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摘要
用水蒸气蒸馏法提取牡荆叶挥发油，并采用气相色谱质谱联用法分析其化学成分，基于柱色谱和核磁共振方法分离并鉴定化合物。从牡荆叶挥发油中鉴定出47种化合物，主要成分为β石竹烯（25.8%）、桉油精（9.5%）、石竹烯氧化物（7.3%）和乙酸松油酯（6.1%）。并对牡荆叶挥发油及其分离得到的β石竹烯和桉油精进行了杀虫活性测定。结果表明牡荆叶挥发油对烟草甲（Lasioderma serricorne）成虫具有触杀毒性（LD50为25.30 μg/头）和熏蒸毒性（LC50为13.12 mg/L）。挥发油中的主要化合物β石竹烯和桉油精对烟草甲均有一定的触杀毒性（LD50分别为41.75 μg/头和15.58 μg/头）。桉油精对烟草甲还显示出较强的熏蒸活性（LC50为5.18 mg/L）。结果提示牡荆叶挥发油及其活性化合物可用于烟草甲的综合防治。
关键词
牡荆叶； 烟草甲； 触杀活性； 熏蒸活性
贮烟害虫对烟草产业危害很大。据调查，我国为害烟草的害虫有79种，其中烟草甲[Lasioderma serricorne （Fabricius）]及烟草粉螟[Ephestia elutella （Hübner）]发生最为普遍，为害最严重[1]。烟草甲属昆虫纲（Insecta）鞘翅目（Coleoptera）窃蠹科（Anobiidae），又名烟草窃蠹、烟草标本虫、苦丁茶蛀虫等，原产于美洲，分布遍及全世界，1年繁殖3～6代，食性极杂，经常出现在各大食品加工厂、仓库及其他干燥的储藏地，主要为害对象有各类谷物产品、香料、烟草以及干的草药等，对贮藏烟叶及其制品为害尤甚[24]。据国际烟草工业技术中心联盟（CORESTA）估计，烟草甲每年对贮存烟草造成的损失约为1%[5]。该虫特别喜食正在醇化的烟叶，可随加工的烟丝进入卷烟内部，蛀食烟丝，蛀穿卷烟纸；虫尸、虫粪污染烟叶和烟草制品，严重影响烟叶的可用性和卷烟质量。
目前，防治烟草甲等储藏物害虫的主要方法是药剂熏蒸，其中以磷化铝的应用最为普遍，但由于长期使用单一熏蒸剂，已诱导烟草甲、谷蠹、赤拟谷盗等多种害虫对磷化氢产生了较强的抗药性，而增加用药量则会带来严重的农药残留污染和对人类健康的威胁[68]。随着可持续植保理论的提出，植物性杀虫剂在害虫治理中的研究和应用显得更加重要[910]。利用植物次生代谢产物开发环境和谐农药成为当今杀虫剂研究的热点之一。植物精油是一类植物次生性代谢物质，具有特殊的植物性气味，主要成分为单萜和倍半萜类物质，具有对人畜安全，对环境友好，残留量低等优点。植物精油对害虫的作用方式大致可归纳为毒杀、拒食、引诱、驱避和抑制生长发育等，目前已有大量文献报道。研究发现一些植物精油及其有效成分对烟草甲具有良好的毒杀作用，比如紫苏当中的2乙酰基呋喃[11]，香樟当中的右旋樟脑等[12]。但是，相关研究多停留在粗提物测试阶段，还未见到烟草甲植物源杀虫剂产品投放市场。在筛选活性植物材料及其精油的基础上，选用高杀虫活性成分组对于实现烟草甲等储藏物害虫的无公害防治具有重要的实践意义。
牡荆叶为马鞭草科牡荆属植物牡荆[Vitex negundo L.var. cannabifolia （Sieb. et Zucc.） Hand.Mazz.]的叶。全国各地均产，野生资源十分丰富[1314]。已发现东南亚地区有直接用同属的黄荆叶或叶片有机溶剂粗提物进行相关杀虫活性研究的记载，显示出黄荆对玉米象、谷蠹、绿豆象和杂拟谷盗等仓储害虫具有杀虫活性[15]。作为牡荆属的同属植物[16]，牡荆是黄荆的变种之一，但相关成分对烟草甲的杀虫活性未见报道。故在此对牡荆叶挥发油的化学成分和杀虫活性做进一步探究，以求筛选更好的具有杀虫活性的成分，为牡荆叶资源的开发利用提供依据，为烟草甲的生物防治研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料和仪器
