论文部分内容阅读
摘要血管紧张素转换酶抑制剂(Angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEI)通过肾素-血管紧张素系统(RAS)和激肽释放酶-肽酶系统(KKS),抑制血管紧张素II的生成,减少缓激肽的降解,从而达到降血压的目的;植物来源的天然化合物具有来源广泛、结构多样、特异性高、毒性低等特点,因而从植物中筛选安全有效的ACEI成为研究热点。在此综述了血管紧张素转换酶(ACE)的活性测定方法以及植物来源的不同结构类型的ACEI研究进展。
关键词ACE活性测定;ACEI;植物源化合物
中图分类号R282.71文献标识码A文章编号0517-6611(2015)29-023-04
截止至2013年5月,我国高血压患者人数已突破3.3亿,每3名成人中有1人患高血压,其常见并发症是脑卒中、心脏病及肾病,严重影响我国人民健康。高血压治疗目标是通过降压治疗使患者的血压达标(即血压<140/90 mmHg),最大限度地降低心血管发病和死亡危险。血管紧张素转换酶抑制剂(Angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEI)是常用的降压药,治疗高血压的效果是明确的,尤其对高血压伴充血性心力衰竭、心肌梗死后、左心功能不全、糖尿病肾病、蛋白尿者有益。一系列大规模随机对照临床试验结果表明,长期应用ACEI治疗高血压,可明显降低脑卒中及心血管事件的发生率。目前,开发和应用ACEI作为降压药备受关注。ACEI的主要来源是化学合成、蛋白水解肽和植物提取物。合成法制备的ACE抑制剂成药较早,且发展很快,药效强劲,降压效果明显,但此类药副作用明显,常见有低血压症、肾功能损害、高血钾症、咳嗽、血管神经性水肿、皮疹、味觉障碍等。天然来源的ACEI具有结构多样、来源广泛、毒性较低等特点,笔者在此对ACE活性的测定方法及ACEI的结构类型进行综述,为高效低毒植物来源ACEI开发提供理论基础。
1ACE活性测定方法
1.1体外活性检测
目前对体外血管紧张素转化酶的活性测定方法有分光光度法、高效液相色谱法(HPLC)、荧光法和毛细管电泳法(CE)等。
1.1.1分光光度法测定。
1971年,Cushman等建立了紫外分光光度法测定ACE抑制剂的活性。分光光度法测酶活是以马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)或马尿酰-甘氨酰-甘氨酸(HGG)为底物,底物被ACE分解产生马尿酸和二肽,根据测定的马尿酸或二肽的含量结合所得马尿酸标准曲线推算出ACE活力[11-12]。1981年Hurst等建立了动力学方法检测血清ACE活力,ACE催化底物HHL裂解,释放出的马尿酸与呈色剂在383 nm处有吸收,根据吸光度A求出ACE活力。骆琳等[14]建立了高通量ACE活性测定的96孔板法,该方法以呋喃丙烯酰三肽(FAPGG)为模拟底物,通过340 nm处吸光值的下降衡量ACE的活性,最多可同时检测96个样品,上机分析时间仅需10 s,且该方法重性好、精密度高。采用分光光度法测酶活性具有设备简单、价格低廉且重复性好的特点,是目前普遍采用的方法。
1.1.2高效液相色谱法。
高效液相色谱法可将底物HHL或HGG与产物马尿酸完全分离,通过测定马尿酸的生成量来评价ACE活性并计算抑制率。Wu等用C18色谱柱、梯度洗脱的方法成功分离了ACE的反应产物与底物,建立了ACE酶活测定方法。洪韫嘉等以含0.1%甲酸和0.1%三乙胺的乙睛-水(22∶78,V/V)为流动相进行等度洗脱,在8 min内完成了分析检测,缩短了分析时间,该方法可用于ACEI的快速筛选。苑园园等用乙睛-水(20∶80,V/V,含0.5‰甲酸)为流动相,流速1 ml/min,检测波长为228 nm,柱温35 ℃,在7 min内即可实现底物和产物的完全分离,分析速度快、操作简便。采用高效液相色谱法测定ACE酶活,相比分光光度法具有灵敏度高、重现性好、准确度高、分析时间短等特点,但缺点是需要大型设备。
1.1.3荧光检测法。
