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【摘 要】为了提高实验室对矿泉水中微生物的检测能力,参加了由中国检验检疫科学研究院测试评价中心(ACAS)组织的矿泉水中微生物检测能力验证(ACAS-PT550/551/552/553)。依据能力验证作业指导书和GB8538—2016《饮用天然矿泉水检验方法》对样品进行大肠菌群、铜绿假单胞菌、粪链球菌及产气荚膜梭菌测定,采用全自动微生物生化鉴定系统鉴定可疑菌落。结果显示,所有项目的∣统计量(Z)∣均<2.0,结果均为满意。实验室能很好地应用GB8538—2016《饮用天然矿泉水检验方法》开展微生物检测。
【关鍵词】能力验证;微生物;饮用天然矿泉水
中图分类号:TQ460.6 文献标志码:B
1材料与方法
1.1样品
本次矿泉水微生物能力验证包含4个项目,每个项目2个样品。真空西林瓶内装白色冻干物,复原后即为人工污染的矿泉水样品。由中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供,项目名称、项目代码及对应样品标识分别为大肠菌群ACAS-PT550:18-R848、18-J093;铜绿假单胞菌ACAS-PT551:18-N468、18-U473;粪链球菌ACAS-PT552:18-J636、18-K197;产气荚膜梭菌ACAS-PT553:18-H425、18-S133。
1.2仪器与试剂
HFsafe-1500LC型生物安全柜GHP-9160型隔水式恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司);GR110DR型立式高压蒸汽灭菌器(美国ZEALWAY);VITEK2Compact全自动微生物鉴定/药敏分析系统(法国生物梅里埃公司);DM4B型leica数字显微镜(上海徠卡显微系统贸易有限公司广州分公司);微生物过滤系统(美国密理博);ZF-1B型紫外分析仪(上海汗诺仪器有限公司);电热恒温水浴锅(瑞士Salvislab);智能气体工作站Anoxomat MARKⅡ(荷兰MART公司)。乳糖胆盐发酵培养基(批号:160829);亮绿乳糖胆盐培养液(BGLB)(批号:170830);KF链球菌琼脂培养基(批号:171008);脑心浸萃液体培养基(批号:180412);脑心浸萃琼脂培养基(180412);假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂(批号:180512);金氏B培养基(批号:170921);亚硫酸盐-多黏菌素-磺胺嘧啶琼脂(SPS)(批号:160512);液体硫乙醇酸盐培养基(FTG)(批号:180105);动力-硝酸盐培养基(180504);含铁牛奶培养基(批号:180612);卵黄琼脂培养基(批号:180409);乙酰胺肉汤(批号:180413);钠氏试剂(批号:180510);3%过氧化氢酶试剂(批号:180710);胆汁肉汤(批号:180727);美国密理博,直径47mm,孔径0.45μm滤膜(批号:F4BA80390);杭州吉沃,直径47mm,孔径0.45μm(批号:20180702)、0.22μm滤膜(批号:20180608);VITEK2革兰氏阴性细菌鉴定卡(GN)(批号:2410252413);VITEK2革兰氏阳性细菌鉴定卡(GP)(批号:2420689403);VITEK2革兰氏厌氧菌及棒状杆菌鉴定卡(ANC)(批号:244069920)。VITEK2细菌鉴定卡由法国生物梅里埃提供,其余试剂均购自北京陆桥技术股份有限公司。
1.3方法
按照ACAS《矿泉水中微生物检测能力验证作业指导书》进行样品处理,按GB8538—2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》[3]55~58条款进行样品检测,采用VITEK2Compact全自动微生物生化鉴定系统进行菌株鉴定,综合以上试验结果出具报告。同时以粪肠球菌ATCC19433、大肠埃希氏菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、荧光假单胞菌ATCC49642、产气荚膜梭菌CICC22949作为对照菌进行阳性和阴性对照试验。试验全过程按照GB19489—2008《实验室生物安全通则要求》[4]在生物安全柜中无菌操作进行。
(1)样品水化待样品恢复至室温后,开启样品(西林瓶包装),立即加入20mL无菌水进行再水化,待溶解后,吸出放入无菌瓶中,再反复用余下的无菌水清洗西林瓶内壁(共520mL无菌水),回收清洗液放入上述无菌瓶中,此溶液即是待测样品原液,等同于520mL的待测矿泉水样品。