1.1.1 供试昆虫
烟草甲于2013年9月引种自河南工业大学粮油食品学院，经吕建华副教授鉴定确认种类，引种后已纯化3代以上。饲养条件：将小麦用水冲洗两遍后晾干，磨成面粉，过80目筛，装入玻璃瓶内，加入10% 酵母粉，混合均匀，接入20～40头成虫，盖上棉布，用皮筋箍好，置于温度（29±1）℃，相对湿度为75 %±5 %的培养箱中饲养。2 d后筛出成虫，将接种的玻璃瓶放入培养箱中。每次试验挑选同一批次羽化、羽化后一周左右的成虫作为受试虫源，试虫不分雌雄。
1.1.2 植物原料
牡荆叶（5 kg）于2012年8月采自河北省安国市，经杜树山教授鉴定为马鞭草科植物牡荆[Vitex negundo L.var. cannabifolia （Sieb.et Zucc.） Hand.Mazz.]的干燥叶，植物样本保存于北京师范大学资源学院。
1.1.3 仪器和试剂
安捷伦 6890N气相色谱分析仪，配有Agilent Technologies 5973N 质谱分析仪，氢火焰离子化检测器 （GCFID），HP5MS （30 m×0.25 mm×0.25 μm） 石英毛细管柱和NIST05、WILEY275质谱数据库。
布鲁克Avance DRX 500核磁共振谱仪，配有5 mm DUEL双核探头和BVT3000控温单元，以氘代氯仿作为溶剂，四甲基硅烷作为内标。
Heidolph Laborota 4000型旋转蒸发仪；一系列量程范围Eppendorf移液枪，玻璃样品瓶、玻璃培养皿购于北京玻璃仪器厂。
正己烷、乙酸乙酯等均为北京化工厂分析纯试剂；聚四氟乙烯购于北京华通瑞驰材料科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 挥发油的提取
取牡荆叶放入挥发油提取器中，采用水蒸气蒸馏法进行提取，提取6 h，油水经正己烷萃取，减压蒸馏回收溶剂，无水硫酸钠干燥处理后过滤，即得挥发油。挥发油存储于冰箱保鲜室4℃保存。 1.2.2 气相色谱质谱联用（GCMS）分析
色谱条件：载气为高纯氦气，流速为1.0 mL/min，汽化室温度250℃。进样量为1 μL（样品1 μL，以1%浓度溶于正己烷），以分流比1∶50注射。程序升温：柱起始温度为50℃，保持3 min，以10℃/min升温速率升至280℃。
质谱条件：电离方式为EI，电子能量为70 eV，离子源温度200℃，质量扫描范围45～650 m/z。
多数成分通过气相色谱法鉴定，主要通过将它们的保留指数（RI）与文献及实验室已有标准化合物保留指数进行比对。RI的确定与同等操作条件下正构烷烃同系物（C5～C36）的分析结果相关，进一步鉴别通过检索质谱数据库NIST05、 WILEY275和查阅有关质谱文献来进行[17]，并应用峰面积归一化法确定它们的相对百分含量。
1.2.3 单体化合物的分离鉴定
牡荆叶挥发油10 mL，经正相硅胶柱层析，采用正己烷、正己烷乙酸乙酯、乙酸乙酯依次梯度洗脱分段，获得25个馏分段，Fr.6、9再经正己烷乙酸乙酯（100∶1， V/V）反复硅胶柱层析分离，经核磁共振解析确定结构，得到2个单体化合物，分别为β石竹烯（βcaryophyllene，化合物1，1.2g）和桉油精（eucalyptol，化合物2，0.8 g）。
1.2.4 触杀毒性测试方法
挥发油及单体化合物对烟草甲的触杀活性的测试参照文献所述方法[18]：将羽化一周左右的成虫从培养瓶中取出，再用移液枪点滴0.5 μL精油的正己烷稀释液（预试验：浓度为50%、10%、2%；正式试验根据预试验结果设置5个浓度）于试虫的前胸背板上（置于冰袋上操作），处理后放入直径2.5 cm，高5.5 cm玻璃瓶中，正己烷为对照组，每个浓度重复5次，每个重复10头试虫。处理组与对照组置于温度为（29±1）℃，相对湿度为75%±5%的恒温培养箱中培养24 h，观察和记录试虫的死亡情况。计算死亡率与校正死亡率，LD50值按文献方法[16]采用Probit （IBM SPSS 20.0）分析计算。
