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摘要：为优化甘蓝型油菜离体培养再生体系，本研究分析了影响再生频率的多个关键因素，包括品种、外植体类型、苗龄、预培养时间以及激素浓度与配比等。结果表明：品种对再生频率影响较大，Westar的外植体再生频率高于宁油18号和中双11号；不同外植体再生频率也存在差异，子叶柄的再生频率显著高于下胚轴；苗龄以4 d较好，预培养时间以2 d较适宜；预培养基中激素2，4-D最适浓度为1 mg/L，分化培养基中，6-BA/NAA比例为10 ∶ 1时子叶柄的再生频率最高，为70.79%，6-BA/NAA比例为9 ∶ 1时下胚轴的再生频率最高，达到96.73%。经过优化后，油菜外植体再生频率得到显著提高。
关键词：油菜；离体培养；再生；优化；影响因素
中图分类号： S634.304 .3 文献标志码： A 文章編号：1002-1302（2016）07-0076-04
油菜为世界第二大油料作物[1-3]，也是我国重要油料作物之一，在人类的生活和农业生产上有着极其重要的作用。油菜花具有一定观赏价值，可用作旅游资源；油菜的茎叶可食用，还可用来饲养动物；油菜种子不仅可用来榨取食用油，饼粕还可用来做饲料。此外，油菜属于可再生资源，低芥酸菜籽油中的脂肪酸碳链组成与柴油分子碳数相近，因此被认为是生物柴油最理想的原料[4]。当今育种学家把提高油菜产量和品质，培育抗病和抗逆油菜新品种作为重要内容来研究[5]。
目前，组织培养技术被广泛地应用到油菜育种中[6]，并得到了大量不同优良特性的油菜种质资源[7-12]。高效的植株再生体系是油菜基因工程育种中的重要环节。在已有的研究报道中[13-18]，油菜可用下胚轴、子叶柄、根、茎、小孢子等作为外植体来进行组织培养。经过多年研究，国内外许多机构已建立了较为成熟的油菜离体培养再生体系[19-21]。然而，研究表明，在油菜组织培养中，不同基因型、不同外植体之间的最佳再生条件存在差异，这在一定程度上阻碍了油菜转基因研究的发展。本研究主要对影响油菜离体培养再生体系的关键因素进行分析，以期摸索出一套稳定、高效的油菜遗传转化体系，为油菜组织培养提供基础数据，并进一步为通过植物转基因技术获得预期优良性状的油菜新种质奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试油菜品种有Westar、宁油18号、中双11号，由江苏省农业科学院经济作物研究所提供。
1.2 试验方法
本试验主要研究油菜离体培养再生体系的关键影响因素，包括：品种、外植体类型、苗龄、预培养时间、激素浓度和配比等。其中品种有3个，即：Westar、宁油18号、中双11号；外植体类型包括子叶柄和下胚轴；苗龄分为4、5、6 d，预培养时间分为1、2、3 d；2，4-D浓度分别为0.5、1.0、1.5 mg/L；在固定NAA或6-BA浓度的基础上（NAA基本浓度为0.4 μmol/L，6-BA基本浓度为4 μmol/L），将6-BA/NAA的配比分别调整为9 ∶ 1、10 ∶ 1、11 ∶ 1。以期从上述组合中筛选出最适合的油菜离体培养再生体系。
1.3 培养基配方
无菌苗生长培养基：1/2MS 20 g/L蔗糖 0.8%琼脂，pH值5.8；预培养基：MS 1.0 mg/L 2，4-D 9.8 μg/L AS（乙酰丁香酮），pH值5.8；芽诱导培养基：MS 0.4 μmol/L NAA 4 μmol/L 6-BA 0.2 g/L PVP（聚乙烯比咯烷酮） 5 μmol/L MES（乙-吗啉乙磺酸） 200 μmol/L AdSO4（硫酸腺嘌呤） 15 μmol/L AgNO3 250 mg/L Carb（羧苄青霉素） 0.2 μmol/L GA3 30 g/L 蔗糖 2 g/L Gelrite（植物凝胶），pH值5.8；MS培养基：MS 30 g/L 蔗糖 250 mg/L Carb 2 g/L Gelrite，pH值5.8。
