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【摘 要】为了提高实验室对矿泉水中微生物的检测能力，参加了由中国检验检疫科学研究院测试评价中心（ACAS）组织的矿泉水中微生物检测能力验证（ACAS-PT550/551/552/553）。依据能力验证作业指导书和GB8538—2016《饮用天然矿泉水检验方法》对样品进行大肠菌群、铜绿假单胞菌、粪链球菌及产气荚膜梭菌测定，采用全自动微生物生化鉴定系统鉴定可疑菌落。结果显示，所有项目的∣统计量（Z）∣均<2.0，结果均为满意。实验室能很好地应用GB8538—2016《饮用天然矿泉水检验方法》开展微生物检测。
【关鍵词】能力验证;微生物;饮用天然矿泉水
中图分类号：TQ460.6 文献标志码：B
1材料与方法
1.1样品
本次矿泉水微生物能力验证包含4个项目，每个项目2个样品。真空西林瓶内装白色冻干物，复原后即为人工污染的矿泉水样品。由中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供，项目名称、项目代码及对应样品标识分别为大肠菌群ACAS-PT550：18-R848、18-J093;铜绿假单胞菌ACAS-PT551：18-N468、18-U473;粪链球菌ACAS-PT552：18-J636、18-K197;产气荚膜梭菌ACAS-PT553：18-H425、18-S133。
1.2仪器与试剂
HFsafe-1500LC型生物安全柜GHP-9160型隔水式恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）;GR110DR型立式高压蒸汽灭菌器（美国ZEALWAY）;VITEK2Compact全自动微生物鉴定/药敏分析系统（法国生物梅里埃公司）;DM4B型leica数字显微镜（上海徠卡显微系统贸易有限公司广州分公司）;微生物过滤系统（美国密理博）;ZF-1B型紫外分析仪（上海汗诺仪器有限公司）;电热恒温水浴锅（瑞士Salvislab）;智能气体工作站Anoxomat MARKⅡ（荷兰MART公司）。乳糖胆盐发酵培养基（批号：160829）;亮绿乳糖胆盐培养液（BGLB）（批号：170830）;KF链球菌琼脂培养基（批号：171008）;脑心浸萃液体培养基（批号：180412）;脑心浸萃琼脂培养基（180412）;假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂（批号：180512）;金氏B培养基（批号：170921）;亚硫酸盐-多黏菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS）（批号：160512）;液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）（批号：180105）;动力-硝酸盐培养基（180504）;含铁牛奶培养基（批号：180612）;卵黄琼脂培养基（批号：180409）;乙酰胺肉汤（批号：180413）;钠氏试剂（批号：180510）;3%过氧化氢酶试剂（批号：180710）;胆汁肉汤（批号：180727）;美国密理博，直径47mm，孔径0.45μm滤膜（批号：F4BA80390）;杭州吉沃，直径47mm，孔径0.45μm（批号：20180702）、0.22μm滤膜（批号：20180608）;VITEK2革兰氏阴性细菌鉴定卡（GN）（批号：2410252413）;VITEK2革兰氏阳性细菌鉴定卡（GP）（批号：2420689403）;VITEK2革兰氏厌氧菌及棒状杆菌鉴定卡（ANC）（批号：244069920）。VITEK2细菌鉴定卡由法国生物梅里埃提供，其余试剂均购自北京陆桥技术股份有限公司。
1.3方法
按照ACAS《矿泉水中微生物检测能力验证作业指导书》进行样品处理，按GB8538—2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》[3]55～58条款进行样品检测，采用VITEK2Compact全自动微生物生化鉴定系统进行菌株鉴定，综合以上试验结果出具报告。同时以粪肠球菌ATCC19433、大肠埃希氏菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、荧光假单胞菌ATCC49642、产气荚膜梭菌CICC22949作为对照菌进行阳性和阴性对照试验。试验全过程按照GB19489—2008《实验室生物安全通则要求》[4]在生物安全柜中无菌操作进行。
（1）样品水化待样品恢复至室温后，开启样品（西林瓶包装），立即加入20mL无菌水进行再水化，待溶解后，吸出放入无菌瓶中，再反复用余下的无菌水清洗西林瓶内壁（共520mL无菌水），回收清洗液放入上述无菌瓶中，此溶液即是待测样品原液，等同于520mL的待测矿泉水样品。