1.2.5 熏蒸毒性测试方法
挥发油及单体化合物对烟草甲的熏蒸活性的测试参照文献所述方法[18]：将10头试虫放入直径2.5 cm，高5.5 cm的玻璃瓶中，然后用移液枪吸取10 μL精油的正己烷稀释液（预试验：浓度为50%、10%、2%；正式试验根据预试验结果设置5个浓度）滴于瓶盖内的滤纸片上，另取未处理的滤纸滴加正己烷作对照，迅速拧紧瓶盖密封，形成一密闭空间，瓶口涂有聚四氟乙烯，防止供试昆虫接触到含药剂的滤纸。每个处理重复5次，每个重复10头试虫。处理后置于温度为（29±1）℃，相对湿度为75%±5%的恒温培养箱中培养24 h，观察和记录试虫的死亡情况，计算死亡率与校正死亡率。由于试虫均有假死性，观察死亡情况时先用力摇晃玻璃瓶，再将玻璃瓶放倒，5 min后观察，虫体不动即为死亡，LC50按文献方法[16]采用Probit （IBM SPSS 20.0）分析计算。
2 结果与分析
2.1 挥发油的化学成分
牡荆叶挥发油的GCMS结果如表1所示：从牡荆叶挥发油中鉴定出47种成分，占全油91.50%，其中主要成分为β石竹烯（25.8%）、桉油精（9.5%）、石竹烯氧化物（7.3%）、乙酸松油酯（6.1%）和斯巴醇（3.4%）等。
2.2 化合物结构解析
分离并鉴定出两种化合物（图1），详细数据如下：
化合物1：β石竹烯。无色油状；分子式C15H24。1HNMR（500 MHz，CDCl3）δppm： 5.33 （1H，m，H5），4.97 （1H，s，H12a），4.85 （1H，s，H12b），2.37 （1H，m，H9），2.33 （1H，m，H7b），2.23 （1H，m，H7a），2.11 （1H，m，H1），2.02 （1H，m，H6b），1.94 （1H，m，H6a），1.72 （1H，m，H2b），1.69 （1H，m，H3b），1.651.67 （2H，m，H10），1.64 （3H，s，15CH3），1.60 （1H，m，H3a），1.52 （1H，m，H2a），1.02 （3H，s，12CH3），1.00 （3H，s，13CH3）；13CNMR （125 MHz，CDCl3）δppm： 154.74 （C8），135.58 （C4），124.31 （C5），111.67 （C12），53.54 （C1），48.48 （C9），40.33 （C10），39.96 （C3），34.79 （C7），33.02 （C11），30.09 （C13），29.36 （C2），28.38 （C6），22.66 （C14），16.32 （C15）。数据与之前文献报道一致[19]，鉴定化合物1为β石竹烯。
化合物2：桉油精。无色油状；分子式C10H18O。1HNMR （500 MHz，CDCl3） δppm： 2.03 （2H，t，H2），1.68（2H，t，H6），1.52（4H，m，H3，5），1.42（1H，m，H4），1.25（6H，s，H9，10），1.07 （3H，s，H7）；13CNMR （125 MHz，CDCl3） δppm： 73.61 （C8），69.77 （C1），32.94 （C4），31.51 （C3，5），28.89 （C2，6），27.58 （C7），22.83 （C9，10）。数据与之前文献报道一致[20]，鉴定化合物2为桉油精。
2.3 挥发油触杀和熏蒸毒性
