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摘 要 采用不同提取液，从洗涤过的巴西橡胶树橡胶粒子中提取蛋白质，并对其进行电泳分离与质谱鉴定。分离鉴定了2个含RicinB_Lectin_2结构域的糖基识别蛋白质，分别命名为HbRBLLP-1和HbRBLLP-2。这2个蛋白质可能是橡胶粒子膜蛋白质或是与橡胶粒子有较强的相互作用的蛋白质。对HbRBLLP-1及HbRBLLP-2进行生物信息学分析，结果表明它们的RicinB_Lectin_2结构域均仅有1个Q-x-W模体，而非蓖麻毒素B链所具有的（Q-x-W）3模体。
关键词 巴西橡胶树 ；橡胶粒子 ；蛋白质 ；RicinB_Lectin_2结构域
分类号 S794.1
Abstract Proteins extracted with different buffers from washed Hevea brasiliensis rubber particles were subjected to electrophoresis and mass spectrometry analysis. Two carbohydrate binding RicinB_Lectin_2 domain containing proteins were isolated and identified， and these two proteins were designated as HbRBLLP-1 and HbRBLLP-2， respectively. These two proteins may be membrane proteins of rubber particles or proteins have a strong interaction with rubber particles. Bioinformatics analysis was also carried out on these two proteins. Bioinformatics analysis showed that HbRBLLP-1 and HbRBLLP-2 have only one QxW motif in their RicinB_Lectin_2 domain， respectively； whereas， ricin B chain has a （QxW）3 motif.
Keywords Hevea brasiliensis ； rubber particles ； protein ； RicinB_Lectin_2 domain
巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）几乎是工业用途天然橡胶的唯一来源[1]。天然橡胶合成的最重要步骤是从异戊二烯焦磷酸多聚化为顺式聚异戊二烯的过程，该过程发生于乳管细胞的特定细胞器橡胶粒子的表面[2-3]。橡胶粒子膜结合的橡胶转移酶或橡胶转移酶及辅助因子组成的复合体被认为催化了这一过程[1]。然而橡胶转移酶及其辅助因子未能确定，因此橡胶生物合成的机理至今未能阐明。
为了阐明橡胶生物合成的机理，研究人员进行了分离纯化橡胶转移酶[3-5]及其它橡胶粒子蛋白质的研究。目前，2个最高丰度的橡胶粒子蛋白质得到了分离鉴定：Dennis等[6]报道了橡胶延伸因子（Rubber elongation factor，REF）的氨基酸序列，Oh等[7]报道了小橡胶粒子蛋白（Small rubber particle protein，SRPP）的氨基酸序列。此后，一些REF及SRPP异构体序列信息被提交至NCBI蛋白质数据库。Zeng等[8]报道了定位于橡胶粒子上的K+依赖的Ⅳ型焦磷酸酶。彭世清等[9]克隆了1个编码橡胶粒子膜结合的43 ku多聚泛素的基因。代龙军等[10]利用磺基异硫氰酸苯酯（SPITC）化学辅助质谱从头测序法鉴定了1个新的REF蛋白异构体，命名为REF2。但关于橡胶粒子蛋白质的报道仍然不够丰富，橡胶粒子蛋白质的全面鉴定是阐明橡胶生物合成机理及胶乳凝聚机理的重要基础性研究工作。