（2）大肠菌群多管发酵法检测，推测性检验：以无菌操作取10mL水样，加入10mL双料乳糖胆盐发酵培养液中;取1mL水样，加入10mL单料乳糖胆盐发酵培养液中;取1mL水样，加入9mL无菌生理盐水中，混匀，吸取此稀释水样1mL，加入10mL单料乳糖胆盐发酵培养液中;继续稀释水样并接种到单料乳糖胆盐发酵培养液中，共接种5个稀释梯度，每个梯度接种5份，36℃培养25h，观察每管是否产气。若有气体产生，该管则为推测性检验阳性，需进行确证性试验;若不产气则为阴性。
（3）粪链球菌检测，推测性检验：用0.45μm的滤膜分别过滤10mL、25mL、50mL、100mL、250mL待测样液原液，每个接种量都先加到一定量的无菌水中，使其最终体积为250mL，然后过滤，以无菌操作方法将滤膜贴于KF链球菌琼脂平板表面，倒置，36℃培养48h;观察平板菌落形态，挑取5个以上可疑菌落进行革兰氏染色并镜检。根据菌落特征符合情况计数所取水样中的典型菌落数。用无菌生理盐水清洗杯壁并过滤，同时用自制加标水样做对照。确证性试验：从平板上挑取5个以上可疑菌落接种到脑心浸萃琼脂培养基斜面，36℃培养24～48h，挑取所生长菌落进行氧化氢酶试验、45℃生长试验及胆汁肉汤试验。同时采用VITEK2Compact全自动微生物生化鉴定系统鉴定可疑菌落。综合以上结果计算每250mL水样中的粪链球菌数。
2结果
2.1大肠菌群
实验室采用多管发酵法检测矿泉水中的大肠菌群，每个样品接种10mL、1mL、0.1mL、0.01mL、0.001mL5个稀释梯度，结果见表1。报送结果时参照GB4789.39—2013《食品安全国家标准食品微生物学检验粪大肠菌群计数》附录B确定最适稀释度，样品18-R848大肠菌群检测结果为2400MPN/100mL，统计量（Z）=-1.1;样品18-J093大肠菌群检测结果为1300MPN/100mL，Z=1.3。两样品Z<2.0，结果满意。
2.2粪链球菌
参照能力验证作业指导书稀释倍数不超过100倍原则，选取过滤10mL、25mL、50mL、100mL及250mL5个水样量过滤，结果见表2。该项目样品目标菌纯度较高，KF链球菌平板上呈现典型的红色圆形菌落，革兰染色为阳性球菌，过氧化氢酶阳性，45℃生长试验阳性，胆汁肉汤试验生长阳性，VITEK2革兰氏阳性鉴定卡鉴定为98%粪链球菌。菌落形态及生化反应结果同阳性对照菌株一致。选取菌落数在20～100CFU的滤膜计数，最终结果报告为样品18-J636：2100CFU/250mL，Z=0.8，Z<2.0;样品18-K197：90CFU/250mL，Z=0.5，Z<2.0，结果满意。
参考文献：
[1]邓梅清，张菊梅，郭伟鹏，潘宝怡，吴清平.矿泉水中铜绿假单胞菌污染状况调查研究[J].中国卫生检验杂志，2009，19（11）：2672-2673.
（作者单位：绍兴市中测检测技术股份有限公司）
【关鍵词】能力验证;微生物;饮用天然矿泉水
中图分类号：TQ460.6 文献标志码：B
1材料与方法
1.1样品
本次矿泉水微生物能力验证包含4个项目，每个项目2个样品。真空西林瓶内装白色冻干物，复原后即为人工污染的矿泉水样品。由中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供，项目名称、项目代码及对应样品标识分别为大肠菌群ACAS-PT550：18-R848、18-J093;铜绿假单胞菌ACAS-PT551：18-N468、18-U473;粪链球菌ACAS-PT552：18-J636、18-K197;产气荚膜梭菌ACAS-PT553：18-H425、18-S133。
1.2仪器与试剂
HFsafe-1500LC型生物安全柜GHP-9160型隔水式恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）;GR110DR型立式高压蒸汽灭菌器（美国ZEALWAY）;VITEK2Compact全自动微生物鉴定/药敏分析系统（法国生物梅里埃公司）;DM4B型leica数字显微镜（上海徠卡显微系统贸易有限公司广州分公司）;微生物过滤系统（美国密理博）;ZF-1B型紫外分析仪（上海汗诺仪器有限公司）;电热恒温水浴锅（瑞士Salvislab）;智能气体工作站Anoxomat MARKⅡ（荷兰MART公司）。