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摘要：目的 用RBL-2H3细胞初步评价清开灵、血塞通注射液类过敏反应，为完善中药注射剂类过敏反应的筛选提供实验依据。方法 MTT法测定2种药物对细胞生长的IC50；采用不同浓度药物、C48/80或培养液分别刺激细胞30 min，检测上清液中组胺、β-氨基己糖苷酶释放率；另取刺激后的细胞，观察其脱颗粒率及超微结构变化。取ICR小鼠进行类过敏试验，以含伊文思蓝的药物或生理盐水单次尾静脉注射30 min，记录每组耳廓蓝染的动物数、蓝染总耳数及耳廓伊文思蓝渗出量。结果 离体实验显示，清开灵、血塞通注射液的IC50均为12.5 μL/mL；2种药物在较高浓度均能促进细胞释放组胺和β-氨基己糖苷酶（P<0.05，P<0.01），呈一定剂量依赖性；形态上可见细胞表面绒毛减少，内部空泡状结构增加。小鼠类过敏试验显示，2种药物对动物耳蓝染率均为100%、伊文思蓝渗出量明显增多（P<0.01）。离体与整体实验结果一致。结论 清开灵、血塞通注射液具有潜在的致类过敏反应性，RBL-2H3细胞模型用于中药注射剂类过敏性评价具有一定的参考应用价值。
关键词：清开灵注射液；血塞通注射液；RBL-2H3细胞；类过敏反应
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.09.016
中图分类号：R285.6 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）09-0053-05
基金项目：国家科技重大专项-重大新药创制（2009ZX0902- 002、2011ZX09301-009）
通讯作者：金若敏，E-mail：rmj801@126.com
在迄今中药注射剂的不良反应报道中，严重的不良反应以过敏反应表现为主。在已报道的过敏反应中，不排除其中有相当一部分为类过敏反应所致，而目前在类过敏反应评价实验中，多以整体实验为主。在离体实验中，肥大细胞是过敏反应和类过敏研究中主要效应细胞之一。RBL-2H3细胞表面表达高亲和力的IgE受体，能模拟肥大细胞的多种生物功能，在免疫性或非免疫性刺激下，RBL-2H3细胞均具有脱颗粒特性，因此，常用于与肥大细胞脱颗粒相关研究[1]。本研究以临床常用的清开灵注射液、血塞通注射液为主要研究药物，考察药物细胞毒作用及对细胞脱颗粒的影响，并结合动物整体研究结果，进一步对该细胞用于中药注射剂类过敏评价中的可行性进行研究。
1 实验材料
1.1 动物与细胞
清洁级雄性ICR小鼠，体质量24～27 g，购于上海西普尔必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK （沪）2008-0016，饲养于上海中医药大学动物实验中心。RBL-2H3细胞，购于中国科学院细胞资源中心，以含15%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养于37 ℃、95%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中，每3 d以1∶3稀释传代培养1次。
1.2 药物与配制
清开灵注射液（以下简称“清开灵”），10 mL/支，河北某药业有限公司，批号0907046；血塞通注射液（以下简称“血塞通”），规格100 mg/支，昆明某药业有限公司，批号09FJ21；Compound48/80（C48/80， Sigma公司，C2313-100MG）。
细胞实验药物配制：清开灵或血塞通各1支，用培养液或台式稀释液稀释至所需浓度即可。
