/science/article/pii/S187853521
3000397. doi：10.1016/j.arabjc.2013.02.007.
摘 要 为提高诺丽果肉中的多酚提取量，对诺丽果粉进行超声波辅助提取并进行抗氧化活性测试。在单因素试验基础上，运用中心组合设计，通过4因素5水平的响应曲面分析法优化超声波辅助提取诺丽果多酚工艺。结果表明：最优提取工艺条件为乙醇浓度53%、液料比为1‥32、提取时间为33 min、提取温度为50 ℃。在此工艺条件下多酚提取量为6.19 mg/g，抗氧化能力为149.36 μmol/（L trolox当量），还原能力为13.5 μmol/（g抗坏血酸当量）。
关键词 诺丽；多酚；超声波辅助提取；响应曲面法
中图分类号 TS201.1 文献标识码 A
Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of
Polyphenol from NONI Using Response Surface Methodology
MENG Qixuan， WU Yougen*， CUI Mengyuan， YUAN Langxing， ZHANG Junfeng
College of Horticulture and Landscape， Hainan University/Key Laboratory of Protection， Development and Utilization
of Tropical Crop Germplasm Resources， Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228，China
Abstract To increase the extraction rate of polyphenol from noni， ultrasonic-assisted ethanol was applied. The antioxidant activity of noni extract was analyzed based on free radical scavenging activity using DPPH assay. Based on the single factor experiments， the interactive effects of four crucial parameters， including ethanol concentration， ratio of solvent to material， extraction time and temperature， were studied by central composite design and were assessed by response surface methodology（RSM）. The optimal process parameters for total extraction of polyphenol from noni were as follows： ethanol concentration was 53%，ratio of solvent to material was 1 ∶ 32， extraction time was 33 min， extraction temperature was 50 ℃. The extraction rate of polyphenol from noni was 6.19 mg/g， antioxidant activities was 149.36 μmol/L trolox equivalent， reducing ability was 13.5 μmol/g ascorbic acid equivalent.
Key words NONI；Polyphenol；Ultrasonic assisted extraction；Response surface methodology
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.09.021
诺丽（Morinda citrifolia L.）又称海巴戟，是茜草科巴戟天属植物，一种常绿小乔木或灌木，原产南太平洋诸岛，在中国海南、云南等地有分布。诺丽果实作为一种传统的药用植物，被波利尼西亚人食用已有2 000多年历史[1]。诺丽果实富含丰富的活性物质，有蒽醌类、萜类、生物碱、β-谷甾醇、多酚等[2]，具有抗菌、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、抗血栓、降血糖、消炎等功效[3]。近期研究表明，不同的干燥方法、萃取溶剂和存储条件对提取物的总酚含量和抗氧化活性有显著影响[4-6]。尽管一些研究致力于诺丽多酚成分的提取，但少有涉及其提取工艺的优化。近年来，人们对“新的提取技术、自动化提取过程、缩短提取次数、减少有机溶剂的消耗量”需求日益增加。超声波辅助提取技术已广泛地应用于紫菜[7]、鸡血藤[8]、余甘子果[9]等植物的多酚提取中。该技术简单快速、提取效率高、能耗低，并减少溶剂的消耗[10-11]。本试验通过4组单因素试验探讨了乙醇浓度、液料比、提取时间和提取温度对诺丽果中多酚提取效果的影响，并运用Central Composite Design（CCD）设计，采用4因素5水平的响应曲面分析法，优化超声波辅助提取诺丽果多酚工艺，为进一步研究诺丽果多酚的生物活性及结构提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试原料及处理 2014年6月中旬于海南儋州热科院试验农场采集生长健康，外皮呈青白色的诺丽果实，超纯水清洗后切片、晒干、粉碎后于干燥避光环境中保存备用。