荧光检测法用修饰后的酶底物作为荧光探针,通过检测催化作用前后底物的荧光信号变化来判断,该方法适用于成分复杂的反应体系中,酶活较低时就可以充分利用荧光法高度灵敏的优势。ACE水解产物的组氨酰部分在碱性条件下与邻苯二甲醛反应生成荧光物,潘曦等用荧光光度法检测该荧光物,从而测得ACE活性。荧光检测法灵敏度高,酶活较低时可采用此方法,但该方法设备投入较高而限制了其应用。
1.1.4毛细管电泳法。
毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。目前,用于ACE活性检测的方法和毛细管区带电泳法和毛细管胶束电动色谱法(MECC)。
Zhang 等采用毛细管区带电泳法测定了ACE的体外活性,建立了分析ACE活性的新方法,但未将生成物His-Leu和底物His-His-Leu完全分离。而高效毛细管电泳测定法解决了毛细管区带电泳生成物分不开的缺点,用50 mmol/L pH 8.3 磷酸缓冲液(含1%的SDS)将HHL和HL完全分离,7 min即可完成分析过程。
徐小华等建立了MECC法快速测定ACE活性的方法,通过对电压的分析、上样时间的选择、电极缓冲体系的调整,最后确定了电压8.1 kV、上样时间1 s、缓冲体系为pH 90 20 mmol/L 硼酸盐缓冲液(含50 mmol/L SDS)时,分离效果最好。刘阳等用与徐小华等类似的条件,分析了人血清中血管紧张素转换酶的活性,该法缓冲液是20 mmol/L pH 9.0 硼酸-硼酸盐缓冲液(含50 mmol/L的SDS),压力进样3 s、电压16 kV、电泳时间7.5 min,5 min内即实现了HHL与马尿酸的分离。刘猛等在临床试验中采用了刘阳等的方法,测定受试患者血清ACE活性。毛细管电泳法具有分离速度快、分离效果高、重现性好、样品用量少的优点;但价格相对比较昂贵,且操作要求高、难度大,限制了该方法的使用推广。 [26] 高小平,徐大勇,邓义龙,等.从丹参中筛选血管紧张素转换酶抑制剂[J].中国中药杂志,2004(4):75-78.
[27] 曹晓钢,于刚,叶小利,等.中药提取物及活性部位抑制血管紧张素转化酶活性的研究[J].食品与药品,2009(1):20-23.
[28] 王艺璇,王世平,马丽艳.苹果多酚提取物对血管紧张素转化酶活性的抑制[J].中国农学通报,2012(6):257-261.
[29] 李丹,彭成,谢晓芳.黄酮类化合物治疗糖尿病及其并发症的研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2014(11):239-242.
[30] 朱福,章茂顺,王家良,等.醋柳总黄酮对兔血管紧张素转换酶的抑制作用[J].中国临床药学杂志,2000,9(2):95-98.
[31] 刘发,魏苑,杨新中,等.红花黄素对高血压大鼠的降压作用及对肾素-血管紧张素的影响[J].药学学报,1992(10):785-787.
[32] OVASKAINEN M L,TORRONEN R,KOPONER J,et al.Procyanidinstructure Defines the extent and property of angiotensin I converting enzyme inhibition[J].Biochimie,2006,88(3/4):359-365.
[33] LACAILLEDUBOIS M A,FRANCK U,WAGNER H.Search for potential Angiotensin Converting Enzyme(ACE)-inhibitors from plants[J].Phytomedicine,2001,8:47-52.
[34] 宋瑞霞,余静,杨丽丽,等.甘肃黄芪毛蕊异黄酮对血管内皮细胞ACE,ACE2表达的影响[J].中国药学杂志,2008(8):594-597.
[35] 张因皎,赵钰岚,邹文韬,等.HPLC法测定不同产地杭白菊中3种抑制血管紧张素转化酶活性的黄酮化合物含量[J].药物分析杂志,2010(3):456-459.
[36] 张爱莲,戚华溢,叶其,等.爵床的化学成分研究(英文)[J].应用与环境生物学报,2006(2):170-175.