小鼠耳廓蓝染实验药物配制：取清开灵1支，用生理盐水稀释，再与0.8%伊文思蓝等体积混合后，得到含0.4%伊文思蓝的浓度为2.4、0.3、0.15 mL/mL清开灵药物稀释液，即为清开灵高、中、低剂量组；取血塞通1支（2 mL），用生理盐水稀释，再与0.8%伊文思蓝等体积混合后，即得到含0.4%伊文思蓝的浓度为24.0、3.0、1.5 mg/mL的血塞通药物稀释液，即为血塞通高、中、低剂量组；称取5 mg C48/80，用10 mL生理盐水溶解，得0.5 mg/mL C48/80母液，再与0.8%伊文思蓝等体积混匀，得含0.4%伊文思蓝的0.25 mg/mL C48/80溶液，作为C48/80组受试药物；空白对照组直接给予含有0.4%伊文思蓝的生理盐水。根据产品说明书，清开灵静脉滴注临床推荐剂量为20～40 mL/d，以10%葡萄糖注射液200 mL或生理盐水注射液100 mL稀释后使用。血塞通静脉注射临床推荐剂量为200～400 mg/次，以5%～10%葡萄糖注射液或生理盐水250～500 mL稀释后缓缓滴注，每日1次。因此本实验设计的中药注射剂高、中、低剂量组分别相当于临床推荐等效剂量上限的8倍、临床推荐剂量范围的上限、临床推荐剂量范围的下限。
1.3 试剂与配制
高糖DMEM培养基（Gibco公司，批号1290007），胎牛血清（HycLone公司，批号SV30087.02），双抗（Gibco，批号J112061），噻唑蓝溶液（MTT，Sigma，批号M2128），TritonX-100（北京鼎国生物，批号AR-0341），组胺试剂盒（Sigma公司，纯度≥99.0%），β-氨基己糖苷（Sigma公司，批号129K5008），伊文思蓝（国药集团，批号WC20080125）。
培养液配制：取1包高糖DMEM培养基粉末加入到1000 mL超纯水中，并加入1.5 g碳酸氢钠粉，搅拌均匀调整pH至7.2，用0.22 μm滤膜过滤除菌后，加入双抗至浓度为100 U/mL，再加入胎牛血清浓度至15%。台式缓冲液：NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，
glucose 5.6 mmol/L，CaCl2 1.8 mmol/L，MgCl2 1 mmol/L，
HEPES 20 mmol/L，BSA 1 g，pH 7.4。
MTT溶液配制：MTT 0.5 g，溶于100 mL的磷酸缓冲液（PBS），用0.22 μm滤膜过滤，4 ℃避光保存备用。 1.4 主要仪器
Thermo细胞培养箱，BioTek全自动酶标仪， TPL-40B水平低速离心机，OLympus倒置系统显微镜，西格玛2-16K冷冻离心机。
2 方法与结果
2.1 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据均用—x±s表示，方差齐者组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析；小鼠耳廓蓝染平均评分统计分析采用非参数检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2.2 IC10、IC50和IC80检测
取对数生长的RBL-2H3细胞，调整浓度至1×105/mL，以100 μL/孔接种于96孔板中，每孔补足培养液80 μL，即每孔总体积为180 μL。设空白组、不同浓度清开灵或血塞通药物组，每组设4个复孔。RBL-2H3细胞培养24 h后，药物组加入培养液稀释的清开灵或血塞通，空白组加入等体积培养液，继续培养20 h后，室温下1200 r/min离心5 min，弃上清液，加入200 μL培养液及5 mg/mL MTT溶液20 μL，4 h后室温离心，弃上清液，加入150 μL MTT溶解液（含10%SDS及50%N，N-二甲基甲酰胺），37 ℃溶解过夜，于570 nm处测OD值，计算抑制率[（空白组OD值-实验组OD值）÷空白组OD值×100%]。结果显示，清开灵和血塞通的IC80、IC50、IC10分别为50、12.5、1.56 μL/mL和33.3、12.5、3.33 μL/mL。
2.3 清开灵、血塞通对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响