1.4 离体培养程序
1.4.1 无菌苗培养 取大离心管1支，倒入种子，加适量的“84消毒液”灭菌，不停振荡20 min，再用无菌水冲洗5遍，每次30 s。清洗完的种子铺在MS培养基中，每瓶培养基50～60粒，然后将培养瓶在（25±1） ℃黑暗条件下培养3 d。后移至光下培养1 d，在25 ℃、光照度为2 000 lx、16 h/d光照条件下培养，待用。
1.4.2 预培养 将培养4～6 d的无菌苗，在底部放置了MS湿润滤纸的灭菌培养皿中，用解剖刀切下2个子叶中较大的子叶柄和下胚轴，下胚轴切成5～10 mm的小段，将切下的外植体置于预培养基上预培养2 d。
1.4.3 芽诱导培养 预培养后，将外植体转入芽诱导培养基中，在强光照下25 ℃培养4周。每隔2周换1次新鲜培养基，以保证芽的正常生长。
1.4.4 壮芽生长 将外植体转移至壮苗培养基上继续培养2～4周，16 h/d光照，25 ℃；待芽长至2～4 cm时，切分芽于MS培养基上，进一步生长。
2 结果与分析
2.1 品种和外植体对油菜离体培养再生频率的影响
采用4 d苗龄、在预培养基上预培养2 d的不同油菜品种子叶柄和下胚轴，在芽诱导分化培养基上进行诱导培养。1周左右，切口处膨大突起，陆续长出质地紧密、大小不一的浅绿色愈伤组织，10 d左右愈伤组织分化出青绿色的嫩芽。不同油菜品种离体培养再生频率存在显著差异（表1），Westar、宁油18号和中双11号3个品种子叶柄的平均再生频率分别为7079%、50.05%、35.18%，下胚轴的平均再生频率分别为5853%、28.15%、13.74%。可以看出，无论是子叶柄，还是下胚轴，Westar的再生频率均显著高于宁油18号和中双11号，并且子叶柄的再生频率显著高于下胚轴。 2.2 苗龄对油菜离体培养再生频率的影响
选取不同苗龄的子叶柄和下胚轴，在预培养2 d后进行分化培养，研究苗龄对油菜离体培养再生频率的影响，结果表明，4 d苗龄的子叶柄离体培养再生频率最高，为70.79%，显著大于5 d苗龄的再生频率再生频率，但与6 d苗龄差异不显著。苗龄对下胚轴离体培养再生频率的影响与子叶柄相似，以4 d苗龄的下胚轴再生频率最高，为58.53%，显著大于5 d苗龄的再生频率，但与6 d苗龄的再生频率差异不显著（表2）。
2.3 预培养时间对油菜离体培养再生频率的影响
采用4 d苗龄的油菜子叶柄和下胚轴，在预培养基上预培养1、2、3 d，然后转入分化培养基，待外植体诱导出芽，分别统计再生频率。结果表明，预培养时间对子叶柄的离体培养再生频率的影响不显著，1～3 d的再生频率变幅为 62.60%～70.79%。预培养时间对下胚轴的离体培养再生频率的影响达显著水平，以预培养2 d效果较好，再生频率为58.53%，显著大于3 d的再生频率，预培养1 d和2 d间差异不显著（表3）。
2.4 2，4-D浓度对油菜离体培养再生频率的影响
采用4 d苗龄的外植体，切下子叶柄和下胚轴分别于不同2，4-D浓度的预培养基上预培养2 d，然后转到芽诱导培养基上进行分化培养，统计再生频率。结果表明，2，4-D浓度为1.0 mg/L的共培养基对子叶柄再生频率最高，为7079%，显著大于0.5 mg/L和1.5 mg/L的浓度；2，4-D浓度对下胚轴再生频率的影响与子叶柄相同，以1.0 mg/L浓度