[37] 凌冰,张兰兰,哈木拉提,等.金鸡菊黄酮对高血压小鼠的血压和肾素-血管紧张素系统的影响[J].中药药理与临床,2013(2):80-83.
[38] 李秀丽,宋瑞霞,余静,等.四种黄芪黄酮类化合物单体对血管内皮细胞功能的保护作用[J].兰州大学学报(医学版),2011(4):1-5,9.
[39] 王珺颖.平贝母中抑制血管紧张素转换酶的生物碱[J].国外医药(植物药分册),2004(5):208.
[40] 龙吉美,黄德彬,李魁武,等.钩藤碱对阿霉素诱导的大鼠肾损伤的作用及其机制[J].中国病理生理杂志,2012(10):1887-1891.
[41] 李运伦.钩藤碱和异钩藤碱抑制血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞增殖及相关机制[J].中国药理学通报,2008,24(1):53-58.
[42] 付立忠,吴学谦,李明焱,等.灵芝品种子实体多糖和三萜含量分析与评价[J].中国食用菌,2009(4):38-40.
[43] 李晔,朱忠敏,姚渭溪,等.灵芝三萜类化合物的研究进展[J].中国中药杂志,2012(2):165-171.
[44] 卢金凤,向靓,黄薇,等.栀子总环烯醚萜苷对脑出血大鼠内皮屏障的影响[J].中药药理与临床,2012(3):48-51.
[45] SONG T Y,YEN G C.Protective effects of fermented filtrate from Antrodiacamphorata in submerged culture against CCl4-induced hepatic toxicity in rats[J].J Agric Food Chem,2003,51(6):1571-1577.
[46] LIU D Z,LIANG Y C,LIN S Y,et al.Antihypertensive activities of solid-state culture of Taiwanofungus camphoratus(Chang-chih)in spontaneously hypertensive rats[J].Biosci Biotechnol Biochem,2007,71(1):23-30.
[47] 李小多,李学刚,张波,等.抑制血管紧张素转化酶的中药及活性成分的研究[J].食品工业科技,2013(1):49-52.
[48] TSAI H,DENG H,TSAI S,et al.Bioactivity comparison of extracts from various parts of common and tartary buckwheats:evaluation of the antioxidant-and angiotensin-converting enzyme inhibitory activities[J].Chemistry central journal 2012,6:78-82.
关键词ACE活性测定;ACEI;植物源化合物
中图分类号R282.71文献标识码A文章编号0517-6611(2015)29-023-04
截止至2013年5月,我国高血压患者人数已突破3.3亿,每3名成人中有1人患高血压,其常见并发症是脑卒中、心脏病及肾病,严重影响我国人民健康。高血压治疗目标是通过降压治疗使患者的血压达标(即血压<140/90 mmHg),最大限度地降低心血管发病和死亡危险。血管紧张素转换酶抑制剂(Angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEI)是常用的降压药,治疗高血压的效果是明确的,尤其对高血压伴充血性心力衰竭、心肌梗死后、左心功能不全、糖尿病肾病、蛋白尿者有益。一系列大规模随机对照临床试验结果表明,长期应用ACEI治疗高血压,可明显降低脑卒中及心血管事件的发生率。目前,开发和应用ACEI作为降压药备受关注。ACEI的主要来源是化学合成、蛋白水解肽和植物提取物。合成法制备的ACE抑制剂成药较早,且发展很快,药效强劲,降压效果明显,但此类药副作用明显,常见有低血压症、肾功能损害、高血钾症、咳嗽、血管神经性水肿、皮疹、味觉障碍等。天然来源的ACEI具有结构多样、来源广泛、毒性较低等特点,笔者在此对ACE活性的测定方法及ACEI的结构类型进行综述,为高效低毒植物来源ACEI开发提供理论基础。