最近，本实验室采用不同的提取液，从洗涤过的橡胶树橡胶粒子中提取橡胶粒子蛋白质，并且进行16-BAC/SDS PAGE双向电泳分析[10-11]，采用新公布的基因组及转录组测序数据库[12]进行质谱鉴定，使一些不能从检索NCBI植物蛋白质库获得鉴定的蛋白质得到了鉴定[11]，如醌氧化还原酶、含蓖麻毒素B链凝集素结构域蛋白及枯萎/脱水相关蛋白等，其中2个新鉴定的含蓖麻毒素B链凝集素（RicinB_Lectin_2）结构域蛋白质命名为HbRBLLP-1及HbRBLLP-2。本研究对为HbRBLLP-1和HbRBLLP-2编码的基因序列进行了PCR扩增验证，并对这2个蛋白质进行了生物信息学分1.2 方法
采用不同提取液抽提橡胶粒子蛋白质，并进行双向电泳分析[10-11]，采用新公布的基因组及转录组测序数据库[12]进行质谱鉴定。蛋白质提取、电泳、质谱鉴定等使用的材料与方法请参见代龙军等[10-11]的文献资料。
1.2.1 橡胶树胶乳总RNA提取
参照曾日中等[13]的方法提取胶乳总RNA。
1.2.2 cDNA第一链合成
使用Invitrogen公司3′RACE试剂盒中的反转录酶及AP引物参照说明书进行反转录获得cDNA第一链。
1.2.3 基因ORF区的扩增
2个新发现的蛋白质点所匹配的橡胶树转录组组装序列（Transcriptome Shotgun Assembly，TSA），即gi|387086993和gi|387077282已具备完整的ORF，采用Oligo 7软件从ORF两侧设计引物，如表1所示。基因的扩增采用热启动Taq酶，并按Touch down程序[14]进行扩增。PCR产物经凝胶电泳（胶浓度为1%）、切胶回收后连入pMD-18T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行菌落PCR筛选阳性克隆，并送往Invitrogen公司进行核酸测序。 2 结果与分析
2.1 2个蛋白质的16-BAC/SDS PAGE及质谱鉴定结果
2种配方提取液抽提蛋白质的16-BAC/SDS PAGE图谱可分别查阅参考文献[10]和[11]，HbRbllP-1为文献[11]图2中的5号点，HbRbllP-2为文献[10]图2中的18号点，质谱鉴定结果如表2所示。2个蛋白质均以远高于阈值（69分）的得分被鉴定，将2个蛋白质分别命名为HbRBLLP-1（H. brasiliensis ricin B lectin like protein，对应基因的登录号为gi|387086993）和HbRBLLP-2（对应基因的登录号为gi|387077282）。
2.2 核酸序列PCR验证结果
依据从NCBI获得的核酸序列，使用gi|387086993的1对引物应扩增609 bp的核酸片段，使用gi|387077282的1对引物应扩增1 167 bp的核酸片段。由图1可知，2个基因的扩增结果与预期的片段长度吻合，测序结果也与从NCBI获取的TSA序列相吻合。HbRBLLP-1与 HbRBLLP-2的氨基酸序列比对结果见图2，结果显示2个蛋白质的氨基酸序列长短不一，序列一致性为49.5%。
2.3 氨基酸序列的生物信息学分析结果
使用ProParam工具（http：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白质的理化性质，结果见表3。结果显示，2个蛋白质具有不同的等电点，HbRBLLP-1呈弱碱性，HbRBLLP-2呈弱酸性。
采用SignalP4.1工具进行蛋白质信号肽序列预测，结果发现HbRBLLP-1与 HbRBLLP-2均无引导蛋白质定位至叶绿体或线粒体的信号肽序列。使用TMHMM Server v2.0工具分析，结果发现2个蛋白质均无跨膜区，然而，对丰度最高的REF（gi|21689593）和SRPP（gi|14423933）进行跨膜区分析，发现这2个蛋白质也无典型的跨膜区[15，7]，但它们是公认的橡胶粒子膜蛋白质。与此形成鲜明对照的是，同样具有半单位膜结构的油体的结构蛋白—油质蛋白（oleosin）具有2个典型的跨膜结构域。使用PredictProtein工具进行二级结构分析，结果发现，HbRBLLP-1主要包含β折叠和Loop结构，无螺旋结构；HbRBLLP-2主要包含折叠和Loop结构，包含1个仅由5个氨基酸残基（209～213）构成的α螺旋结构。