(2)大肠菌群多管发酵法检测,推测性检验:以无菌操作取10mL水样,加入10mL双料乳糖胆盐发酵培养液中;取1mL水样,加入10mL单料乳糖胆盐发酵培养液中;取1mL水样,加入9mL无菌生理盐水中,混匀,吸取此稀释水样1mL,加入10mL单料乳糖胆盐发酵培养液中;继续稀释水样并接种到单料乳糖胆盐发酵培养液中,共接种5个稀释梯度,每个梯度接种5份,36℃培养25h,观察每管是否产气。若有气体产生,该管则为推测性检验阳性,需进行确证性试验;若不产气则为阴性。
(3)粪链球菌检测,推测性检验:用0.45μm的滤膜分别过滤10mL、25mL、50mL、100mL、250mL待测样液原液,每个接种量都先加到一定量的无菌水中,使其最终体积为250mL,然后过滤,以无菌操作方法将滤膜贴于KF链球菌琼脂平板表面,倒置,36℃培养48h;观察平板菌落形态,挑取5个以上可疑菌落进行革兰氏染色并镜检。根据菌落特征符合情况计数所取水样中的典型菌落数。用无菌生理盐水清洗杯壁并过滤,同时用自制加标水样做对照。确证性试验:从平板上挑取5个以上可疑菌落接种到脑心浸萃琼脂培养基斜面,36℃培养24~48h,挑取所生长菌落进行氧化氢酶试验、45℃生长试验及胆汁肉汤试验。同时采用VITEK2Compact全自动微生物生化鉴定系统鉴定可疑菌落。综合以上结果计算每250mL水样中的粪链球菌数。
2结果
2.1大肠菌群
实验室采用多管发酵法检测矿泉水中的大肠菌群,每个样品接种10mL、1mL、0.1mL、0.01mL、0.001mL5个稀释梯度,结果见表1。报送结果时参照GB4789.39—2013《食品安全国家标准食品微生物学检验粪大肠菌群计数》附录B确定最适稀释度,样品18-R848大肠菌群检测结果为2400MPN/100mL,统计量(Z)=-1.1;样品18-J093大肠菌群检测结果为1300MPN/100mL,Z=1.3。两样品Z<2.0,结果满意。
2.2粪链球菌
参照能力验证作业指导书稀释倍数不超过100倍原则,选取过滤10mL、25mL、50mL、100mL及250mL5个水样量过滤,结果见表2。该项目样品目标菌纯度较高,KF链球菌平板上呈现典型的红色圆形菌落,革兰染色为阳性球菌,过氧化氢酶阳性,45℃生长试验阳性,胆汁肉汤试验生长阳性,VITEK2革兰氏阳性鉴定卡鉴定为98%粪链球菌。菌落形态及生化反应结果同阳性对照菌株一致。选取菌落数在20~100CFU的滤膜计数,最终结果报告为样品18-J636:2100CFU/250mL,Z=0.8,Z<2.0;样品18-K197:90CFU/250mL,Z=0.5,Z<2.0,结果满意。
参考文献:
[1]邓梅清,张菊梅,郭伟鹏,潘宝怡,吴清平.矿泉水中铜绿假单胞菌污染状况调查研究[J].中国卫生检验杂志,2009,19(11):2672-2673.
(作者单位:绍兴市中测检测技术股份有限公司)
【关鍵词】能力验证;微生物;饮用天然矿泉水
中图分类号:TQ460.6 文献标志码:B
1材料与方法
1.1样品
本次矿泉水微生物能力验证包含4个项目,每个项目2个样品。真空西林瓶内装白色冻干物,复原后即为人工污染的矿泉水样品。由中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供,项目名称、项目代码及对应样品标识分别为大肠菌群ACAS-PT550:18-R848、18-J093;铜绿假单胞菌ACAS-PT551:18-N468、18-U473;粪链球菌ACAS-PT552:18-J636、18-K197;产气荚膜梭菌ACAS-PT553:18-H425、18-S133。
1.2仪器与试剂
HFsafe-1500LC型生物安全柜GHP-9160型隔水式恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司);GR110DR型立式高压蒸汽灭菌器(美国ZEALWAY);VITEK2Compact全自动微生物鉴定/药敏分析系统(法国生物梅里埃公司);DM4B型leica数字显微镜(上海徠卡显微系统贸易有限公司广州分公司);微生物过滤系统(美国密理博);ZF-1B型紫外分析仪(上海汗诺仪器有限公司);电热恒温水浴锅(瑞士Salvislab);智能气体工作站Anoxomat MARKⅡ(荷兰MART公司)。