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摘 要 为研究MADS-box基因在花器官发育中的功能，进一步理解兰科植物花器官发育的分子调控机理。利用RT-PCR和RACE技术从蝴蝶兰中克隆了一个MADS-box基因PhAG1a（GenBank登录号为KY399811），并利用实时荧光定量方法分析其表达特性。序列分析表明，该基因的cDNA全长为1 107 bp，含完整的开放阅读框，可编码248个氨基酸，属于C功能AGAMOUSE家族基因，与蝴蝶兰属的PhalAG1和PeMADS1基因关系最近；表达模式分析表明，PhAG1a基因在营养器官中不表达，只在蕊柱和子房中表达。在5类突变体花器官中，PhAG1a基因在退化雄蕊变异为侧瓣、侧瓣退化与蕊柱合生和侧萼片变异为唇瓣等3类突变体花器官中，PhAG1a基因的表达没有变化，在侧瓣变异为唇瓣和侧瓣顶端长出花药的突变体花器官中，PhAG1a基因在蕊柱中的表达水平显著降低。推测该基因在决定蝴蝶兰合蕊柱的发育中起重要的调控作用。
关键词 蝴蝶兰；AGAMOUSE家族；MADS-box；花器官突变体
中图分类号 S681.9 文献标识码 A
Abstract To explore the function of the MADS-box gene in the floral organ development and further understand the molecular regulation mechanism of floral organ development in orchid， a Class-C MADS-box gene PhAG1a（GenBank accession number： KY399811）was cloned from Phalaenopsis using RT-PCR and RACE. The sequence analysis indicated the cDNA full-length of the gene was 1 107 bp encoding 248 amino acid residues. The gene belonged to the C function gene of the AGAMOUSE family， which was highly homologue with PhalAG1 and PeMADS1 from Phalaenopsis. The expression motif analysis showed that the PhAG1a was not expressed in the vegetative organs， only was expressed in the column and ovary. In the 5 types of floral organ mutants， the expression level of the PhAG1a gene was not changed in the 3 types of floral organ mutants including degraded stamens converting petals， lateral petals pillared mutant and lateral sepals converting lips. The expression of the gene decreased significantly in columns in the mutants of lateral petals converting lips and lateral petals with anthers. The results suggested that the PhAG1a gene should play a crucial role in regulating column development in Phalaenopsis.
Key words Phalaenopsis spp； AGAMOUSE family； MADS-box； floral organ mutants
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.016
在花器官的“ABC”发育模型中，C类基因参与第3轮和第4轮花器官的发育。典型的C类基因AGAMOUSE（AG）在拟南芥中与A类基因互为拮抗，参与调控雄蕊和心皮的发育[1]。在单子叶植物中，麝香百合的C类基因LLAG1在拟南芥中的异源表达可引起花瓣突变为雄蕊[2]。在禾本科植物中，C类基因在进化过程中经过了基因重复[3]，演变为2个分支，小麦的TaAG-1和TaAG-2、水稻的OsMADS58和OsMADS3、玉米的ZAG1和ZMM2/3属于C类基因的不同分支，并具有极为不同的时空表达模式[4-6]。由此可见，在单子叶植物中，由于花被各轮器官不同程度的退化或特化使得花器官发育的分子调控更为复杂。研究C类基因在单子叶植物花器官发育的分子调控机理，将进一步丰富花器官发育理论，揭示自然界花器官多样性的发育调控机理。