使用NCBI的BLASTP工具进行结构域分析，HbRBLLP-1和 HbRBLLP-2为pfam14200保守结构域蛋白质（ricin-type beta-trefoil lectin domain-like）。pfam14200家族目前包含52个可查询的蛋白质，其中3个来源于蘑菇的凝集素已确定三级结构：2X2S[16]、2IHO[17]和3NBE[18]。这3个凝集素的活性形式均为相同亚基构成的二聚体，每个亚基含有单一的RicinB lectin结构域，因此只有1个糖结合位点，二聚体凝集素的双重糖结合位点使之具有凝集活性。其中2X2S、3NBE的RicinB lectin结构域在C端，2IHO的RicinB lectin结构域在N端。
蓖麻毒素B链（Ricin B）具有2个同源的Ricnin结构域（每个结构域包含α、β、γ三个同源的长度为40个氨基酸残基的亚结构域，每个亚结构域都有1个Q-x-W保守结构[19]），2个Ricnin结构域各自包含的（Q-x-W）3模体及糖结合位点；HbRBLLP-1和 HbRBLLP-2均含有单个RicinB_Lectin_2结构域，且都存在于蛋白质的C端（图3），但它们的RicinB_Lectin_2结构域均仅有1个Q-x-W模体，而非蓖麻毒素B链所具有的（Q-x-W）3模体。
3 讨论与结论
3.1 HbRBLLP-1和HbRBLLP-2与橡胶粒子的关系
研究结果发现，分子量较小的HbRBLLP-1比分子量较大的HbRBLLP-2更容易被提取。仅用1% Na2CO3水溶液或更弱的提取液即可将HbRBLLP-1从洗涤过的橡胶粒子中提取[11]；而HbRBLLP-2需用更强的提取液（配方分别见文献[10]和[11]）抽提。同源蛋白质中分子量较大的蛋白质与橡胶粒子结合更紧密的现象也存在于REF及SRPP异构体中[11]。
橡胶粒子膜为半单位膜结构，橡胶粒子内部为疏水的橡胶烃，蛋白质存在于橡胶粒子膜或橡胶粒子表面。经过3次洗涤，橡胶粒子上仍存在HbRBLLP-1和 HbRBLLP-2，推测它们是橡胶粒子膜蛋白或与橡胶粒子有较强的相互作用。研究结果表明，橡胶粒子中HbRBLLP-1和 HbRBLLP-2的丰度均不高，可排除因含量特别高而在橡胶粒子洗涤过程中蛋白质未被溶液充分置换与稀释的可能。
HbRBLLP-1和 HbRBLLP-2与橡胶粒子的较强结合，可能与橡胶粒子存在功能上的关联，这需要进一步的研究予以证实。关于这2个蛋白质是否橡胶粒子膜蛋白质的问题，无法通过TMHMM Server v2.0等工具分析得出简单的结论。
3.2 HbRBLLP-1和HbRBLLP-2的功能
Ricin超家族蛋白质与酶催化活性、抑制性毒性及信号转导相关。具有RicinB_Lectin_2结构域的蛋白质是Ricin超家族蛋白质的一个分支，具有糖基识别功能，如凝集素、糖苷酶等。HbRBLLP-1和 HbRBLLP-2具有RicinB_Lectin_2结构域，因此具有糖基识别功能，但具体功能有待进一步研究。
目前已报道的橡胶树凝集素有Hevein（4.7 ku），它是胶乳中的一个高丰度蛋白质，是一种抗真菌凝集素[18]，在胶乳凝集中起着重要作用[19]。Wititsuwannakul等[20]发现了1个17 ku的橡胶树凝集素，也参与胶乳凝集，但未获得该蛋白质的核酸及蛋白质序列信息。需要从胶乳中纯化或进行重组表达HbRBLLP-1和HbRBLLP-2，以获得足够的量进行生物活性研究，如凝集实验等，以探知它们的确切功能。 参考文献
[1] Cornish K. Biochemistry of natural rubber， a vital raw material， emphasizing biosynthetic rate， molecular weight and compartmentalization，in evolutionarily divergent plant species[J]. Natural Products Reports， 2001， 18（2）： 182-189.