牡荆叶挥发油及其单体对烟草甲的触杀和熏蒸活性如表2所示。牡荆叶挥发油对烟草甲体现出较强的触杀毒性，LD50值为25.30 μg/头。在2种化合物中，桉油精对烟草甲的触杀活性较强，LD50达到 15.58 μg/头。β石竹烯对烟草甲的触杀活性较弱，LD50仅为41.75 μg/头。桉油精对烟草甲成虫的触杀毒性比β石竹烯强2.67倍，比挥发油强1.62倍。挥发油对烟草甲成虫有很强的熏蒸毒性，LC50为13.12 mg/L。在分离出的2种化合物中，β石竹烯在测试范围内没有熏蒸毒性，桉油精（LC50=5.18 mg/L）对烟草甲的熏蒸毒性强于总挥发油。这说明桉油精在牡荆叶挥发油对烟草甲的触杀和熏蒸活性中起到主要作用。 3 讨论
目前国内对于各地区的牡荆叶挥发油成分研究较多。黄琼等[2123]分别用超声波提取法、水蒸气蒸馏法和微波辅助萃取的方法得到牡荆叶挥发油。3次样品均采自广西南宁市郊区，但主要成分的种类和含量各不相同。其中使用超声波提取法提取所得挥发油的主要成分确定为十六酸（15.9%）、邻苯二甲酸异丁基酯（14.4%）和苯酚（13.6%）。水蒸气蒸馏法所得精油主要成分为β石竹烯（24.6%）、β桉醇（10.0%）和邻苯二甲酸二异辛酯（5.7%）。微波辅助萃取而得的挥发油的主要成分为β石竹烯（20.2%）、4羟基苯甲酸（21.2%）和桉油精（12.8%）。同一采集地3次样品各成分含量不同，可能与提取方法不同有关。孙凌峰[24]在江西德兴所采样品经测定其最主要组分为β石竹烯（39.6%），其次为桉油精（23.9%）、桧烯（12.6%）和乙酸龙脑酯（7.0%）。陈刚等[25]测定沂蒙山产牡荆叶挥发油化学成分主要为β石竹烯（26.3%）、桉油精（11.9%）、桧烷（7.8%）和反式β金合欢烯（6.2%）。各产地牡荆叶挥发油主要成分对照具有鲜明的地域特征，但大都含有β石竹烯和桉油精。以上结果显示不同提取方法和不同产地所得牡荆叶挥发油的主要分及含量差异明显，这可能与药材产地的气候、土壤、地理位置，药材应用部位，以及提取分析方法的差异有关，因此针对植物栽培学与挥发油标准化提取的进一步研究非常必要。
有不少文献对烟草甲的触杀及熏蒸活性做过相关报道。王秀芳等[26]对9种植物精油对烟草甲的杀虫活性进行了筛选，发现丁香油、冬青油、茶树油、艾叶油和百里香油有较好的触杀作用，留兰香油、茶树油、冬青油和丁香油具有较好的熏蒸作用。杨凯等[27]报道了山鸡椒[Litsea cubeba （Lour.） Pers.]挥发油对烟草甲的触杀活性，LD50为 27.33 μg/头，熏蒸活性LC50为 22.97 mg/L。王颖等[2830]研究报道了几种姜科植物对烟草甲的触杀和熏蒸活性，其中云南草蔻（Alpinia blepharocalyx K. Schum.）、 紫色姜（Zingiber purpureum Rosc.）和草果（Amomum tsaoko Crevost et Lemaire）对烟草甲的触杀毒性LD50分别为15.02、16.3和6.14 μg/头，熏蒸毒性LC50分别为3.83、9.30和8.70 mg/L。王成芳等[3132]报道了两种花椒属植物对烟草甲的杀虫活性，单面针根部挥发油对烟草甲显示出触杀活性，LD50为13.8 μg/头，竹叶花椒茎枝挥发油对烟草甲具有熏蒸（LC50=13.83 mg/L）和触杀活性（LD50=18.74 μg/头）。本研究结果显示牡荆叶挥发油对烟草甲的触杀和熏蒸活性比以上报道的活性相对较弱，但牡荆油作为常用药[33]，比大多数常规杀虫剂对人体安全危害小，因而具有一定优势。
综上所述，本研究证实了牡荆叶挥发油对烟草甲具有熏蒸和触杀毒性，并且其中的β石竹烯和桉油精也有一定的杀虫作用。牡荆油比大多数常规杀虫剂对人体安全危害小，并且资源丰富，在控制烟仓害虫方面的应用前景广阔。但将挥发油大范围应用于烟仓害虫防治的成本与效益以及相关的杀虫作用机理还需要做进一步的研究。
参考文献