兰科作为被子植物的第二大科，是单子叶植物中最早进化的类群，其花器官的结构既有第1轮和第2轮的区分，第2轮有唇瓣的特化，又有第3輪和第4轮的合生（雌蕊与雄蕊合生为蕊柱），因此，其花器官是研究单子叶植物花发育基因的好材料，此方面的研究也较多[7-8]。其中C类基因在蝴蝶兰（Phalaenopsis sp）[9-10]、文心兰（Oncidium Gower Ramsey）[11]、球花石斛（Dendrobium thyrsiflorum）[12]、建兰（Cymbidium ensifolium）[13]、红门兰（Orchis italica）[14]和木石斛（Dendrobium crumenatum）[15]等兰科植物中都有研究，然而不同兰科植物的C类基因有其表达特征的普遍性，也有各自表达模式的特殊性。目前C类基因在蝴蝶兰多种突变体花器官中的表达特性研究还未见报道。由于蝴蝶兰形态多样美观，花期长，观赏性强，是人们普遍喜欢的花卉，因此，对蝴蝶兰突变体花器官发育的分子调控研究将有助于进一步了解兰科植物的进化与演变，也为利用分子手段培育奇异蝴蝶兰新品种奠定基础。本研究以蝴蝶兰（Phalaenopsis spp）为材料，克隆了一个C类基因PhAG1a，研究其在蝴蝶兰不同组织和5类突变体花器官中的表达，研究结果将为进一步理解蝴蝶兰C类基因的分子调控提供资料，为蝴蝶兰的分子育种提供支持。 1 材料与方法
1.1 材料
蝴蝶兰品种‘聚宝红玫瑰’、‘内山姑娘’、‘婚宴’、‘S1024’、‘火鸟’和‘富乐夕阳’均来自郑州师范学院兰花工程中心智能温室。‘内山姑娘’、‘婚宴’、‘S1024’、‘火鸟’和‘富乐夕阳’的花器官突变株均为组培无性繁殖过程中获得。取‘聚宝红玫瑰’盛花期的叶、根、花葶、花萼、花瓣、唇瓣、蕊柱、子房及授粉后10 d的子房组织；取突变体花器官的花萼、花瓣、唇瓣和蕊柱等组织。每个样品取3个重复，取样后迅速用液氮速冻，于-80 ℃冰箱备用。
1.2 方法
1.2.1 RNA的提取 组织材料总RNA用RNAprep Pure Plant Kit（天根）提取，具体方法参照说明书进行。提取的RNA通过质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳判断总RNA的质量，并用核酸蛋白分析仪测量总RNA的浓度。
1.2.2 蝴蝶兰PhAG1a基因全长的克隆及序列分析
以蝴蝶兰品种‘聚宝红玫瑰’蕊柱的总RNA为模板，利用M-MLV反转录酶（Takara）将其反转录为cDNA，根据NCBI登录的C类MADS-box基因序列设计简并引物AG-F： 5′-CACAACAAAYAG
RCAAGTCAC-3′和AG-R： 5′-CTGGAATCAAAYGG
AGGCATM-3′，用于扩增C类基因的中间保守片段，PCR扩增体系为20 μL，含10×buffer 2 μL，每条引物0.5 μmol/L，cDNA模板1 000～2 000 ng，4种dNTPs各150 μmol/L，Taq DNA聚合酶1 U。PCR扩增程序为：95 ℃变性5 min；95 ℃ 35 s，56 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，32个循环；72 ℃延伸10 min。回收目的片段，连接到pMD19-T载体上，转入大肠杆菌DH5α菌株，进行克隆和测序。根据得到的中间片段序列，设计1对3′端特异引物：GSP3-1：5′-GGTTGCCCTAATCATCTTCTCTAC-3′，GSP3-2：5′-TTCGCAGTATTACCAACAAGAG-3′，1对5′端特异引物：GPS5-1：5′-GTGGCCTCTTGTTGGTAAT
ACTGCGA-3′，GPS5-2：5′-TATTCATAGAGGCGG
CCACGGGTA-3′，利用SMARTTM RACE Amplification kit（Clontech）进行扩增，回收扩增产物，克隆到pMD19-T载体上，转入大肠杆菌DH5α菌株，鉴定后进行测序。将5′和3′RACE得到的序列与中间片段进行拼接，并根据拼接的序列设计1对引物：AG1-ORFF：5′-ATGTTTGCTTCTTCTCAGCCAGG-3′，AG1-ORRR：5′-CAACCTCCCCATCACCCAAGT-3′，进行开放阅读框（ORF）的扩增和测序验证。引物合成和测序由上海立菲生物技术有限公司完成。基因序列的同源性分析在NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）上进行，蛋白结构域在NCBI的蛋白结构域数据库（Conserved Domain Database）中搜索；使用MEGA软件NJ法构建系统发育树。