[2] Archer B L， Audley B G， Cockbain E G， et al. The biosynthesis of rubber. Incorporation of mevalonate and isopentenyl pyrophosphate into rubber by Hevea brasiliensis-latex fractions[J]. Biochemical Journal， 1963， 89（3）： 565-574.
[3] McMullen A I， McSweeney G P. The biosynthesis of rubber：Incorporation of isopentenyl pyrophosphate into purified rubber particles by a soluble latex serum enzyme[J]. Biochemical Journal， 1966， 101（1）： 42-47.
[4] Archer B L， Cockbain E G. Rubber transferase from Hevea brasiliensis latex[J]. Methods in Enzymology， 1969， 15： 476-480.
[5] Light D R， Dennis M S. Purification of a prenyltransferase that elongates cis-polyisoprene rubber from the latex of Hevea brasiliensis[J]. Journal of Biological Chemistry，1989，264（31）：18 589-18 597.
[6] Dennis M S， Light D R. Rubber elongation factor from Hevea brasiliensis. Identification，characterization，and role in rubber biosynthesis[J]. Journal of Biological Chemistry， 1989， 264（31）：18 608-18 617.
[7] Oh S K， Kang H， Shin D H， et al. Isolation，characterization， and functional analysis of a novel cDNA clone encoding a small rubber particle protein from Hevea brasiliensis[J]. Journal of Biological Chemistry， 1999， 274（24）： 17 132-17 138.
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[20] Parijs J， Broekaert W F， Goldstein I J， et al. Hevein：an antifungal protein from rubber-tree （Hevea brasiliensis）latex[J]. Planta， 1991， 183（2）：258-264.
[21] Gidrol X， Chrestin H， Tan H L， et al. Hevein，a lectin-like protein from Hevea brasiliensis （rubber tree）is involved in the coagulation of latex[J]. Journal of Biological Chemistry， 1994， 269（12）： 9 278-9 283.
[22] Wititsuwannakul R， Pasitkul P， Kanokwiroon K， et al. A role for a Hevea latex lectin-like protein in mediating rubber particle aggregation and latex coagulation[J]. Phytochemistry， 2008， 69（2）： 339-347.
关键词 巴西橡胶树 ；橡胶粒子 ；蛋白质 ；RicinB_Lectin_2结构域
分类号 S794.1
Abstract Proteins extracted with different buffers from washed Hevea brasiliensis rubber particles were subjected to electrophoresis and mass spectrometry analysis. Two carbohydrate binding RicinB_Lectin_2 domain containing proteins were isolated and identified， and these two proteins were designated as HbRBLLP-1 and HbRBLLP-2， respectively. These two proteins may be membrane proteins of rubber particles or proteins have a strong interaction with rubber particles. Bioinformatics analysis was also carried out on these two proteins. Bioinformatics analysis showed that HbRBLLP-1 and HbRBLLP-2 have only one QxW motif in their RicinB_Lectin_2 domain， respectively； whereas， ricin B chain has a （QxW）3 motif.