1.1.2 试剂及溶液 Folin-Ciocalteu试剂、没食子酸标准品（纯度为98%）、抗坏血酸标准品、DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基）、Trolox（水溶性维生素E）、盐酸、乙醇、Na2CO3等均购于国药集团化学试剂有限公司，试验用水均为超纯水。 1.1.3 仪器与设备 XB120A电子天平（Precisa公司）、KQ-300VDE 型三频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、Certeifuge 5424R离心机（Eppendorf公司）、S53紫外分光光度计（上海棱光仪器厂）、JFSD-100粉碎机（上海淀久中药机械制造有限公司）等。
1.2 方法
1.2.1 工艺流程 诺丽果粉→过80目筛→称重→超声波提取→抽滤→离心（5 000 r/min）10 min→取清液浓缩→定容→测定吸光度（760 nm）→计算含量。
1.2.2 没食子酸标准曲线 多酚的测定以没食子酸为标准品，采用Folin-Ciocalteu比色法，参照蔡文国[12]的方法略有改动。称取0.050 g没食子酸，用蒸馏水定容至100 mL，即得到500 μg/mL的没食子酸溶液，分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL上述溶液加入到50 mL容量瓶中，加入10 mL水，摇匀。分别加入1.5 mL Folin-Cioealteu试剂，2.0 mL 20% Na2CO3，用蒸馏水定容，置于50 ℃恒温水浴锅中显色30 min，显色后于760 nm波长处测定吸光度。
1.2.3 多酚含量的测定 按1.2.1工艺流程提取诺丽果多酚，将提取后的多酚提取液适当稀释后，按照1.2.2进行检测，根据标准曲线计算诺丽果多酚含量。
1.2.4 Trolox标准曲线 参照Li[13]等研究的方法，于517 nm波长测定吸光度。
1.2.5 抗氧化能力的测定 以DPPH清除自由基活性为依据测定诺丽提取物抗氧化活性[14]。将稀释后的多酚提取液，按1.2.4测定吸光度，根据标准曲线计算诺丽果多酚的抗氧化活性。根据标准曲线，将诺丽果提取物的抗氧化能力值表示为μmol/（L TE当量）。
1.2.6 还原能力的测定 参照陈师莹等[6]研究方法，以抗坏血酸为标准品，于700 nm波长处测定吸光值，提取物还原力以标准曲线计算，表示为μmol/（g抗坏血酸当量）。
1.2.7 单因素试验 选取乙醇浓度、液料比、提取时间和提取温度4个因素，以诺丽果多酚提取量作为评价指标，进行单因素试验。固定其它条件，分别探讨乙醇浓度（25%～85%）、液料比（1‥10～1‥50）、提取时间（10～50 min）、提取温度（30～70 ℃）对诺丽果多酚提取量的影响，各因素试验重复3次，取平均值并计算标准差，各因素水平见表1。
1.2.8 响应面法优化 超声波辅助提取诺丽果中的多酚，在单因素试验的基础上，选取乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温度4个因素，采用中心组合试验CCD设计方案，进行4因素5水平试验，优化提取工艺，重复3次，取平均值并计算标准差，因素水平见表2。
1.3 数据分析
采用SPSS Statistics 20分析单因素试验结果，运用Design Expert 8.0.6建立响应曲面模型，并对超声波辅助提取试验结果，进行参数优化及统计分析。
2 结果与分析
2.1 标准曲线
没食子酸浓度y（mg/mL）与吸光度x的标准方程为：y=8.109 8x-0.079 4，相关系数R2=0.999 0，说明该检测方法下没食子酸溶液浓度与吸光度呈良好的线性关系。
trolox浓度C（μmol/L）与吸光度A的标准方程：C=-146.82A+186.84，R2=0.999 1，表明该线性关系良好。
抗坏血酸酸浓度y（μmol/g）与吸光度x的标准方程为：y=22.372x-1.692 5，R2=0.999 1。
2.2 单因素试验结果与分析
2.2.1 乙醇浓度 由表1可知，随着乙醇浓度的升高，多酚提取量呈上升趋势，当乙醇浓度为55%时，多酚提取量达最大值，随后逐渐下降。因此，乙醇浓度以55%为最佳。
2.2.2 液料比 由表1可知多酚提取量随液料比的增加而增大，当液料比达到1‥30和1‥50时，多酚提取量达最大。因此，结合溶剂用量及浓缩工艺考虑，最佳液料比为1‥30。
2.2.3 提取时间 由表1可知，随着提取时间的延长，诺丽果中多酚含量呈“先增后降”趋势，当提取时间达到30 min时，溶出的可溶性成分最多，多酚含量达到最大值。随着提取液黏度增大，损耗有所增强，故呈现出降低趋势。因此，提取时间以30 min为佳。
2.2.4 提取温度 由表1可知，提取温度为50 ℃时，诺丽果中多酚提取量最大值为5.35 mg/g。多酚提取量随着提取温度的升高而逐渐增加，达到最大值后，继而下降，但整个过程变化幅度较小。温度升高使得多酚氧化，提取量下降。因此，提取温度为50 ℃较适宜。
2.3 响应曲面分析法结果与分析