最佳，再生频率为58.53%，显著高于2，4-D浓度为0.5、1.5 mg/L 的处理（表4），因此，无论是子叶柄还是下胚轴，培养基中2，4-D最适浓度为1.0 mg/L。
2.5 6-BA/NAA对油菜离体培养再生频率的影响
采用4 d苗龄、2 d预培养的子葉柄和下胚轴，通过固定6-BA 和NAA其中之一的浓度，并调节另一种激素的浓度，形成6-BA/NAA的不同配比，在激素比例不同的分化培养基上进行分化培养，待外植体诱导出芽，统计再生频率。结果（表5）表明，固定NAA浓度的3个6-BA/NAA配比分化培养基的效果好于固定6-BA浓度的3个配比。在固定NAA浓度时，6-BA/NAA为10 ∶ 1的分化培养基对子叶柄再生频率最好，为70.79%，显著大于9 ∶ 1和11 ∶ 1的比例；而下胚轴却出现相反的结果，6-BA与NAA比例10 ∶ 1时的再生频率显著低于其他2个浓度比值，6-BA/NAA比例为9 ∶ 1时，再生频率达到96.73%。推测在6-BA/NAA为10 ∶ 1时，有利于下胚轴愈伤组织的生长，愈伤组织越长越大，越不利于愈伤组织分化出芽，从而致使再生频率较低。
3 讨论与结论
前人研究结果表明，油菜离体培养再生频率与品种、外植体类型、苗龄、预培养时间、2，4-D浓度、生长素（NAA）和细胞分裂素（6-BA）的比值都有密切的关系[15-16，21]，本研究是在前人研究的基础上开展的，试验中，培养基中其他必要成分，如AgNO3和GA3等的添加均参照其他研究者的经验[5，13，15]，试验条件的设定也比对前人的结果。
本研究结果表明，不同油菜基因型的离体培养再生频率存在显著差异，Westar的再生频率显著大于中双11号和宁油18号，并且子叶柄的再生频率普遍高于下胚轴。推测可能由于不同的基因型对愈伤组织的形成产生一定的影响，从而导致再生频率的差异。子叶柄与下胚轴再生频率存在差异的原因在于，相对于下胚轴，子叶柄有子叶在培养初期为其提供营养，并且子叶中所含的内源激素对切口处细胞分化与再生具有一定的协调促进作用，子叶柄的切割伤口也远小于下胚轴，因此子叶柄具有较强的再生能力。研究中笔者还发现，在芽诱导培养过程中，应确保子叶柄插入培养基中而子叶仍保留在培养基的上方，待培养10 d左右，转到继代培养基时，再切除子叶，这样更有利于芽的分化。
苗龄的长短对外植体的再生频率产生显著差异，本研究结果表明，苗龄4 d的子叶柄再生频率最高，与下胚轴得到的结果相似。预培养基中的2，4-D有刺激外植体切口处膨大的作用，研究发现，预培养时间的长短对子叶柄没有显著影响，而对下胚轴再生频率则存在影响，预培养2 d处理的再生频率显著大于3 d，与1 d的差异不显著。苗龄和预培养试验的结果与杜坤等的结论[5]存在差异。
植物生长调节剂对外植体形成愈伤组织，进而分化成芽具有重要意义[19-20]。在植物离体培养的过程中，植物本身的内源激素水平会不断发生变化；分化培养基加入的植物生长调节剂（6-BA和NAA）也直接影响和改变着外植体内源激素的水平，而且6-BA与NAA之间也可能相互影响。内源激素和外源激素之间的相互影响，与愈伤组织的形成和芽的诱导具有密切关系[22-24]。本研究表明，子叶柄在6-BA与NAA含量的比值为10 ∶ 1时，其再生频率显著大于其他2个水平，而下胚轴的结果却相反，推测可能是因为该比例不适于下胚轴的分化，上述结果与杨长友等的试验结果[15]相似，下胚轴对外源激素配比较敏感，当6-BA/NAA为10 ∶ 1时抑制了下胚轴愈伤组织的活性，具体原因还有待进一步研究。