Keywords Hevea brasiliensis ； rubber particles ； protein ； RicinB_Lectin_2 domain
巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）几乎是工业用途天然橡胶的唯一来源[1]。天然橡胶合成的最重要步骤是从异戊二烯焦磷酸多聚化为顺式聚异戊二烯的过程，该过程发生于乳管细胞的特定细胞器橡胶粒子的表面[2-3]。橡胶粒子膜结合的橡胶转移酶或橡胶转移酶及辅助因子组成的复合体被认为催化了这一过程[1]。然而橡胶转移酶及其辅助因子未能确定，因此橡胶生物合成的机理至今未能阐明。
为了阐明橡胶生物合成的机理，研究人员进行了分离纯化橡胶转移酶[3-5]及其它橡胶粒子蛋白质的研究。目前，2个最高丰度的橡胶粒子蛋白质得到了分离鉴定：Dennis等[6]报道了橡胶延伸因子（Rubber elongation factor，REF）的氨基酸序列，Oh等[7]报道了小橡胶粒子蛋白（Small rubber particle protein，SRPP）的氨基酸序列。此后，一些REF及SRPP异构体序列信息被提交至NCBI蛋白质数据库。Zeng等[8]报道了定位于橡胶粒子上的K+依赖的Ⅳ型焦磷酸酶。彭世清等[9]克隆了1个编码橡胶粒子膜结合的43 ku多聚泛素的基因。代龙军等[10]利用磺基异硫氰酸苯酯（SPITC）化学辅助质谱从头测序法鉴定了1个新的REF蛋白异构体，命名为REF2。但关于橡胶粒子蛋白质的报道仍然不够丰富，橡胶粒子蛋白质的全面鉴定是阐明橡胶生物合成机理及胶乳凝聚机理的重要基础性研究工作。
最近，本实验室采用不同的提取液，从洗涤过的橡胶树橡胶粒子中提取橡胶粒子蛋白质，并且进行16-BAC/SDS PAGE双向电泳分析[10-11]，采用新公布的基因组及转录组测序数据库[12]进行质谱鉴定，使一些不能从检索NCBI植物蛋白质库获得鉴定的蛋白质得到了鉴定[11]，如醌氧化还原酶、含蓖麻毒素B链凝集素结构域蛋白及枯萎/脱水相关蛋白等，其中2个新鉴定的含蓖麻毒素B链凝集素（RicinB_Lectin_2）结构域蛋白质命名为HbRBLLP-1及HbRBLLP-2。本研究对为HbRBLLP-1和HbRBLLP-2编码的基因序列进行了PCR扩增验证，并对这2个蛋白质进行了生物信息学分1.2 方法
采用不同提取液抽提橡胶粒子蛋白质，并进行双向电泳分析[10-11]，采用新公布的基因组及转录组测序数据库[12]进行质谱鉴定。蛋白质提取、电泳、质谱鉴定等使用的材料与方法请参见代龙军等[10-11]的文献资料。
1.2.1 橡胶树胶乳总RNA提取
参照曾日中等[13]的方法提取胶乳总RNA。
1.2.2 cDNA第一链合成
使用Invitrogen公司3′RACE试剂盒中的反转录酶及AP引物参照说明书进行反转录获得cDNA第一链。
1.2.3 基因ORF区的扩增
2个新发现的蛋白质点所匹配的橡胶树转录组组装序列（Transcriptome Shotgun Assembly，TSA），即gi|387086993和gi|387077282已具备完整的ORF，采用Oligo 7软件从ORF两侧设计引物，如表1所示。基因的扩增采用热启动Taq酶，并按Touch down程序[14]进行扩增。PCR产物经凝胶电泳（胶浓度为1%）、切胶回收后连入pMD-18T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行菌落PCR筛选阳性克隆，并送往Invitrogen公司进行核酸测序。 2 结果与分析
2.1 2个蛋白质的16-BAC/SDS PAGE及质谱鉴定结果
2种配方提取液抽提蛋白质的16-BAC/SDS PAGE图谱可分别查阅参考文献[10]和[11]，HbRbllP-1为文献[11]图2中的5号点，HbRbllP-2为文献[10]图2中的18号点，质谱鉴定结果如表2所示。2个蛋白质均以远高于阈值（69分）的得分被鉴定，将2个蛋白质分别命名为HbRBLLP-1（H. brasiliensis ricin B lectin like protein，对应基因的登录号为gi|387086993）和HbRBLLP-2（对应基因的登录号为gi|387077282）。
2.2 核酸序列PCR验证结果