1.2.3 蝴蝶兰PhAG1a基因的表达分析 用于定量分析的组织总RNA用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）反转录成cDNA。根据基因的全长设计1对特异引物：qAG1-F：5′-GCAGAAAAGGGAAATGGAACTC-3′，qAG1-R：5′-TGCTGGTGGGAATAACGGTC-3′，产物长度204 bp，以内参基因Actin（JN185655）为参考，引物为：Act-F：5′-GCA GCA TGA AGA TCA AGG TGG-3′，Act-R：5′-GCC TTA GAA ATC CAC ATC TGT TG-3′。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ kit（TaKaRa）进行实时荧光定量PCR反应。反应体系为25 μL，反应条件为：95 ℃ 1 min，接着 95 ℃ 15 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s（40个循环）。反应在荧光定量PCR仪（Eppendorf， Mastercycler ep realplex）上进行，3次重复。引物特异性分别通过溶解曲线分析并测序验证，相对表达量按照2-ΔΔct法计算，PhAG1a基因的表达差异通过SPSS 17.0软件进行分析。
2 结果与分析
2.1 蝴蝶兰PhAG1a基因的克隆
图1-A显示，保守片段长570 bp，经Blastn分析，该片段为AGAMOUSE-like蛋白基因片段。利用GSP3-1和GSP3-2引物扩增获得3′端目的片段为640 bp（图1-B），利用GSP5-1和GSP5-2引物扩增获得5′端目的片段为376 bp（图1-C）。ORF扩增验证得到了预期的758 bp的片段（图1-D），最终拼接获得1 107 bp的cDNA基因全长，分析表明该片段包含149 bp的5′-UTR、747 bp开放阅读框和211 bp的3′-UTR，编码248个氨基酸（图2）。将其命名为PhAG1a，提交GenBank，登录号为KY399811。
2.2 蝴蝶兰PhAG1a基因的生物信息学分析
PhAG1a基因編码的蛋白具有M、I、K和C结构域，是典型的MIKC型MADS转录因子（图2）。将PhAG1a编码的蛋白在NCBI的蛋白结构域数据库中搜索发现，该基因编码蛋白具有MADS和K-box 2个典型结构域，同时在C-端还有2个AG特征基序（图2）。另外在MADS区有18个DNA结合位点，1个磷酸化位点和19个二聚化结合界面位点（图3）。通过Blastp工具分析发现，该蛋白与其它植物的AGAMOUSE蛋白或MADS转录因子序列具有88%以上的覆盖率和64%以上的一致性，其中与小兰屿蝴蝶兰（Phalaenopsis equestris）的PeMADS1（AAL76415）和蝴蝶兰杂交种（Phalaenopsis hybrids）的PhalAG1（BAE80120）具有96%的覆盖率和100%的一致性，PhAG1a编码蛋白的N-端比PeMADS1和PhalAG1多了9个氨基酸，与球花石斛的DthyrAG1（DQ017702）、建兰的CeMADS1（ADP00515）和蕙兰（Cymbidium faber）的CfAG1（AFP19447）具有93%的一致性，与文心兰的OMADS4（AIJ29176）具有91%的一致性，与红门兰的OitaAG（AFU81324）具有85%的一致性。 为了更好地了解蝴蝶兰PhAG1a蛋白与其它MADS-box基因之间的进化关系，选取与PhAG1a蛋白一致性高的AGAMOUSE-like蛋白和有代表性MADS-box蛋白构建进化树。从图4可以看出，所分析的MADS-box蛋白包括花器官发育的A、B、C、D和E 5类功能蛋白，其中PhAG1a蛋白属于C类，与同为C类的MADS蛋白聚为一支，包括蝴蝶兰品种的PhalAG1、小兰屿蝴蝶兰的PeMADS1、文心兰的OMADS4、建兰的CeMADS1、球花石斛的DthyrAG1、红门兰的OitaAG、木石斛的DcOAG1 （DQ119840）、建兰的CeMADS2（ADP00516）和麝香百合（Lilium longiflorum）的LMADS10（AIJ29174），这些蛋白均报道属于花器官发育的C类功能基因。其中与蝴蝶兰的PhalAG1关系最近，其次是小兰屿蝴蝶兰的PeMADS1，在这一分支中与麝香百合的LMADS10关系最远。
2.3 蝴蝶兰PhAG1a基因的表达分析