2.3.1 组胺及β-氨基己糖苷酶的释放 取对数生长的细胞，调整浓度至1×105/mL，1 mL/孔接种于24孔板中，培养24 h后。弃上清液，用台式缓冲液清洗，避免培养液颜色干扰。每孔加入台式缓冲液360 μL，设空白组、C48/80组、不同浓度清开灵和血塞通中药组、总酶组，每组设3个复孔。C48/80组加入C48/80 40 μL （终浓度为80 μg/L）；中药组分别加入40 μL的含清开灵和血塞通的台式稀释液，使各孔中药物终浓度分别为其IC80、IC50、IC10，空白组加入等容积的台式缓冲液，总酶组加入等容积的0.5%TritonX-100。置于培养箱中30 min，取上清液，4 ℃、2000 r/min离心10 min， -20 ℃储存，用于检测组胺及β-氨基己糖苷酶释放率。
取200 μL待测细胞上清液加到含200 μL三蒸水中，加入50 μL 0.4 moL/L NaOH和10 μL邻苯二甲醛（OPT），混匀，室温避光反应10 min，用50 μL 0.1 moL/L盐酸终止反应，用荧光酶标仪于吸收光349 nm和发射光448 nm测定荧光值。以荧光强度为纵坐标，相应的组胺量为横坐标绘制标准曲线，可根据标准曲线图或标准曲线方程计算出被测量样品组胺浓度（ng/mL），计算释放率[（实验孔上清液组胺含量÷总酶孔上清液组胺含量）×100%]。
取各孔细胞上清液50 μL转入96孔培养板中，同时加入50 μL底物（1 mmol/L β-氨基己糖苷的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH 4.5），37 ℃孵育60 min，最后加入200 μL终止液（0.1 mmol/L Na2CO3/NaHCO3，pH 10.0）终止反应，在酶标仪405 nm处测OD值[2]，计算释放率[（实验孔上清液OD值÷总酶孔上清液OD值）×100%]。
结果显示，与空白组比较，C48/80能引起细胞明显释放β-氨基己糖苷酶、组胺（P<0.01）；血塞通、清开灵在IC80、IC50时β-氨基己糖苷酶、组胺释放明显增多（P<0.05，P<0.01）。清开灵在IC10可促组胺释放，两者比较，清开灵致细胞脱颗粒释放介质能力更强，见表1。
2.3.2 形态学观察
2.3.2.1 甲苯胺蓝染色 另取细胞，按照上述“2.3.1”项下实验过程中操作，每组3个复孔，分别加入C48/80、不同浓度清开灵和血塞通30 min后，弃上清液，加入1 mL含10%甲醛溶液的PBS室温固定10～15 min，弃固定液后，加入1 mL 1%甲苯胺蓝染色液室温染色10 min，弃染色液，显微镜下（×40倍）计数，每孔按“#”分成9个计数视野区域，随机计数其中3个视野区域，记录视野下细胞总数及脱颗粒细胞总数。脱颗粒细胞判定标准：正常细胞染色均匀，呈蓝色，边缘完整；脱颗粒细胞染色不均，呈蓝紫色，细胞膨胀或边缘破裂。计算脱颗粒率（脱颗粒细胞数÷视野下细胞总数×100%），相对脱颗粒倍数=药物组细胞脱颗粒率÷空白组细胞脱颗粒率。结果显示，与空白组比较，C48/80、清开灵及血塞通的IC10即可引起细胞明显脱颗粒（P<0.01），并呈一定的剂量依赖性。从相对脱颗粒倍数来看，清开灵和血塞通比较，以清开灵致细胞脱颗粒作用较强，见表1。
2.3.2.2 透射电镜观察 取对数生长期的细胞，按照“2.3.1”项细胞浓度直接培养在10 cm直径培养皿中，每个药物浓度组设1皿。按照“2.3.1”项操作加入不同浓度清开灵和血塞通处理后，分别收集各皿中全部细胞，离心，取细胞团块，用预冷的2.5%戊二醛4 ℃固定，进行透射电镜样本处理及超微结构观察。结果显示，正常组RBL-2H3细胞表面有大量绒毛，细胞内部有极少量空泡状结构；随清开灵、血塞通浓度增加，细胞表面绒毛减少，细胞内部空泡状结构增加，高剂量组部分细胞表面已无绒毛结构，细胞膜不完整，甚至破裂。
2.4 小鼠类过敏试验