2.3.1 响应曲面试验结果及分析 运用CCD设计，根据单因素试验结果分析，以诺丽果多酚提取量为响应值，通过4因素5水平的响应曲面法优化超声波辅助提取诺丽果多酚的工艺，结果见表3。回归模型拟合将所得数据用Design Expert 8.0.6软件进行响应面分析，以多酚含量（Y）为响应值与乙醇浓度（X1）、液料比（X2）、提取时间（X3）及提取温度（X4）4因素间的回归方程为：Y=6.27-0.22X1+0.15X2+0.17X3-0.06X4+0.21X1X2+0.29X1X3+0.34X1X4 +0.13X2X3+0.13X2X4-0.13X3X4-1.73X12-0.48X22-0.35X32-0.19X42。由回归方程分析可知（表4），以多酚含量建立的回归整体模型为极显著（p<0.01）。同时模型的决定系数R2=0.909 3，F=10.03，变异系数为6.32%（<10%），失拟项=0.347 4（p>0.05），不显著，模型的Adeq Precision=10.212，该值是模型信噪比的反映。Adeq Precision>4即表明模型的响应信号足够强，可以用来拟合试验结果。综合表明该模型是合适的，可以用来分析和预测诺丽果中多酚的提取量。该模型中的一次项X2、X3显著（p<0.05），二次项X12、X22、X32、X42极显著（p<0.01），这表明此4个因素对诺丽果多酚提取量均有一定影响。经响应曲面法分析，最佳提取条件为乙醇浓度（X1）=53.37%、液料比（X2）=1‥31.54、提取时间（X3）=32.88 min、提取温度（X4）=47.50 ℃，此时诺丽果多酚提取量为6.32 mg/g。 2.3.2 响应曲面分析与优化 在其它因素不变的情况下，分析各因素间的两两交互作用对多酚提取量的影响，利用Design Expert 8.0.6软件拟合绘制模型。由图1～3可知，多酚提取量随乙醇浓度的增大快速升高，达到峰值后又迅速降低，当乙醇浓度为45%～55%，多酚提取量达到最大值。图4中等高线近似圆形，表明提取时间和液料比的交互作用不显著，与方差分析结果一致。当乙醇浓度和提取温度一定时，多酚提取量随提取时间的延长或液料比增加呈先增后减趋势，当提取时间为30～35 min，液料比为1‥30～1‥35时，多酚提取量最大。当乙醇浓度和提取时间一定时，多酚提取量随提取温度的增加或液料比增加呈先升后降趋势（图5）。固定乙醇浓度和液料比，多酚提取量随提取温度的增加或提取时间的延长呈抛物线型缓慢变化（图6）。交互作用的响应曲面变化平缓，等高线为近圆形，表明提取温度、提取时间、液料比3因素对多酚提取量影响较小，因素间的交互作用不显著，与方差分析结果一致（图5～6）。
2.3.3 最优条件验证 为检验模型的可靠性，根据响应曲面试验所得的优化工艺进行验证。同时根据实际操作的局限性，修正后的最佳提取条件为乙醇浓度53%、液料比1‥32、提取时间33 min、提取温度50℃，在此条件下进行3次重复试验，多酚平均提取量为6.19 mg/g，相对标准偏差为1.26%，与理论预测值（6.32 mg/g）的相对误差为-2.06%，预测值与实测值接近，说明该模型所得的优化条件参数是准确可靠的，采用响应面法得到的诺丽果多酚提取工艺参数可靠、重现性好，具有实用价值。
2.4 抗氧化能力及还原力测定结果
对验证试验所提取的诺丽果多酚进行抗氧化活性及还原力测定结果表明，采用该响应曲面模型所提取的诺丽果多酚的抗氧化能力为149.36 μmol/（L TE 当量），还原力为13.5 μmol/（g抗坏血酸当量）。由此可见，该工艺条件下提取的诺丽果中多酚具有较高的抗氧化能力及一定的还原能力。
3 讨论与结论
本试验采用单因素和响应曲面优化试验对超声波辅助提取诺丽果多酚的工艺进行优化，并建立回归模型。通过单因素试验、响应面和等高线图分析探讨各因素对提取量的作用。史运杰等[15]采用响应面法优化花红叶多酚提取工艺结果表明，当乙醇浓度过高多酚提取率下降，与本试验结果一致。这一变化的原因是由于有机溶剂浓度过高使细胞膜变性，降低细胞膜的通透性，阻碍了多酚类物质的溶出[16]。另一方面，当温度高于50 ℃，多酚提取量开始下降，这可能是由于高温促使多酚降解造成的[17]。但Karacabey等[18]认为过高的温度会导致植物组织的软化，破坏酚类化合物与蛋白质、多糖之间的相互作用，使酚类化合物的溶解度上升，提高扩散速率，从而提取量升高。因此，笔者认为这2种原因使温度对提取量的影响作用相互阻抑，多酚提取量随温度的变化呈较平缓趋势。
响应曲面法不仅克服了单因素忽视因素间互作关系的缺点，并且能够弥补其它一些试验不能在给出的整个区内找到因素和响应值之间明确回归方程的缺点[19]。经回归模型预测及验证，超声波辅助提取诺丽果多酚的最佳工艺条件为：乙醇浓度53%、液料比1‥32、提取时间33 min、提取温度50 ℃，其多酚提取量为6.19 mg/g。采用该方法提取的诺丽果多酚具有较强的抗氧化能力，抗氧化能力为149.36 μmol/（L TE当量），还原能力为13.5 μmol/（g抗坏血酸当量）。该提取工艺操作方便，减少提取时间，降低耗能，节约成本，提取产品抗氧化能力良好，是较为理想的提取多酚的方法，可以在诺丽酚类物质提取工艺筛选研究中进一步推广。
参考文献
[1] Bussmann R W， Hennig L， Giannis A， et al. Anthraquinone Content in Noni（Morinda citrifolia L.）[J]. Evidence Based Complementary and Alternative Medicine， 2013， 25（7）： 5.