為了研究PhAG1a基因在蝴蝶兰不同组织中的功能，分析了其在根、叶、花葶、花器官及5类变异花器官中的表达特性。结果表明，PhAG1a基因在根、叶和花葶中不表达，在花器官的萼片、花瓣和唇瓣中也不表达，只在花器官的蕊柱和子房中表达，其中在蕊柱中表达最高，而在授粉前和授粉后子房中的表达较低（图5）。
5类突变体花器官有：‘内山姑娘’的突变为其退化雄蕊转变为花瓣状结构（图6-A），‘婚宴’第一种突变为其侧瓣退化，一部分与蕊柱合生（‘婚宴1’，图6-B），‘S1024’的突变为其下方2个侧萼片变异为唇瓣（图6-C），‘火鸟’的突变为其侧瓣变异为唇瓣（图6-D），‘婚宴’的另一种突变体与‘火鸟’相同，也是侧瓣变异为唇瓣（‘婚宴2’，图6-E），‘富乐夕阳’的突变为其侧瓣顶端长出花药（图6-F）。PhAG1a基因在5类突变体花器官中的表达分析表明，PhAG1a基因在‘内山姑娘’、‘婚宴1’和‘S1024’等突变体花器官的萼片、花瓣、侧瓣和唇瓣中的表达水平没有变化（图6-A、B、C）；在‘火鸟’和‘婚宴2’侧瓣变异为唇瓣的突变体花器官中，PhAG1a基因在蕊柱中的表达水平明显降低，而在萼片、花瓣和唇瓣中的表达水平没有变化（图6-D、E）；在‘富乐夕阳’突变体花器官中，PhAG1a基因在萼片、花瓣和唇瓣的表达水平无明显变化，而在蕊柱中的表达水平降得更低（图6-F）。这些结果表明，侧萼变异为唇瓣、雄蕊变异为花瓣和侧瓣退化与蕊柱合生等突变体的形态建成与PhAG1a基因的表达水平无密切关系，这些形态的改变可能与其它基因的功能改变有关；而在侧瓣变异为唇瓣和侧瓣顶端长出花药的突变体中，PhAG1a基因在蕊柱中表达水平下降，推测PhAG1a基因的表达可能引起了其它基因在侧瓣的表达，进而影响了侧瓣形态的改变，PhAG1a基因间接影响了花器官第2轮的形态发育。
3 讨论
诸多研究表明，花器官发育理论从典型的“ABC”模型到“ABCDE”模型在被子植物中既具有保守性，又具有多样性[16]。基因重复成就了花器官发育基因多样的功能[17-18]。就AG家族基因而言，拟南芥有AG和SHP1/2[19]，二者在控制心皮和胚珠特征的功能上是冗余的[20]，同时SHP1/2又发生了新功能化， 具有促进果实开裂的功能[21]。兰科植物不同的C类基因在花器官发育调控中具有不同的表达模式和功能[13]。例如蝴蝶兰PeMADS1[9]和PhalAG1[10]、心兰的OMADS4[11]、建兰的CeMADS1[13]等的C类基因在蕊柱和子房中表达，而木石斛的DcOAG1为C类基因，在萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱、花药和药帽中均有表达[14]。本研究中蝴蝶兰的PhAG1a从编码蛋白序列比对结果上看，除了在N-端多了9个氨基酸残基外，与PeMADS1和PhalAG1编码蛋白完全一致，而且PhAG1a与PeMADS1和PhalAG1具有相似的表达特征，即只在花器官的蕊柱和子房中表达，在营养器官中不表达。
在本研究中，蝴蝶兰的PhAG1a在萼片变异为唇瓣的花器官中，其表达没有明显变化，说明这些花器官形态的变异与PhAG1a的表达无关。笔者前期的研究显示，一个B类基因PhPI在萼片变异为唇瓣突变体的萼片中表达水平升高[22]，说明该类突变体的形态可能与特异B类基因在萼片中表达水平升高有关。在退化雄蕊变异为花瓣和侧瓣退化与蕊柱合生的突变体花器官中，PhAG1a的表达在各轮花器官中也没有明显变化，说明PhAG1a的表达不参与这2类突变体花器官形态发育的调控。据报道，花菱草的2个C类基因EScaAG1和EScaAG2具有非常相近的序列和表达特征，其基因沉默研究显示，EScaAG1和EScaAG2基因的沉默能够导致雄蕊向花瓣和心皮向花瓣的同源转化，同时这2个基因表达的降低显著提高了B类基因的表达[23]。文心兰的OMADS1，是一个拟南芥AGL6同源基因，在拟南芥中过表达会引起花器官的萼片转换为心皮和花瓣转化为雄蕊的结构[24]，表明AGL6同源基因也参与花器官形态的建成。另有研究表明，蝴蝶兰的PhAGL6a、PhAGL6b基因也参与花器官发育的调控[25]，由此推测这2类突变体花器官的形态发生可能与未知的C类基因或者其它基因有关。
在侧瓣变为唇瓣的突变体中，PhAG1a在蕊柱中的表达显著减低，在其余花器官组织中没有检测到表达。已有研究表明，在文心兰和蝴蝶兰突变体花器官中，其侧瓣变异为唇瓣的形态与B类基因的表达有关[26-28]。本研究结果表明，C类基因在蕊柱中的降低也可能参与侧瓣变为唇瓣突变体花器官的发育。对蝴蝶兰PeMADS1（C类基因）的研究表明，在侧瓣顶端长出花药的突变体中，发现该基因在侧瓣中有表达，研究认为蝴蝶兰的C类（PeMADS1）和D类（PeMADS7）基因在E类基因的作用下构成同源或异源二聚体，调控了侧瓣雄化变异的发育[10]，而在本研究中的此类突变体花器官中，PhAG1a在侧瓣中没有检测到表达，同时在蕊柱中的表达降得更低，推测C类基因在蕊柱中的表达降低到一定程度导致了调控花药发育的基因在外轮的表达。这一表达特征与PeMADS1在突变体中的表达明显不同。联想到序列比对结果，PhAG1a在该类突变体花器官中的表达特征可能与N-端的序列有关，这些猜测还有待于进一步验证。 參考文献