再生芽的诱导过程中，出现大量的玻璃化再生苗，这种再生苗，生长迟缓，叶片厚、呈深绿色，含水量较大，透明或半透明状，叶片绿化作用小，并且慢慢会黄化，直至死亡，但通过适当处理，可以使玻璃化现象慢慢变弱，最后转化为正常植株，该方面结果已申请国家发明专利。本研究结果进一步优化了油菜离体培养条件，获得了最适合的离体培养再生体系，外植体再生频率最高达到96.73%，显著高于其他研究结果，为进一步利用转基因技术获得预期优良性状的油菜新种质奠定了基础。
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关键词：油菜；离体培养；再生；优化；影响因素
中图分类号： S634.304 .3 文献标志码： A 文章編号：1002-1302（2016）07-0076-04
油菜为世界第二大油料作物[1-3]，也是我国重要油料作物之一，在人类的生活和农业生产上有着极其重要的作用。油菜花具有一定观赏价值，可用作旅游资源；油菜的茎叶可食用，还可用来饲养动物；油菜种子不仅可用来榨取食用油，饼粕还可用来做饲料。此外，油菜属于可再生资源，低芥酸菜籽油中的脂肪酸碳链组成与柴油分子碳数相近，因此被认为是生物柴油最理想的原料[4]。当今育种学家把提高油菜产量和品质，培育抗病和抗逆油菜新品种作为重要内容来研究[5]。
目前，组织培养技术被广泛地应用到油菜育种中[6]，并得到了大量不同优良特性的油菜种质资源[7-12]。高效的植株再生体系是油菜基因工程育种中的重要环节。在已有的研究报道中[13-18]，油菜可用下胚轴、子叶柄、根、茎、小孢子等作为外植体来进行组织培养。经过多年研究，国内外许多机构已建立了较为成熟的油菜离体培养再生体系[19-21]。然而，研究表明，在油菜组织培养中，不同基因型、不同外植体之间的最佳再生条件存在差异，这在一定程度上阻碍了油菜转基因研究的发展。本研究主要对影响油菜离体培养再生体系的关键因素进行分析，以期摸索出一套稳定、高效的油菜遗传转化体系，为油菜组织培养提供基础数据，并进一步为通过植物转基因技术获得预期优良性状的油菜新种质奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试油菜品种有Westar、宁油18号、中双11号，由江苏省农业科学院经济作物研究所提供。
1.2 试验方法
本试验主要研究油菜离体培养再生体系的关键影响因素，包括：品种、外植体类型、苗龄、预培养时间、激素浓度和配比等。其中品种有3个，即：Westar、宁油18号、中双11号；外植体类型包括子叶柄和下胚轴；苗龄分为4、5、6 d，预培养时间分为1、2、3 d；2，4-D浓度分别为0.5、1.0、1.5 mg/L；在固定NAA或6-BA浓度的基础上（NAA基本浓度为0.4 μmol/L，6-BA基本浓度为4 μmol/L），将6-BA/NAA的配比分别调整为9 ∶ 1、10 ∶ 1、11 ∶ 1。以期从上述组合中筛选出最适合的油菜离体培养再生体系。
1.3 培养基配方
无菌苗生长培养基：1/2MS 20 g/L蔗糖 0.8%琼脂，pH值5.8；预培养基：MS 1.0 mg/L 2，4-D 9.8 μg/L AS（乙酰丁香酮），pH值5.8；芽诱导培养基：MS 0.4 μmol/L NAA 4 μmol/L 6-BA 0.2 g/L PVP（聚乙烯比咯烷酮） 5 μmol/L MES（乙-吗啉乙磺酸） 200 μmol/L AdSO4（硫酸腺嘌呤） 15 μmol/L AgNO3 250 mg/L Carb（羧苄青霉素） 0.2 μmol/L GA3 30 g/L 蔗糖 2 g/L Gelrite（植物凝胶），pH值5.8；MS培养基：MS 30 g/L 蔗糖 250 mg/L Carb 2 g/L Gelrite，pH值5.8。
1.4 离体培养程序