1ACE活性测定方法
1.1体外活性检测
目前对体外血管紧张素转化酶的活性测定方法有分光光度法、高效液相色谱法(HPLC)、荧光法和毛细管电泳法(CE)等。
1.1.1分光光度法测定。
1971年,Cushman等建立了紫外分光光度法测定ACE抑制剂的活性。分光光度法测酶活是以马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)或马尿酰-甘氨酰-甘氨酸(HGG)为底物,底物被ACE分解产生马尿酸和二肽,根据测定的马尿酸或二肽的含量结合所得马尿酸标准曲线推算出ACE活力[11-12]。1981年Hurst等建立了动力学方法检测血清ACE活力,ACE催化底物HHL裂解,释放出的马尿酸与呈色剂在383 nm处有吸收,根据吸光度A求出ACE活力。骆琳等[14]建立了高通量ACE活性测定的96孔板法,该方法以呋喃丙烯酰三肽(FAPGG)为模拟底物,通过340 nm处吸光值的下降衡量ACE的活性,最多可同时检测96个样品,上机分析时间仅需10 s,且该方法重性好、精密度高。采用分光光度法测酶活性具有设备简单、价格低廉且重复性好的特点,是目前普遍采用的方法。
1.1.2高效液相色谱法。
高效液相色谱法可将底物HHL或HGG与产物马尿酸完全分离,通过测定马尿酸的生成量来评价ACE活性并计算抑制率。Wu等用C18色谱柱、梯度洗脱的方法成功分离了ACE的反应产物与底物,建立了ACE酶活测定方法。洪韫嘉等以含0.1%甲酸和0.1%三乙胺的乙睛-水(22∶78,V/V)为流动相进行等度洗脱,在8 min内完成了分析检测,缩短了分析时间,该方法可用于ACEI的快速筛选。苑园园等用乙睛-水(20∶80,V/V,含0.5‰甲酸)为流动相,流速1 ml/min,检测波长为228 nm,柱温35 ℃,在7 min内即可实现底物和产物的完全分离,分析速度快、操作简便。采用高效液相色谱法测定ACE酶活,相比分光光度法具有灵敏度高、重现性好、准确度高、分析时间短等特点,但缺点是需要大型设备。
1.1.3荧光检测法。
荧光检测法用修饰后的酶底物作为荧光探针,通过检测催化作用前后底物的荧光信号变化来判断,该方法适用于成分复杂的反应体系中,酶活较低时就可以充分利用荧光法高度灵敏的优势。ACE水解产物的组氨酰部分在碱性条件下与邻苯二甲醛反应生成荧光物,潘曦等用荧光光度法检测该荧光物,从而测得ACE活性。荧光检测法灵敏度高,酶活较低时可采用此方法,但该方法设备投入较高而限制了其应用。
1.1.4毛细管电泳法。
毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。目前,用于ACE活性检测的方法和毛细管区带电泳法和毛细管胶束电动色谱法(MECC)。
Zhang 等采用毛细管区带电泳法测定了ACE的体外活性,建立了分析ACE活性的新方法,但未将生成物His-Leu和底物His-His-Leu完全分离。而高效毛细管电泳测定法解决了毛细管区带电泳生成物分不开的缺点,用50 mmol/L pH 8.3 磷酸缓冲液(含1%的SDS)将HHL和HL完全分离,7 min即可完成分析过程。
徐小华等建立了MECC法快速测定ACE活性的方法,通过对电压的分析、上样时间的选择、电极缓冲体系的调整,最后确定了电压8.1 kV、上样时间1 s、缓冲体系为pH 90 20 mmol/L 硼酸盐缓冲液(含50 mmol/L SDS)时,分离效果最好。刘阳等用与徐小华等类似的条件,分析了人血清中血管紧张素转换酶的活性,该法缓冲液是20 mmol/L pH 9.0 硼酸-硼酸盐缓冲液(含50 mmol/L的SDS),压力进样3 s、电压16 kV、电泳时间7.5 min,5 min内即实现了HHL与马尿酸的分离。刘猛等在临床试验中采用了刘阳等的方法,测定受试患者血清ACE活性。毛细管电泳法具有分离速度快、分离效果高、重现性好、样品用量少的优点;但价格相对比较昂贵,且操作要求高、难度大,限制了该方法的使用推广。 [26] 高小平,徐大勇,邓义龙,等.从丹参中筛选血管紧张素转换酶抑制剂[J].中国中药杂志,2004(4):75-78.