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用水蒸气蒸馏法提取牡荆叶挥发油，并采用气相色谱质谱联用法分析其化学成分，基于柱色谱和核磁共振方法分离并鉴定化合物。从牡荆叶挥发油中鉴定出47种化合物，主要成分为β石竹烯（25.8%）、桉油精（9.5%）、石竹烯氧化物（7.3%）和乙酸松油酯（6.1%）。并对牡荆叶挥发油及其分离得到的β石竹烯和桉油精进行了杀虫活性测定。结果表明牡荆叶挥发油对烟草甲（Lasioderma serricorne）成虫具有触杀毒性（LD50为25.30 μg/头）和熏蒸毒性（LC50为13.12 mg/L）。挥发油中的主要化合物β石竹烯和桉油精对烟草甲均有一定的触杀毒性（LD50分别为41.75 μg/头和15.58 μg/头）。桉油精对烟草甲还显示出较强的熏蒸活性（LC50为5.18 mg/L）。结果提示牡荆叶挥发油及其活性化合物可用于烟草甲的综合防治。
关键词
牡荆叶； 烟草甲； 触杀活性； 熏蒸活性
贮烟害虫对烟草产业危害很大。据调查，我国为害烟草的害虫有79种，其中烟草甲[Lasioderma serricorne （Fabricius）]及烟草粉螟[Ephestia elutella （Hübner）]发生最为普遍，为害最严重[1]。烟草甲属昆虫纲（Insecta）鞘翅目（Coleoptera）窃蠹科（Anobiidae），又名烟草窃蠹、烟草标本虫、苦丁茶蛀虫等，原产于美洲，分布遍及全世界，1年繁殖3～6代，食性极杂，经常出现在各大食品加工厂、仓库及其他干燥的储藏地，主要为害对象有各类谷物产品、香料、烟草以及干的草药等，对贮藏烟叶及其制品为害尤甚[24]。据国际烟草工业技术中心联盟（CORESTA）估计，烟草甲每年对贮存烟草造成的损失约为1%[5]。该虫特别喜食正在醇化的烟叶，可随加工的烟丝进入卷烟内部，蛀食烟丝，蛀穿卷烟纸；虫尸、虫粪污染烟叶和烟草制品，严重影响烟叶的可用性和卷烟质量。
目前，防治烟草甲等储藏物害虫的主要方法是药剂熏蒸，其中以磷化铝的应用最为普遍，但由于长期使用单一熏蒸剂，已诱导烟草甲、谷蠹、赤拟谷盗等多种害虫对磷化氢产生了较强的抗药性，而增加用药量则会带来严重的农药残留污染和对人类健康的威胁[68]。随着可持续植保理论的提出，植物性杀虫剂在害虫治理中的研究和应用显得更加重要[910]。利用植物次生代谢产物开发环境和谐农药成为当今杀虫剂研究的热点之一。植物精油是一类植物次生性代谢物质，具有特殊的植物性气味，主要成分为单萜和倍半萜类物质，具有对人畜安全，对环境友好，残留量低等优点。植物精油对害虫的作用方式大致可归纳为毒杀、拒食、引诱、驱避和抑制生长发育等，目前已有大量文献报道。研究发现一些植物精油及其有效成分对烟草甲具有良好的毒杀作用，比如紫苏当中的2乙酰基呋喃[11]，香樟当中的右旋樟脑等[12]。但是，相关研究多停留在粗提物测试阶段，还未见到烟草甲植物源杀虫剂产品投放市场。在筛选活性植物材料及其精油的基础上，选用高杀虫活性成分组对于实现烟草甲等储藏物害虫的无公害防治具有重要的实践意义。
牡荆叶为马鞭草科牡荆属植物牡荆[Vitex negundo L.var. cannabifolia （Sieb. et Zucc.） Hand.Mazz.]的叶。全国各地均产，野生资源十分丰富[1314]。已发现东南亚地区有直接用同属的黄荆叶或叶片有机溶剂粗提物进行相关杀虫活性研究的记载，显示出黄荆对玉米象、谷蠹、绿豆象和杂拟谷盗等仓储害虫具有杀虫活性[15]。作为牡荆属的同属植物[16]，牡荆是黄荆的变种之一，但相关成分对烟草甲的杀虫活性未见报道。故在此对牡荆叶挥发油的化学成分和杀虫活性做进一步探究，以求筛选更好的具有杀虫活性的成分，为牡荆叶资源的开发利用提供依据，为烟草甲的生物防治研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料和仪器