1.4.1 无菌苗培养 取大离心管1支，倒入种子，加适量的“84消毒液”灭菌，不停振荡20 min，再用无菌水冲洗5遍，每次30 s。清洗完的种子铺在MS培养基中，每瓶培养基50～60粒，然后将培养瓶在（25±1） ℃黑暗条件下培养3 d。后移至光下培养1 d，在25 ℃、光照度为2 000 lx、16 h/d光照条件下培养，待用。
1.4.2 预培养 将培养4～6 d的无菌苗，在底部放置了MS湿润滤纸的灭菌培养皿中，用解剖刀切下2个子叶中较大的子叶柄和下胚轴，下胚轴切成5～10 mm的小段，将切下的外植体置于预培养基上预培养2 d。
1.4.3 芽诱导培养 预培养后，将外植体转入芽诱导培养基中，在强光照下25 ℃培养4周。每隔2周换1次新鲜培养基，以保证芽的正常生长。
1.4.4 壮芽生长 将外植体转移至壮苗培养基上继续培养2～4周，16 h/d光照，25 ℃；待芽长至2～4 cm时，切分芽于MS培养基上，进一步生长。
2 结果与分析
2.1 品种和外植体对油菜离体培养再生频率的影响
采用4 d苗龄、在预培养基上预培养2 d的不同油菜品种子叶柄和下胚轴，在芽诱导分化培养基上进行诱导培养。1周左右，切口处膨大突起，陆续长出质地紧密、大小不一的浅绿色愈伤组织，10 d左右愈伤组织分化出青绿色的嫩芽。不同油菜品种离体培养再生频率存在显著差异（表1），Westar、宁油18号和中双11号3个品种子叶柄的平均再生频率分别为7079%、50.05%、35.18%，下胚轴的平均再生频率分别为5853%、28.15%、13.74%。可以看出，无论是子叶柄，还是下胚轴，Westar的再生频率均显著高于宁油18号和中双11号，并且子叶柄的再生频率显著高于下胚轴。 2.2 苗龄对油菜离体培养再生频率的影响
选取不同苗龄的子叶柄和下胚轴，在预培养2 d后进行分化培养，研究苗龄对油菜离体培养再生频率的影响，结果表明，4 d苗龄的子叶柄离体培养再生频率最高，为70.79%，显著大于5 d苗龄的再生频率再生频率，但与6 d苗龄差异不显著。苗龄对下胚轴离体培养再生频率的影响与子叶柄相似，以4 d苗龄的下胚轴再生频率最高，为58.53%，显著大于5 d苗龄的再生频率，但与6 d苗龄的再生频率差异不显著（表2）。
2.3 预培养时间对油菜离体培养再生频率的影响
采用4 d苗龄的油菜子叶柄和下胚轴，在预培养基上预培养1、2、3 d，然后转入分化培养基，待外植体诱导出芽，分别统计再生频率。结果表明，预培养时间对子叶柄的离体培养再生频率的影响不显著，1～3 d的再生频率变幅为 62.60%～70.79%。预培养时间对下胚轴的离体培养再生频率的影响达显著水平，以预培养2 d效果较好，再生频率为58.53%，显著大于3 d的再生频率，预培养1 d和2 d间差异不显著（表3）。
2.4 2，4-D浓度对油菜离体培养再生频率的影响
采用4 d苗龄的外植体，切下子叶柄和下胚轴分别于不同2，4-D浓度的预培养基上预培养2 d，然后转到芽诱导培养基上进行分化培养，统计再生频率。结果表明，2，4-D浓度为1.0 mg/L的共培养基对子叶柄再生频率最高，为7079%，显著大于0.5 mg/L和1.5 mg/L的浓度；2，4-D浓度对下胚轴再生频率的影响与子叶柄相同，以1.0 mg/L浓度
最佳，再生频率为58.53%，显著高于2，4-D浓度为0.5、1.5 mg/L 的处理（表4），因此，无论是子叶柄还是下胚轴，培养基中2，4-D最适浓度为1.0 mg/L。
2.5 6-BA/NAA对油菜离体培养再生频率的影响