依据从NCBI获得的核酸序列，使用gi|387086993的1对引物应扩增609 bp的核酸片段，使用gi|387077282的1对引物应扩增1 167 bp的核酸片段。由图1可知，2个基因的扩增结果与预期的片段长度吻合，测序结果也与从NCBI获取的TSA序列相吻合。HbRBLLP-1与 HbRBLLP-2的氨基酸序列比对结果见图2，结果显示2个蛋白质的氨基酸序列长短不一，序列一致性为49.5%。
2.3 氨基酸序列的生物信息学分析结果
使用ProParam工具（http：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白质的理化性质，结果见表3。结果显示，2个蛋白质具有不同的等电点，HbRBLLP-1呈弱碱性，HbRBLLP-2呈弱酸性。
采用SignalP4.1工具进行蛋白质信号肽序列预测，结果发现HbRBLLP-1与 HbRBLLP-2均无引导蛋白质定位至叶绿体或线粒体的信号肽序列。使用TMHMM Server v2.0工具分析，结果发现2个蛋白质均无跨膜区，然而，对丰度最高的REF（gi|21689593）和SRPP（gi|14423933）进行跨膜区分析，发现这2个蛋白质也无典型的跨膜区[15，7]，但它们是公认的橡胶粒子膜蛋白质。与此形成鲜明对照的是，同样具有半单位膜结构的油体的结构蛋白—油质蛋白（oleosin）具有2个典型的跨膜结构域。使用PredictProtein工具进行二级结构分析，结果发现，HbRBLLP-1主要包含β折叠和Loop结构，无螺旋结构；HbRBLLP-2主要包含折叠和Loop结构，包含1个仅由5个氨基酸残基（209～213）构成的α螺旋结构。
使用NCBI的BLASTP工具进行结构域分析，HbRBLLP-1和 HbRBLLP-2为pfam14200保守结构域蛋白质（ricin-type beta-trefoil lectin domain-like）。pfam14200家族目前包含52个可查询的蛋白质，其中3个来源于蘑菇的凝集素已确定三级结构：2X2S[16]、2IHO[17]和3NBE[18]。这3个凝集素的活性形式均为相同亚基构成的二聚体，每个亚基含有单一的RicinB lectin结构域，因此只有1个糖结合位点，二聚体凝集素的双重糖结合位点使之具有凝集活性。其中2X2S、3NBE的RicinB lectin结构域在C端，2IHO的RicinB lectin结构域在N端。
蓖麻毒素B链（Ricin B）具有2个同源的Ricnin结构域（每个结构域包含α、β、γ三个同源的长度为40个氨基酸残基的亚结构域，每个亚结构域都有1个Q-x-W保守结构[19]），2个Ricnin结构域各自包含的（Q-x-W）3模体及糖结合位点；HbRBLLP-1和 HbRBLLP-2均含有单个RicinB_Lectin_2结构域，且都存在于蛋白质的C端（图3），但它们的RicinB_Lectin_2结构域均仅有1个Q-x-W模体，而非蓖麻毒素B链所具有的（Q-x-W）3模体。
3 讨论与结论
3.1 HbRBLLP-1和HbRBLLP-2与橡胶粒子的关系
研究结果发现，分子量较小的HbRBLLP-1比分子量较大的HbRBLLP-2更容易被提取。仅用1% Na2CO3水溶液或更弱的提取液即可将HbRBLLP-1从洗涤过的橡胶粒子中提取[11]；而HbRBLLP-2需用更强的提取液（配方分别见文献[10]和[11]）抽提。同源蛋白质中分子量较大的蛋白质与橡胶粒子结合更紧密的现象也存在于REF及SRPP异构体中[11]。
橡胶粒子膜为半单位膜结构，橡胶粒子内部为疏水的橡胶烃，蛋白质存在于橡胶粒子膜或橡胶粒子表面。经过3次洗涤，橡胶粒子上仍存在HbRBLLP-1和 HbRBLLP-2，推测它们是橡胶粒子膜蛋白或与橡胶粒子有较强的相互作用。研究结果表明，橡胶粒子中HbRBLLP-1和 HbRBLLP-2的丰度均不高，可排除因含量特别高而在橡胶粒子洗涤过程中蛋白质未被溶液充分置换与稀释的可能。
HbRBLLP-1和 HbRBLLP-2与橡胶粒子的较强结合，可能与橡胶粒子存在功能上的关联，这需要进一步的研究予以证实。关于这2个蛋白质是否橡胶粒子膜蛋白质的问题，无法通过TMHMM Server v2.0等工具分析得出简单的结论。
3.2 HbRBLLP-1和HbRBLLP-2的功能
Ricin超家族蛋白质与酶催化活性、抑制性毒性及信号转导相关。具有RicinB_Lectin_2结构域的蛋白质是Ricin超家族蛋白质的一个分支，具有糖基识别功能，如凝集素、糖苷酶等。HbRBLLP-1和 HbRBLLP-2具有RicinB_Lectin_2结构域，因此具有糖基识别功能，但具体功能有待进一步研究。