1.1.1 供试昆虫
烟草甲于2013年9月引种自河南工业大学粮油食品学院，经吕建华副教授鉴定确认种类，引种后已纯化3代以上。饲养条件：将小麦用水冲洗两遍后晾干，磨成面粉，过80目筛，装入玻璃瓶内，加入10% 酵母粉，混合均匀，接入20～40头成虫，盖上棉布，用皮筋箍好，置于温度（29±1）℃，相对湿度为75 %±5 %的培养箱中饲养。2 d后筛出成虫，将接种的玻璃瓶放入培养箱中。每次试验挑选同一批次羽化、羽化后一周左右的成虫作为受试虫源，试虫不分雌雄。
1.1.2 植物原料
牡荆叶（5 kg）于2012年8月采自河北省安国市，经杜树山教授鉴定为马鞭草科植物牡荆[Vitex negundo L.var. cannabifolia （Sieb.et Zucc.） Hand.Mazz.]的干燥叶，植物样本保存于北京师范大学资源学院。
1.1.3 仪器和试剂
安捷伦 6890N气相色谱分析仪，配有Agilent Technologies 5973N 质谱分析仪，氢火焰离子化检测器 （GCFID），HP5MS （30 m×0.25 mm×0.25 μm） 石英毛细管柱和NIST05、WILEY275质谱数据库。
布鲁克Avance DRX 500核磁共振谱仪，配有5 mm DUEL双核探头和BVT3000控温单元，以氘代氯仿作为溶剂，四甲基硅烷作为内标。
Heidolph Laborota 4000型旋转蒸发仪；一系列量程范围Eppendorf移液枪，玻璃样品瓶、玻璃培养皿购于北京玻璃仪器厂。
正己烷、乙酸乙酯等均为北京化工厂分析纯试剂；聚四氟乙烯购于北京华通瑞驰材料科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 挥发油的提取
取牡荆叶放入挥发油提取器中，采用水蒸气蒸馏法进行提取，提取6 h，油水经正己烷萃取，减压蒸馏回收溶剂，无水硫酸钠干燥处理后过滤，即得挥发油。挥发油存储于冰箱保鲜室4℃保存。 1.2.2 气相色谱质谱联用（GCMS）分析
色谱条件：载气为高纯氦气，流速为1.0 mL/min，汽化室温度250℃。进样量为1 μL（样品1 μL，以1%浓度溶于正己烷），以分流比1∶50注射。程序升温：柱起始温度为50℃，保持3 min，以10℃/min升温速率升至280℃。
质谱条件：电离方式为EI，电子能量为70 eV，离子源温度200℃，质量扫描范围45～650 m/z。
多数成分通过气相色谱法鉴定，主要通过将它们的保留指数（RI）与文献及实验室已有标准化合物保留指数进行比对。RI的确定与同等操作条件下正构烷烃同系物（C5～C36）的分析结果相关，进一步鉴别通过检索质谱数据库NIST05、 WILEY275和查阅有关质谱文献来进行[17]，并应用峰面积归一化法确定它们的相对百分含量。
1.2.3 单体化合物的分离鉴定
牡荆叶挥发油10 mL，经正相硅胶柱层析，采用正己烷、正己烷乙酸乙酯、乙酸乙酯依次梯度洗脱分段，获得25个馏分段，Fr.6、9再经正己烷乙酸乙酯（100∶1， V/V）反复硅胶柱层析分离，经核磁共振解析确定结构，得到2个单体化合物，分别为β石竹烯（βcaryophyllene，化合物1，1.2g）和桉油精（eucalyptol，化合物2，0.8 g）。
1.2.4 触杀毒性测试方法
挥发油及单体化合物对烟草甲的触杀活性的测试参照文献所述方法[18]：将羽化一周左右的成虫从培养瓶中取出，再用移液枪点滴0.5 μL精油的正己烷稀释液（预试验：浓度为50%、10%、2%；正式试验根据预试验结果设置5个浓度）于试虫的前胸背板上（置于冰袋上操作），处理后放入直径2.5 cm，高5.5 cm玻璃瓶中，正己烷为对照组，每个浓度重复5次，每个重复10头试虫。处理组与对照组置于温度为（29±1）℃，相对湿度为75%±5%的恒温培养箱中培养24 h，观察和记录试虫的死亡情况。计算死亡率与校正死亡率，LD50值按文献方法[16]采用Probit （IBM SPSS 20.0）分析计算。