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关键词 蝴蝶兰；AGAMOUSE家族；MADS-box；花器官突变体
中图分类号 S681.9 文献标识码 A
Abstract To explore the function of the MADS-box gene in the floral organ development and further understand the molecular regulation mechanism of floral organ development in orchid， a Class-C MADS-box gene PhAG1a（GenBank accession number： KY399811）was cloned from Phalaenopsis using RT-PCR and RACE. The sequence analysis indicated the cDNA full-length of the gene was 1 107 bp encoding 248 amino acid residues. The gene belonged to the C function gene of the AGAMOUSE family， which was highly homologue with PhalAG1 and PeMADS1 from Phalaenopsis. The expression motif analysis showed that the PhAG1a was not expressed in the vegetative organs， only was expressed in the column and ovary. In the 5 types of floral organ mutants， the expression level of the PhAG1a gene was not changed in the 3 types of floral organ mutants including degraded stamens converting petals， lateral petals pillared mutant and lateral sepals converting lips. The expression of the gene decreased significantly in columns in the mutants of lateral petals converting lips and lateral petals with anthers. The results suggested that the PhAG1a gene should play a crucial role in regulating column development in Phalaenopsis.
Key words Phalaenopsis spp； AGAMOUSE family； MADS-box； floral organ mutants
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.016
在花器官的“ABC”发育模型中，C类基因参与第3轮和第4轮花器官的发育。典型的C类基因AGAMOUSE（AG）在拟南芥中与A类基因互为拮抗，参与调控雄蕊和心皮的发育[1]。在单子叶植物中，麝香百合的C类基因LLAG1在拟南芥中的异源表达可引起花瓣突变为雄蕊[2]。在禾本科植物中，C类基因在进化过程中经过了基因重复[3]，演变为2个分支，小麦的TaAG-1和TaAG-2、水稻的OsMADS58和OsMADS3、玉米的ZAG1和ZMM2/3属于C类基因的不同分支，并具有极为不同的时空表达模式[4-6]。由此可见，在单子叶植物中，由于花被各轮器官不同程度的退化或特化使得花器官发育的分子调控更为复杂。研究C类基因在单子叶植物花器官发育的分子调控机理，将进一步丰富花器官发育理论，揭示自然界花器官多样性的发育调控机理。