乳糖胆盐发酵培养基(批号:160829);亮绿乳糖胆盐培养液(BGLB)(批号:170830);KF链球菌琼脂培养基(批号:171008);脑心浸萃液体培养基(批号:180412);脑心浸萃琼脂培养基(180412);假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂(批号:180512);金氏B培养基(批号:170921);亚硫酸盐-多黏菌素-磺胺嘧啶琼脂(SPS)(批号:160512);液体硫乙醇酸盐培养基(FTG)(批号:180105);动力-硝酸盐培养基(180504);含铁牛奶培养基(批号:180612);卵黄琼脂培养基(批号:180409);乙酰胺肉汤(批号:180413);钠氏试剂(批号:180510);3%过氧化氢酶试剂(批号:180710);胆汁肉汤(批号:180727);美国密理博,直径47mm,孔径0.45μm滤膜(批号:F4BA80390);杭州吉沃,直径47mm,孔径0.45μm(批号:20180702)、0.22μm滤膜(批号:20180608);VITEK2革兰氏阴性细菌鉴定卡(GN)(批号:2410252413);VITEK2革兰氏阳性细菌鉴定卡(GP)(批号:2420689403);VITEK2革兰氏厌氧菌及棒状杆菌鉴定卡(ANC)(批号:244069920)。VITEK2细菌鉴定卡由法国生物梅里埃提供,其余试剂均购自北京陆桥技术股份有限公司。
1.3方法
按照ACAS《矿泉水中微生物检测能力验证作业指导书》进行样品处理,按GB8538—2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》[3]55~58条款进行样品检测,采用VITEK2Compact全自动微生物生化鉴定系统进行菌株鉴定,综合以上试验结果出具报告。同时以粪肠球菌ATCC19433、大肠埃希氏菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、荧光假单胞菌ATCC49642、产气荚膜梭菌CICC22949作为对照菌进行阳性和阴性对照试验。试验全过程按照GB19489—2008《实验室生物安全通则要求》[4]在生物安全柜中无菌操作进行。
(1)样品水化待样品恢复至室温后,开启样品(西林瓶包装),立即加入20mL无菌水进行再水化,待溶解后,吸出放入无菌瓶中,再反复用余下的无菌水清洗西林瓶内壁(共520mL无菌水),回收清洗液放入上述无菌瓶中,此溶液即是待测样品原液,等同于520mL的待测矿泉水样品。
(2)大肠菌群多管发酵法检测,推测性检验:以无菌操作取10mL水样,加入10mL双料乳糖胆盐发酵培养液中;取1mL水样,加入10mL单料乳糖胆盐发酵培养液中;取1mL水样,加入9mL无菌生理盐水中,混匀,吸取此稀释水样1mL,加入10mL单料乳糖胆盐发酵培养液中;继续稀释水样并接种到单料乳糖胆盐发酵培养液中,共接种5个稀释梯度,每个梯度接种5份,36℃培养25h,观察每管是否产气。若有气体产生,该管则为推测性检验阳性,需进行确证性试验;若不产气则为阴性。
(3)粪链球菌检测,推测性检验:用0.45μm的滤膜分别过滤10mL、25mL、50mL、100mL、250mL待测样液原液,每个接种量都先加到一定量的无菌水中,使其最终体积为250mL,然后过滤,以无菌操作方法将滤膜贴于KF链球菌琼脂平板表面,倒置,36℃培养48h;观察平板菌落形态,挑取5个以上可疑菌落进行革兰氏染色并镜检。根据菌落特征符合情况计数所取水样中的典型菌落数。用无菌生理盐水清洗杯壁并过滤,同时用自制加标水样做对照。确证性试验:从平板上挑取5个以上可疑菌落接种到脑心浸萃琼脂培养基斜面,36℃培养24~48h,挑取所生长菌落进行氧化氢酶试验、45℃生长试验及胆汁肉汤试验。同时采用VITEK2Compact全自动微生物生化鉴定系统鉴定可疑菌落。综合以上结果计算每250mL水样中的粪链球菌数。
2结果
2.1大肠菌群
实验室采用多管发酵法检测矿泉水中的大肠菌群,每个样品接种10mL、1mL、0.1mL、0.01mL、0.001mL5个稀释梯度,结果见表1。报送结果时参照GB4789.39—2013《食品安全国家标准食品微生物学检验粪大肠菌群计数》附录B确定最适稀释度,样品18-R848大肠菌群检测结果为2400MPN/100mL,统计量(Z)=-1.1;样品18-J093大肠菌群检测结果为1300MPN/100mL,Z=1.3。两样品Z<2.0,结果满意。
2.2粪链球菌
参照能力验证作业指导书稀释倍数不超过100倍原则,选取过滤10mL、25mL、50mL、100mL及250mL5个水样量过滤,结果见表2。该项目样品目标菌纯度较高,KF链球菌平板上呈现典型的红色圆形菌落,革兰染色为阳性球菌,过氧化氢酶阳性,45℃生长试验阳性,胆汁肉汤试验生长阳性,VITEK2革兰氏阳性鉴定卡鉴定为98%粪链球菌。菌落形态及生化反应结果同阳性对照菌株一致。选取菌落数在20~100CFU的滤膜计数,最终结果报告为样品18-J636:2100CFU/250mL,Z=0.8,Z<2.0;样品18-K197:90CFU/250mL,Z=0.5,Z<2.0,结果满意。
参考文献:
[1]邓梅清,张菊梅,郭伟鹏,潘宝怡,吴清平.矿泉水中铜绿假单胞菌污染状况调查研究[J].中国卫生检验杂志,2009,19(11):2672-2673.
(作者单位:绍兴市中测检测技术股份有限公司)