1.2.5 熏蒸毒性测试方法
挥发油及单体化合物对烟草甲的熏蒸活性的测试参照文献所述方法[18]：将10头试虫放入直径2.5 cm，高5.5 cm的玻璃瓶中，然后用移液枪吸取10 μL精油的正己烷稀释液（预试验：浓度为50%、10%、2%；正式试验根据预试验结果设置5个浓度）滴于瓶盖内的滤纸片上，另取未处理的滤纸滴加正己烷作对照，迅速拧紧瓶盖密封，形成一密闭空间，瓶口涂有聚四氟乙烯，防止供试昆虫接触到含药剂的滤纸。每个处理重复5次，每个重复10头试虫。处理后置于温度为（29±1）℃，相对湿度为75%±5%的恒温培养箱中培养24 h，观察和记录试虫的死亡情况，计算死亡率与校正死亡率。由于试虫均有假死性，观察死亡情况时先用力摇晃玻璃瓶，再将玻璃瓶放倒，5 min后观察，虫体不动即为死亡，LC50按文献方法[16]采用Probit （IBM SPSS 20.0）分析计算。
2 结果与分析
2.1 挥发油的化学成分
牡荆叶挥发油的GCMS结果如表1所示：从牡荆叶挥发油中鉴定出47种成分，占全油91.50%，其中主要成分为β石竹烯（25.8%）、桉油精（9.5%）、石竹烯氧化物（7.3%）、乙酸松油酯（6.1%）和斯巴醇（3.4%）等。
2.2 化合物结构解析
分离并鉴定出两种化合物（图1），详细数据如下：
化合物1：β石竹烯。无色油状；分子式C15H24。1HNMR（500 MHz，CDCl3）δppm： 5.33 （1H，m，H5），4.97 （1H，s，H12a），4.85 （1H，s，H12b），2.37 （1H，m，H9），2.33 （1H，m，H7b），2.23 （1H，m，H7a），2.11 （1H，m，H1），2.02 （1H，m，H6b），1.94 （1H，m，H6a），1.72 （1H，m，H2b），1.69 （1H，m，H3b），1.651.67 （2H，m，H10），1.64 （3H，s，15CH3），1.60 （1H，m，H3a），1.52 （1H，m，H2a），1.02 （3H，s，12CH3），1.00 （3H，s，13CH3）；13CNMR （125 MHz，CDCl3）δppm： 154.74 （C8），135.58 （C4），124.31 （C5），111.67 （C12），53.54 （C1），48.48 （C9），40.33 （C10），39.96 （C3），34.79 （C7），33.02 （C11），30.09 （C13），29.36 （C2），28.38 （C6），22.66 （C14），16.32 （C15）。数据与之前文献报道一致[19]，鉴定化合物1为β石竹烯。
化合物2：桉油精。无色油状；分子式C10H18O。1HNMR （500 MHz，CDCl3） δppm： 2.03 （2H，t，H2），1.68（2H，t，H6），1.52（4H，m，H3，5），1.42（1H，m，H4），1.25（6H，s，H9，10），1.07 （3H，s，H7）；13CNMR （125 MHz，CDCl3） δppm： 73.61 （C8），69.77 （C1），32.94 （C4），31.51 （C3，5），28.89 （C2，6），27.58 （C7），22.83 （C9，10）。数据与之前文献报道一致[20]，鉴定化合物2为桉油精。
2.3 挥发油触杀和熏蒸毒性