兰科作为被子植物的第二大科，是单子叶植物中最早进化的类群，其花器官的结构既有第1轮和第2轮的区分，第2轮有唇瓣的特化，又有第3輪和第4轮的合生（雌蕊与雄蕊合生为蕊柱），因此，其花器官是研究单子叶植物花发育基因的好材料，此方面的研究也较多[7-8]。其中C类基因在蝴蝶兰（Phalaenopsis sp）[9-10]、文心兰（Oncidium Gower Ramsey）[11]、球花石斛（Dendrobium thyrsiflorum）[12]、建兰（Cymbidium ensifolium）[13]、红门兰（Orchis italica）[14]和木石斛（Dendrobium crumenatum）[15]等兰科植物中都有研究，然而不同兰科植物的C类基因有其表达特征的普遍性，也有各自表达模式的特殊性。目前C类基因在蝴蝶兰多种突变体花器官中的表达特性研究还未见报道。由于蝴蝶兰形态多样美观，花期长，观赏性强，是人们普遍喜欢的花卉，因此，对蝴蝶兰突变体花器官发育的分子调控研究将有助于进一步了解兰科植物的进化与演变，也为利用分子手段培育奇异蝴蝶兰新品种奠定基础。本研究以蝴蝶兰（Phalaenopsis spp）为材料，克隆了一个C类基因PhAG1a，研究其在蝴蝶兰不同组织和5类突变体花器官中的表达，研究结果将为进一步理解蝴蝶兰C类基因的分子调控提供资料，为蝴蝶兰的分子育种提供支持。 1 材料与方法
1.1 材料
蝴蝶兰品种‘聚宝红玫瑰’、‘内山姑娘’、‘婚宴’、‘S1024’、‘火鸟’和‘富乐夕阳’均来自郑州师范学院兰花工程中心智能温室。‘内山姑娘’、‘婚宴’、‘S1024’、‘火鸟’和‘富乐夕阳’的花器官突变株均为组培无性繁殖过程中获得。取‘聚宝红玫瑰’盛花期的叶、根、花葶、花萼、花瓣、唇瓣、蕊柱、子房及授粉后10 d的子房组织；取突变体花器官的花萼、花瓣、唇瓣和蕊柱等组织。每个样品取3个重复，取样后迅速用液氮速冻，于-80 ℃冰箱备用。
1.2 方法
1.2.1 RNA的提取 组织材料总RNA用RNAprep Pure Plant Kit（天根）提取，具体方法参照说明书进行。提取的RNA通过质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳判断总RNA的质量，并用核酸蛋白分析仪测量总RNA的浓度。
1.2.2 蝴蝶兰PhAG1a基因全长的克隆及序列分析
以蝴蝶兰品种‘聚宝红玫瑰’蕊柱的总RNA为模板，利用M-MLV反转录酶（Takara）将其反转录为cDNA，根据NCBI登录的C类MADS-box基因序列设计简并引物AG-F： 5′-CACAACAAAYAG
RCAAGTCAC-3′和AG-R： 5′-CTGGAATCAAAYGG
AGGCATM-3′，用于扩增C类基因的中间保守片段，PCR扩增体系为20 μL，含10×buffer 2 μL，每条引物0.5 μmol/L，cDNA模板1 000～2 000 ng，4种dNTPs各150 μmol/L，Taq DNA聚合酶1 U。PCR扩增程序为：95 ℃变性5 min；95 ℃ 35 s，56 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，32个循环；72 ℃延伸10 min。回收目的片段，连接到pMD19-T载体上，转入大肠杆菌DH5α菌株，进行克隆和测序。根据得到的中间片段序列，设计1对3′端特异引物：GSP3-1：5′-GGTTGCCCTAATCATCTTCTCTAC-3′，GSP3-2：5′-TTCGCAGTATTACCAACAAGAG-3′，1对5′端特异引物：GPS5-1：5′-GTGGCCTCTTGTTGGTAAT
ACTGCGA-3′，GPS5-2：5′-TATTCATAGAGGCGG
CCACGGGTA-3′，利用SMARTTM RACE Amplification kit（Clontech）进行扩增，回收扩增产物，克隆到pMD19-T载体上，转入大肠杆菌DH5α菌株，鉴定后进行测序。将5′和3′RACE得到的序列与中间片段进行拼接，并根据拼接的序列设计1对引物：AG1-ORFF：5′-ATGTTTGCTTCTTCTCAGCCAGG-3′，AG1-ORRR：5′-CAACCTCCCCATCACCCAAGT-3′，进行开放阅读框（ORF）的扩增和测序验证。引物合成和测序由上海立菲生物技术有限公司完成。基因序列的同源性分析在NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）上进行，蛋白结构域在NCBI的蛋白结构域数据库（Conserved Domain Database）中搜索；使用MEGA软件NJ法构建系统发育树。