[2] Wang M Y， West B J， Jensen C J， et al. Morinda citrifolia （Noni）： a literature review and recent advances in Noni research[J]. Acta Pharmacologica Sinica， 2002， 23（12）： 1 127-1 141.
[3] 孟蕲翾， 崔孟媛， 吴友根，等. 诺丽营养器官内的总黄酮含量及消长规律[J]. 热带生物学报， 2014， 5（3）： 286-289.
[4] Ramamoorthy P K， Bono A. Antioxidant activity， total phenolic and flavonoid content of Morinda citrifolia fruit extracts from various extraction processes[J]. J Eng Sci Technol， 2007， 2（1）： 70-80.
[5] Krishnaiah D， Sarbatly R， Rao Z S R M， et al. Optimal operating conditions of spray ddried Noni fruit extract using K-carrageenan as adjuvant[J]. Journal of Applied Sciences， 2009， 9（17）： 3 062-3 067.
[6] 陈师莹， 陈静慧， 陈姿秀，等. 储藏条件对海巴戟天叶萃取物之抗氧化活性与总酚类含量的影响[J]. 嘉南学报（科技类）， 2007（33）： 40-53. [7] 李颖畅， 张 笑， 吕艳芳， 等. 响应面优化超声波辅助提取紫菜多酚[J]. 中国食品学报， 2014（9）： 17-20.
[8] 马瑞丽， 张 蓉， 徐秀泉，等. 响应面分析法优化大血藤中总酚的超声提取工艺[J]. 中成药， 2013， 35（2）： 404-407.
[9] 周 辉. 响应面法优化超声波辅助乙醇提取余甘多酚的工艺研究[J]. 热带作物学报， 2013， 34（12）： 2 489-2 494.
[10] Pan Z， Qu W， Ma H， et al. Continuous and pulsed ultrasound-assisted extractions of antioxidants from pomegranate peel[J]. Ultrasonics Sonochemistry， 2012， 19（2）： 365-372.
[11] Bhadra S， Mukherjee P K， Kumar N S， et al. Anticholinesterase activity of standardized extract of Illicium verum Hook. f. fruits[J]. Fitoterapia， 2011， 82（3）： 342-346.
[12] 蔡文国. 鱼腥草总酚和黄酮含量测定及其体外抗氧化能力研究[D]. 成都： 四川农业大学，2011.
[13] Li H， Wang X， Li Y， et al. Polyphenolic compounds and antioxidant properties of selected China wines[J]. Food Chemistry， 2009， 112（2）： 454-46.
[14] Orak H H. Total antioxidant activities， phenolics， anthocyanins， polyphenoloxidase activities of selected red grape cultivars and their correlations[J]. Scientia Horticulturae， 2007， 111（3）：235-241.
[15] 史运杰， 何传波， 魏好程，等. 响应面法优化花红叶多酚提取工艺的研究[J]. 热带作物学报， 2013， 34（8）： 1 592-1 597.
[16] Ilaiyaraja N， Likhith K R， Babu G R S， et al. Optimisation of extraction of bioactive compounds from Feronia limonia （wood apple） fruit using response surface methodology（RSM）[J]. Food chemistry， 2015（173）： 348-354.
[17] Gan C Y， Latiff A A. Optimisation of the solvent extraction of bioactive compounds from Parkia speciosa pod using response surface methodology[J]. Food Chemistry， 2011， 124（3）： 1 277-1 283.
[18] Karacabey E， Mazza G. Optimisation of antioxidant activity of grape cane extracts using response surface methodology[J]. Food Chemistry， 2010， 119（1）： 343-348.
[19] Maran J P， Manikandan S， Nivetha C V， et al. Ultrasound assisted extraction of bioactive compounds from Nephelium lappaceum L. fruit peel using central composite face centered response surface design[J/OL]. Arabian Journal of Chemistry，2013. http：//www.sciencedirect.com/science/article/pii/S187853521
3000397. doi：10.1016/j.arabjc.2013.02.007.