[27] 曹晓钢,于刚,叶小利,等.中药提取物及活性部位抑制血管紧张素转化酶活性的研究[J].食品与药品,2009(1):20-23.
[28] 王艺璇,王世平,马丽艳.苹果多酚提取物对血管紧张素转化酶活性的抑制[J].中国农学通报,2012(6):257-261.
[29] 李丹,彭成,谢晓芳.黄酮类化合物治疗糖尿病及其并发症的研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2014(11):239-242.
[30] 朱福,章茂顺,王家良,等.醋柳总黄酮对兔血管紧张素转换酶的抑制作用[J].中国临床药学杂志,2000,9(2):95-98.
[31] 刘发,魏苑,杨新中,等.红花黄素对高血压大鼠的降压作用及对肾素-血管紧张素的影响[J].药学学报,1992(10):785-787.
[32] OVASKAINEN M L,TORRONEN R,KOPONER J,et al.Procyanidinstructure Defines the extent and property of angiotensin I converting enzyme inhibition[J].Biochimie,2006,88(3/4):359-365.
[33] LACAILLEDUBOIS M A,FRANCK U,WAGNER H.Search for potential Angiotensin Converting Enzyme(ACE)-inhibitors from plants[J].Phytomedicine,2001,8:47-52.
[34] 宋瑞霞,余静,杨丽丽,等.甘肃黄芪毛蕊异黄酮对血管内皮细胞ACE,ACE2表达的影响[J].中国药学杂志,2008(8):594-597.
[35] 张因皎,赵钰岚,邹文韬,等.HPLC法测定不同产地杭白菊中3种抑制血管紧张素转化酶活性的黄酮化合物含量[J].药物分析杂志,2010(3):456-459.
[36] 张爱莲,戚华溢,叶其,等.爵床的化学成分研究(英文)[J].应用与环境生物学报,2006(2):170-175.
[37] 凌冰,张兰兰,哈木拉提,等.金鸡菊黄酮对高血压小鼠的血压和肾素-血管紧张素系统的影响[J].中药药理与临床,2013(2):80-83.
[38] 李秀丽,宋瑞霞,余静,等.四种黄芪黄酮类化合物单体对血管内皮细胞功能的保护作用[J].兰州大学学报(医学版),2011(4):1-5,9.
[39] 王珺颖.平贝母中抑制血管紧张素转换酶的生物碱[J].国外医药(植物药分册),2004(5):208.
[40] 龙吉美,黄德彬,李魁武,等.钩藤碱对阿霉素诱导的大鼠肾损伤的作用及其机制[J].中国病理生理杂志,2012(10):1887-1891.
[41] 李运伦.钩藤碱和异钩藤碱抑制血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞增殖及相关机制[J].中国药理学通报,2008,24(1):53-58.
[42] 付立忠,吴学谦,李明焱,等.灵芝品种子实体多糖和三萜含量分析与评价[J].中国食用菌,2009(4):38-40.
[43] 李晔,朱忠敏,姚渭溪,等.灵芝三萜类化合物的研究进展[J].中国中药杂志,2012(2):165-171.
[44] 卢金凤,向靓,黄薇,等.栀子总环烯醚萜苷对脑出血大鼠内皮屏障的影响[J].中药药理与临床,2012(3):48-51.
[45] SONG T Y,YEN G C.Protective effects of fermented filtrate from Antrodiacamphorata in submerged culture against CCl4-induced hepatic toxicity in rats[J].J Agric Food Chem,2003,51(6):1571-1577.
[46] LIU D Z,LIANG Y C,LIN S Y,et al.Antihypertensive activities of solid-state culture of Taiwanofungus camphoratus(Chang-chih)in spontaneously hypertensive rats[J].Biosci Biotechnol Biochem,2007,71(1):23-30.
[47] 李小多,李学刚,张波,等.抑制血管紧张素转化酶的中药及活性成分的研究[J].食品工业科技,2013(1):49-52.
[48] TSAI H,DENG H,TSAI S,et al.Bioactivity comparison of extracts from various parts of common and tartary buckwheats:evaluation of the antioxidant-and angiotensin-converting enzyme inhibitory activities[J].Chemistry central journal 2012,6:78-82.