1.2.3 蝴蝶兰PhAG1a基因的表达分析 用于定量分析的组织总RNA用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）反转录成cDNA。根据基因的全长设计1对特异引物：qAG1-F：5′-GCAGAAAAGGGAAATGGAACTC-3′，qAG1-R：5′-TGCTGGTGGGAATAACGGTC-3′，产物长度204 bp，以内参基因Actin（JN185655）为参考，引物为：Act-F：5′-GCA GCA TGA AGA TCA AGG TGG-3′，Act-R：5′-GCC TTA GAA ATC CAC ATC TGT TG-3′。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ kit（TaKaRa）进行实时荧光定量PCR反应。反应体系为25 μL，反应条件为：95 ℃ 1 min，接着 95 ℃ 15 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s（40个循环）。反应在荧光定量PCR仪（Eppendorf， Mastercycler ep realplex）上进行，3次重复。引物特异性分别通过溶解曲线分析并测序验证，相对表达量按照2-ΔΔct法计算，PhAG1a基因的表达差异通过SPSS 17.0软件进行分析。
2 结果与分析
2.1 蝴蝶兰PhAG1a基因的克隆
图1-A显示，保守片段长570 bp，经Blastn分析，该片段为AGAMOUSE-like蛋白基因片段。利用GSP3-1和GSP3-2引物扩增获得3′端目的片段为640 bp（图1-B），利用GSP5-1和GSP5-2引物扩增获得5′端目的片段为376 bp（图1-C）。ORF扩增验证得到了预期的758 bp的片段（图1-D），最终拼接获得1 107 bp的cDNA基因全长，分析表明该片段包含149 bp的5′-UTR、747 bp开放阅读框和211 bp的3′-UTR，编码248个氨基酸（图2）。将其命名为PhAG1a，提交GenBank，登录号为KY399811。
2.2 蝴蝶兰PhAG1a基因的生物信息学分析
PhAG1a基因編码的蛋白具有M、I、K和C结构域，是典型的MIKC型MADS转录因子（图2）。将PhAG1a编码的蛋白在NCBI的蛋白结构域数据库中搜索发现，该基因编码蛋白具有MADS和K-box 2个典型结构域，同时在C-端还有2个AG特征基序（图2）。另外在MADS区有18个DNA结合位点，1个磷酸化位点和19个二聚化结合界面位点（图3）。通过Blastp工具分析发现，该蛋白与其它植物的AGAMOUSE蛋白或MADS转录因子序列具有88%以上的覆盖率和64%以上的一致性，其中与小兰屿蝴蝶兰（Phalaenopsis equestris）的PeMADS1（AAL76415）和蝴蝶兰杂交种（Phalaenopsis hybrids）的PhalAG1（BAE80120）具有96%的覆盖率和100%的一致性，PhAG1a编码蛋白的N-端比PeMADS1和PhalAG1多了9个氨基酸，与球花石斛的DthyrAG1（DQ017702）、建兰的CeMADS1（ADP00515）和蕙兰（Cymbidium faber）的CfAG1（AFP19447）具有93%的一致性，与文心兰的OMADS4（AIJ29176）具有91%的一致性，与红门兰的OitaAG（AFU81324）具有85%的一致性。 为了更好地了解蝴蝶兰PhAG1a蛋白与其它MADS-box基因之间的进化关系，选取与PhAG1a蛋白一致性高的AGAMOUSE-like蛋白和有代表性MADS-box蛋白构建进化树。从图4可以看出，所分析的MADS-box蛋白包括花器官发育的A、B、C、D和E 5类功能蛋白，其中PhAG1a蛋白属于C类，与同为C类的MADS蛋白聚为一支，包括蝴蝶兰品种的PhalAG1、小兰屿蝴蝶兰的PeMADS1、文心兰的OMADS4、建兰的CeMADS1、球花石斛的DthyrAG1、红门兰的OitaAG、木石斛的DcOAG1 （DQ119840）、建兰的CeMADS2（ADP00516）和麝香百合（Lilium longiflorum）的LMADS10（AIJ29174），这些蛋白均报道属于花器官发育的C类功能基因。其中与蝴蝶兰的PhalAG1关系最近，其次是小兰屿蝴蝶兰的PeMADS1，在这一分支中与麝香百合的LMADS10关系最远。
2.3 蝴蝶兰PhAG1a基因的表达分析
為了研究PhAG1a基因在蝴蝶兰不同组织中的功能，分析了其在根、叶、花葶、花器官及5类变异花器官中的表达特性。结果表明，PhAG1a基因在根、叶和花葶中不表达，在花器官的萼片、花瓣和唇瓣中也不表达，只在花器官的蕊柱和子房中表达，其中在蕊柱中表达最高，而在授粉前和授粉后子房中的表达较低（图5）。