采用4 d苗龄、2 d预培养的子葉柄和下胚轴，通过固定6-BA 和NAA其中之一的浓度，并调节另一种激素的浓度，形成6-BA/NAA的不同配比，在激素比例不同的分化培养基上进行分化培养，待外植体诱导出芽，统计再生频率。结果（表5）表明，固定NAA浓度的3个6-BA/NAA配比分化培养基的效果好于固定6-BA浓度的3个配比。在固定NAA浓度时，6-BA/NAA为10 ∶ 1的分化培养基对子叶柄再生频率最好，为70.79%，显著大于9 ∶ 1和11 ∶ 1的比例；而下胚轴却出现相反的结果，6-BA与NAA比例10 ∶ 1时的再生频率显著低于其他2个浓度比值，6-BA/NAA比例为9 ∶ 1时，再生频率达到96.73%。推测在6-BA/NAA为10 ∶ 1时，有利于下胚轴愈伤组织的生长，愈伤组织越长越大，越不利于愈伤组织分化出芽，从而致使再生频率较低。
3 讨论与结论
前人研究结果表明，油菜离体培养再生频率与品种、外植体类型、苗龄、预培养时间、2，4-D浓度、生长素（NAA）和细胞分裂素（6-BA）的比值都有密切的关系[15-16，21]，本研究是在前人研究的基础上开展的，试验中，培养基中其他必要成分，如AgNO3和GA3等的添加均参照其他研究者的经验[5，13，15]，试验条件的设定也比对前人的结果。
本研究结果表明，不同油菜基因型的离体培养再生频率存在显著差异，Westar的再生频率显著大于中双11号和宁油18号，并且子叶柄的再生频率普遍高于下胚轴。推测可能由于不同的基因型对愈伤组织的形成产生一定的影响，从而导致再生频率的差异。子叶柄与下胚轴再生频率存在差异的原因在于，相对于下胚轴，子叶柄有子叶在培养初期为其提供营养，并且子叶中所含的内源激素对切口处细胞分化与再生具有一定的协调促进作用，子叶柄的切割伤口也远小于下胚轴，因此子叶柄具有较强的再生能力。研究中笔者还发现，在芽诱导培养过程中，应确保子叶柄插入培养基中而子叶仍保留在培养基的上方，待培养10 d左右，转到继代培养基时，再切除子叶，这样更有利于芽的分化。
苗龄的长短对外植体的再生频率产生显著差异，本研究结果表明，苗龄4 d的子叶柄再生频率最高，与下胚轴得到的结果相似。预培养基中的2，4-D有刺激外植体切口处膨大的作用，研究发现，预培养时间的长短对子叶柄没有显著影响，而对下胚轴再生频率则存在影响，预培养2 d处理的再生频率显著大于3 d，与1 d的差异不显著。苗龄和预培养试验的结果与杜坤等的结论[5]存在差异。
植物生长调节剂对外植体形成愈伤组织，进而分化成芽具有重要意义[19-20]。在植物离体培养的过程中，植物本身的内源激素水平会不断发生变化；分化培养基加入的植物生长调节剂（6-BA和NAA）也直接影响和改变着外植体内源激素的水平，而且6-BA与NAA之间也可能相互影响。内源激素和外源激素之间的相互影响，与愈伤组织的形成和芽的诱导具有密切关系[22-24]。本研究表明，子叶柄在6-BA与NAA含量的比值为10 ∶ 1时，其再生频率显著大于其他2个水平，而下胚轴的结果却相反，推测可能是因为该比例不适于下胚轴的分化，上述结果与杨长友等的试验结果[15]相似，下胚轴对外源激素配比较敏感，当6-BA/NAA为10 ∶ 1时抑制了下胚轴愈伤组织的活性，具体原因还有待进一步研究。
再生芽的诱导过程中，出现大量的玻璃化再生苗，这种再生苗，生长迟缓，叶片厚、呈深绿色，含水量较大，透明或半透明状，叶片绿化作用小，并且慢慢会黄化，直至死亡，但通过适当处理，可以使玻璃化现象慢慢变弱，最后转化为正常植株，该方面结果已申请国家发明专利。本研究结果进一步优化了油菜离体培养条件，获得了最适合的离体培养再生体系，外植体再生频率最高达到96.73%，显著高于其他研究结果，为进一步利用转基因技术获得预期优良性状的油菜新种质奠定了基础。
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