乳糖胆盐发酵培养基（批号：160829）;亮绿乳糖胆盐培养液（BGLB）（批号：170830）;KF链球菌琼脂培养基（批号：171008）;脑心浸萃液体培养基（批号：180412）;脑心浸萃琼脂培养基（180412）;假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂（批号：180512）;金氏B培养基（批号：170921）;亚硫酸盐-多黏菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS）（批号：160512）;液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）（批号：180105）;动力-硝酸盐培养基（180504）;含铁牛奶培养基（批号：180612）;卵黄琼脂培养基（批号：180409）;乙酰胺肉汤（批号：180413）;钠氏试剂（批号：180510）;3%过氧化氢酶试剂（批号：180710）;胆汁肉汤（批号：180727）;美国密理博，直径47mm，孔径0.45μm滤膜（批号：F4BA80390）;杭州吉沃，直径47mm，孔径0.45μm（批号：20180702）、0.22μm滤膜（批号：20180608）;VITEK2革兰氏阴性细菌鉴定卡（GN）（批号：2410252413）;VITEK2革兰氏阳性细菌鉴定卡（GP）（批号：2420689403）;VITEK2革兰氏厌氧菌及棒状杆菌鉴定卡（ANC）（批号：244069920）。VITEK2细菌鉴定卡由法国生物梅里埃提供，其余试剂均购自北京陆桥技术股份有限公司。
1.3方法
按照ACAS《矿泉水中微生物检测能力验证作业指导书》进行样品处理，按GB8538—2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》[3]55～58条款进行样品检测，采用VITEK2Compact全自动微生物生化鉴定系统进行菌株鉴定，综合以上试验结果出具报告。同时以粪肠球菌ATCC19433、大肠埃希氏菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、荧光假单胞菌ATCC49642、产气荚膜梭菌CICC22949作为对照菌进行阳性和阴性对照试验。试验全过程按照GB19489—2008《实验室生物安全通则要求》[4]在生物安全柜中无菌操作进行。
（1）样品水化待样品恢复至室温后，开启样品（西林瓶包装），立即加入20mL无菌水进行再水化，待溶解后，吸出放入无菌瓶中，再反复用余下的无菌水清洗西林瓶内壁（共520mL无菌水），回收清洗液放入上述无菌瓶中，此溶液即是待测样品原液，等同于520mL的待测矿泉水样品。
（2）大肠菌群多管发酵法检测，推测性检验：以无菌操作取10mL水样，加入10mL双料乳糖胆盐发酵培养液中;取1mL水样，加入10mL单料乳糖胆盐发酵培养液中;取1mL水样，加入9mL无菌生理盐水中，混匀，吸取此稀释水样1mL，加入10mL单料乳糖胆盐发酵培养液中;继续稀释水样并接种到单料乳糖胆盐发酵培养液中，共接种5个稀释梯度，每个梯度接种5份，36℃培养25h，观察每管是否产气。若有气体产生，该管则为推测性检验阳性，需进行确证性试验;若不产气则为阴性。
（3）粪链球菌检测，推测性检验：用0.45μm的滤膜分别过滤10mL、25mL、50mL、100mL、250mL待测样液原液，每个接种量都先加到一定量的无菌水中，使其最终体积为250mL，然后过滤，以无菌操作方法将滤膜贴于KF链球菌琼脂平板表面，倒置，36℃培养48h;观察平板菌落形态，挑取5个以上可疑菌落进行革兰氏染色并镜检。根据菌落特征符合情况计数所取水样中的典型菌落数。用无菌生理盐水清洗杯壁并过滤，同时用自制加标水样做对照。确证性试验：从平板上挑取5个以上可疑菌落接种到脑心浸萃琼脂培养基斜面，36℃培养24～48h，挑取所生长菌落进行氧化氢酶试验、45℃生长试验及胆汁肉汤试验。同时采用VITEK2Compact全自动微生物生化鉴定系统鉴定可疑菌落。综合以上结果计算每250mL水样中的粪链球菌数。
2结果
2.1大肠菌群
实验室采用多管发酵法检测矿泉水中的大肠菌群，每个样品接种10mL、1mL、0.1mL、0.01mL、0.001mL5个稀释梯度，结果见表1。报送结果时参照GB4789.39—2013《食品安全国家标准食品微生物学检验粪大肠菌群计数》附录B确定最适稀释度，样品18-R848大肠菌群检测结果为2400MPN/100mL，统计量（Z）=-1.1;样品18-J093大肠菌群检测结果为1300MPN/100mL，Z=1.3。两样品Z<2.0，结果满意。
2.2粪链球菌
参照能力验证作业指导书稀释倍数不超过100倍原则，选取过滤10mL、25mL、50mL、100mL及250mL5个水样量过滤，结果见表2。该项目样品目标菌纯度较高，KF链球菌平板上呈现典型的红色圆形菌落，革兰染色为阳性球菌，过氧化氢酶阳性，45℃生长试验阳性，胆汁肉汤试验生长阳性，VITEK2革兰氏阳性鉴定卡鉴定为98%粪链球菌。菌落形态及生化反应结果同阳性对照菌株一致。选取菌落数在20～100CFU的滤膜计数，最终结果报告为样品18-J636：2100CFU/250mL，Z=0.8，Z<2.0;样品18-K197：90CFU/250mL，Z=0.5，Z<2.0，结果满意。
参考文献：
[1]邓梅清，张菊梅，郭伟鹏，潘宝怡，吴清平.矿泉水中铜绿假单胞菌污染状况调查研究[J].中国卫生检验杂志，2009，19（11）：2672-2673.
（作者单位：绍兴市中测检测技术股份有限公司）