目前已报道的橡胶树凝集素有Hevein（4.7 ku），它是胶乳中的一个高丰度蛋白质，是一种抗真菌凝集素[18]，在胶乳凝集中起着重要作用[19]。Wititsuwannakul等[20]发现了1个17 ku的橡胶树凝集素，也参与胶乳凝集，但未获得该蛋白质的核酸及蛋白质序列信息。需要从胶乳中纯化或进行重组表达HbRBLLP-1和HbRBLLP-2，以获得足够的量进行生物活性研究，如凝集实验等，以探知它们的确切功能。 参考文献
[1] Cornish K. Biochemistry of natural rubber， a vital raw material， emphasizing biosynthetic rate， molecular weight and compartmentalization，in evolutionarily divergent plant species[J]. Natural Products Reports， 2001， 18（2）： 182-189.
[2] Archer B L， Audley B G， Cockbain E G， et al. The biosynthesis of rubber. Incorporation of mevalonate and isopentenyl pyrophosphate into rubber by Hevea brasiliensis-latex fractions[J]. Biochemical Journal， 1963， 89（3）： 565-574.
[3] McMullen A I， McSweeney G P. The biosynthesis of rubber：Incorporation of isopentenyl pyrophosphate into purified rubber particles by a soluble latex serum enzyme[J]. Biochemical Journal， 1966， 101（1）： 42-47.
[4] Archer B L， Cockbain E G. Rubber transferase from Hevea brasiliensis latex[J]. Methods in Enzymology， 1969， 15： 476-480.
[5] Light D R， Dennis M S. Purification of a prenyltransferase that elongates cis-polyisoprene rubber from the latex of Hevea brasiliensis[J]. Journal of Biological Chemistry，1989，264（31）：18 589-18 597.
[6] Dennis M S， Light D R. Rubber elongation factor from Hevea brasiliensis. Identification，characterization，and role in rubber biosynthesis[J]. Journal of Biological Chemistry， 1989， 264（31）：18 608-18 617.
[7] Oh S K， Kang H， Shin D H， et al. Isolation，characterization， and functional analysis of a novel cDNA clone encoding a small rubber particle protein from Hevea brasiliensis[J]. Journal of Biological Chemistry， 1999， 274（24）： 17 132-17 138.
[8] Zeng R Z，Duan C F，Li X Y，et al. Vacuolar-type inorganic pyrophosphatase located on the rubber particle in the latex is an essential enzyme in regulation of the rubber biosynthesis in Hevea brasiliensis[J]. Plant Science， 2009， 176（5）：602-607.
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