5类突变体花器官有：‘内山姑娘’的突变为其退化雄蕊转变为花瓣状结构（图6-A），‘婚宴’第一种突变为其侧瓣退化，一部分与蕊柱合生（‘婚宴1’，图6-B），‘S1024’的突变为其下方2个侧萼片变异为唇瓣（图6-C），‘火鸟’的突变为其侧瓣变异为唇瓣（图6-D），‘婚宴’的另一种突变体与‘火鸟’相同，也是侧瓣变异为唇瓣（‘婚宴2’，图6-E），‘富乐夕阳’的突变为其侧瓣顶端长出花药（图6-F）。PhAG1a基因在5类突变体花器官中的表达分析表明，PhAG1a基因在‘内山姑娘’、‘婚宴1’和‘S1024’等突变体花器官的萼片、花瓣、侧瓣和唇瓣中的表达水平没有变化（图6-A、B、C）；在‘火鸟’和‘婚宴2’侧瓣变异为唇瓣的突变体花器官中，PhAG1a基因在蕊柱中的表达水平明显降低，而在萼片、花瓣和唇瓣中的表达水平没有变化（图6-D、E）；在‘富乐夕阳’突变体花器官中，PhAG1a基因在萼片、花瓣和唇瓣的表达水平无明显变化，而在蕊柱中的表达水平降得更低（图6-F）。这些结果表明，侧萼变异为唇瓣、雄蕊变异为花瓣和侧瓣退化与蕊柱合生等突变体的形态建成与PhAG1a基因的表达水平无密切关系，这些形态的改变可能与其它基因的功能改变有关；而在侧瓣变异为唇瓣和侧瓣顶端长出花药的突变体中，PhAG1a基因在蕊柱中表达水平下降，推测PhAG1a基因的表达可能引起了其它基因在侧瓣的表达，进而影响了侧瓣形态的改变，PhAG1a基因间接影响了花器官第2轮的形态发育。
3 讨论
诸多研究表明，花器官发育理论从典型的“ABC”模型到“ABCDE”模型在被子植物中既具有保守性，又具有多样性[16]。基因重复成就了花器官发育基因多样的功能[17-18]。就AG家族基因而言，拟南芥有AG和SHP1/2[19]，二者在控制心皮和胚珠特征的功能上是冗余的[20]，同时SHP1/2又发生了新功能化， 具有促进果实开裂的功能[21]。兰科植物不同的C类基因在花器官发育调控中具有不同的表达模式和功能[13]。例如蝴蝶兰PeMADS1[9]和PhalAG1[10]、心兰的OMADS4[11]、建兰的CeMADS1[13]等的C类基因在蕊柱和子房中表达，而木石斛的DcOAG1为C类基因，在萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱、花药和药帽中均有表达[14]。本研究中蝴蝶兰的PhAG1a从编码蛋白序列比对结果上看，除了在N-端多了9个氨基酸残基外，与PeMADS1和PhalAG1编码蛋白完全一致，而且PhAG1a与PeMADS1和PhalAG1具有相似的表达特征，即只在花器官的蕊柱和子房中表达，在营养器官中不表达。
在本研究中，蝴蝶兰的PhAG1a在萼片变异为唇瓣的花器官中，其表达没有明显变化，说明这些花器官形态的变异与PhAG1a的表达无关。笔者前期的研究显示，一个B类基因PhPI在萼片变异为唇瓣突变体的萼片中表达水平升高[22]，说明该类突变体的形态可能与特异B类基因在萼片中表达水平升高有关。在退化雄蕊变异为花瓣和侧瓣退化与蕊柱合生的突变体花器官中，PhAG1a的表达在各轮花器官中也没有明显变化，说明PhAG1a的表达不参与这2类突变体花器官形态发育的调控。据报道，花菱草的2个C类基因EScaAG1和EScaAG2具有非常相近的序列和表达特征，其基因沉默研究显示，EScaAG1和EScaAG2基因的沉默能够导致雄蕊向花瓣和心皮向花瓣的同源转化，同时这2个基因表达的降低显著提高了B类基因的表达[23]。文心兰的OMADS1，是一个拟南芥AGL6同源基因，在拟南芥中过表达会引起花器官的萼片转换为心皮和花瓣转化为雄蕊的结构[24]，表明AGL6同源基因也参与花器官形态的建成。另有研究表明，蝴蝶兰的PhAGL6a、PhAGL6b基因也参与花器官发育的调控[25]，由此推测这2类突变体花器官的形态发生可能与未知的C类基因或者其它基因有关。
在侧瓣变为唇瓣的突变体中，PhAG1a在蕊柱中的表达显著减低，在其余花器官组织中没有检测到表达。已有研究表明，在文心兰和蝴蝶兰突变体花器官中，其侧瓣变异为唇瓣的形态与B类基因的表达有关[26-28]。本研究结果表明，C类基因在蕊柱中的降低也可能参与侧瓣变为唇瓣突变体花器官的发育。对蝴蝶兰PeMADS1（C类基因）的研究表明，在侧瓣顶端长出花药的突变体中，发现该基因在侧瓣中有表达，研究认为蝴蝶兰的C类（PeMADS1）和D类（PeMADS7）基因在E类基因的作用下构成同源或异源二聚体，调控了侧瓣雄化变异的发育[10]，而在本研究中的此类突变体花器官中，PhAG1a在侧瓣中没有检测到表达，同时在蕊柱中的表达降得更低，推测C类基因在蕊柱中的表达降低到一定程度导致了调控花药发育的基因在外轮的表达。这一表达特征与PeMADS1在突变体中的表达明显不同。联想到序列比对结果，PhAG1a在该类突变体花器官中的表达特征可能与N-端的序列有关，这些猜测还有待于进一步验证。 參考文献
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