牡荆叶挥发油及其单体对烟草甲的触杀和熏蒸活性如表2所示。牡荆叶挥发油对烟草甲体现出较强的触杀毒性，LD50值为25.30 μg/头。在2种化合物中，桉油精对烟草甲的触杀活性较强，LD50达到 15.58 μg/头。β石竹烯对烟草甲的触杀活性较弱，LD50仅为41.75 μg/头。桉油精对烟草甲成虫的触杀毒性比β石竹烯强2.67倍，比挥发油强1.62倍。挥发油对烟草甲成虫有很强的熏蒸毒性，LC50为13.12 mg/L。在分离出的2种化合物中，β石竹烯在测试范围内没有熏蒸毒性，桉油精（LC50=5.18 mg/L）对烟草甲的熏蒸毒性强于总挥发油。这说明桉油精在牡荆叶挥发油对烟草甲的触杀和熏蒸活性中起到主要作用。 3 讨论
目前国内对于各地区的牡荆叶挥发油成分研究较多。黄琼等[2123]分别用超声波提取法、水蒸气蒸馏法和微波辅助萃取的方法得到牡荆叶挥发油。3次样品均采自广西南宁市郊区，但主要成分的种类和含量各不相同。其中使用超声波提取法提取所得挥发油的主要成分确定为十六酸（15.9%）、邻苯二甲酸异丁基酯（14.4%）和苯酚（13.6%）。水蒸气蒸馏法所得精油主要成分为β石竹烯（24.6%）、β桉醇（10.0%）和邻苯二甲酸二异辛酯（5.7%）。微波辅助萃取而得的挥发油的主要成分为β石竹烯（20.2%）、4羟基苯甲酸（21.2%）和桉油精（12.8%）。同一采集地3次样品各成分含量不同，可能与提取方法不同有关。孙凌峰[24]在江西德兴所采样品经测定其最主要组分为β石竹烯（39.6%），其次为桉油精（23.9%）、桧烯（12.6%）和乙酸龙脑酯（7.0%）。陈刚等[25]测定沂蒙山产牡荆叶挥发油化学成分主要为β石竹烯（26.3%）、桉油精（11.9%）、桧烷（7.8%）和反式β金合欢烯（6.2%）。各产地牡荆叶挥发油主要成分对照具有鲜明的地域特征，但大都含有β石竹烯和桉油精。以上结果显示不同提取方法和不同产地所得牡荆叶挥发油的主要分及含量差异明显，这可能与药材产地的气候、土壤、地理位置，药材应用部位，以及提取分析方法的差异有关，因此针对植物栽培学与挥发油标准化提取的进一步研究非常必要。
有不少文献对烟草甲的触杀及熏蒸活性做过相关报道。王秀芳等[26]对9种植物精油对烟草甲的杀虫活性进行了筛选，发现丁香油、冬青油、茶树油、艾叶油和百里香油有较好的触杀作用，留兰香油、茶树油、冬青油和丁香油具有较好的熏蒸作用。杨凯等[27]报道了山鸡椒[Litsea cubeba （Lour.） Pers.]挥发油对烟草甲的触杀活性，LD50为 27.33 μg/头，熏蒸活性LC50为 22.97 mg/L。王颖等[2830]研究报道了几种姜科植物对烟草甲的触杀和熏蒸活性，其中云南草蔻（Alpinia blepharocalyx K. Schum.）、 紫色姜（Zingiber purpureum Rosc.）和草果（Amomum tsaoko Crevost et Lemaire）对烟草甲的触杀毒性LD50分别为15.02、16.3和6.14 μg/头，熏蒸毒性LC50分别为3.83、9.30和8.70 mg/L。王成芳等[3132]报道了两种花椒属植物对烟草甲的杀虫活性，单面针根部挥发油对烟草甲显示出触杀活性，LD50为13.8 μg/头，竹叶花椒茎枝挥发油对烟草甲具有熏蒸（LC50=13.83 mg/L）和触杀活性（LD50=18.74 μg/头）。本研究结果显示牡荆叶挥发油对烟草甲的触杀和熏蒸活性比以上报道的活性相对较弱，但牡荆油作为常用药[33]，比大多数常规杀虫剂对人体安全危害小，因而具有一定优势。
综上所述，本研究证实了牡荆叶挥发油对烟草甲具有熏蒸和触杀毒性，并且其中的β石竹烯和桉油精也有一定的杀虫作用。牡荆油比大多数常规杀虫剂对人体安全危害小，并且资源丰富，在控制烟仓害虫方面的应用前景广阔。但将挥发油大范围应用于烟仓害虫防治的成本与效益以及相关的杀虫作用机理还需要做进一步的研究。
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