参照文献[3]，将ICR小鼠随机分为清开灵高、中、低剂量组和血塞通高、中、低剂量组及空白组、C48/80组，每组10只。记录每只小鼠体质量；各组小鼠尾静脉注射给予生理盐水稀释的含小鼠有0.4%伊文思蓝的受试药物，给药体积为20 mL/kg，观察给药后30 min内动物耳廓蓝染情况，记录每组出现耳廓蓝染的动物数、蓝染总耳数、耳廓蓝染面积，进行耳廓蓝染面积评分。0分：双耳无蓝染；1分：0<蓝染面积≤1/8；2分：1/8<蓝染面积≤1/4；3分：1/4<蓝染面积≤1/2；4分：1/2<蓝染面积≤3/4；5分：3/4<蓝染面积≤1。处死动物，取双耳，剪碎，用2 mL丙酮-生理盐水（7∶3）混合浸泡，4 ℃过夜，3000 r/min离心15 min，取上清液200 μL于酶标仪610 nm处测光密度值（OD值），根据伊文思蓝标准曲线，计算伊文思蓝染料的渗出量。 结果显示，C48/80组小鼠蓝染率为90%，清开灵各剂量组小鼠蓝染率均为100%，与空白组比较平均得分明显增加（P<0.01）；血塞通高、中剂量组小鼠蓝染率为100%，血塞通低剂量组蓝染率为80%，除血塞通低剂量组外各组平均得分明显增加（P<0.01）。C48/80组、清开灵各剂量组、血塞通各剂量组使小鼠耳廓伊文思蓝渗出量明显增多（P<0.01）。
血塞通组（低）
3 讨论
一般认为，类过敏反应不经IgE介导，在患者首次用药即可产生，其发生可能与致敏物质直接刺激肥大细胞释放组胺等炎性介质有关[4]，因此，肥大细胞是类过敏反应发生中的重要效应细胞之一，RBL-2H3细胞具有肥大细胞的特征，其在中药注射剂类过敏反应研究中应用越来越受到研究者的关注。
现代研究表明，清开灵能致Beagle犬产生明显类过敏症状及血清组胺含量升高，引起清开灵类过敏反应的物质可能与栀子提取物、黄芩苷、胆酸有关，而金银花、栀子中均含有绿原酸，但高纯度的绿原酸并未引起Beagle犬产生相应的类过敏反应[5-7]。本实验结果表明，清开灵直接刺激RBL-2H3细胞脱颗粒作用非常强，并呈现一定的剂量依赖性。清开灵IC80、IC50、IC10均能引起细胞组胺释放明显增加，甲苯胺蓝法及透射电镜下亦能观察到一定的细胞脱颗粒变化，因此，提示清开灵可能具有潜在致类过敏反应性。
血塞通主要成分为三七总皂苷，现代研究表明，血塞通所致的不良反应主要以皮肤反应为主，严重者可出现呼吸困难或过敏性休克等[8-9]。以不同浓度血塞通直接刺激RBL-2H3细胞可引起不同程度的细胞脱颗粒现象，并存在一定的剂量相关性，其中IC80、IC50均能引起细胞明显脱颗粒释放组胺、β-氨基己糖苷酶，甲苯胺蓝及透射电镜下亦能观察到一定的细胞脱颗粒变化，提示血塞通临床使用时具有一定潜在致类过敏反应性。
清开灵、血塞通在高于或等于临床等效剂量下，均能一定程度上使小鼠耳廓蓝染，但两药物产生耳廓蓝染特点存在明显差异。清开灵在临床推荐等效剂量范围内及以上剂量均导致小鼠耳廓出现明显蓝染。本实验进一步对清开灵的生理盐水稀释液pH值进行检测，结果其pH值均在6.93～7.10范围内，符合规定，因此，推测本实验中小鼠耳廓蓝染情况可能由注射剂中潜在的致类过敏成分所致。血塞通只在临床推荐的高剂量及其以上剂量时产生了明显致小鼠耳廓蓝染，而临床低剂量未见明显耳廓蓝染，进一步研究发现其生理盐水稀释液pH值稳定维持在6.19～6.22，符合规定。本研究结果提示，血塞通具有潜在的致类过敏反应性，并且与剂量呈正相关。
根据产品说明书，单次静脉给药后清开灵在血液内最大浓度约为6×10-3 mL/mL，本实验中所用清开灵IC80、IC50、IC10分别为50×10-3、12.5×10-3、1.56×10-3 mL/mL（约相当血液浓度的8、2、0.3倍），3个剂量均能刺激RBL-2H3细胞明显释放组胺，进一步提示在临床应用剂量范围内，清开灵具有一定的潜在类过敏反应性。
清开灵、血塞通在其IC80、IC50下均能明显影响细胞生长，表现一定的细胞毒作用，而在此浓度下2种注射液均能致RBL-2H3细胞出现明显脱颗粒现象，因此，推测细胞脱颗粒强度除药物本身类过敏反应所致外，还可能与注射液的细胞毒作用有关。但在IC10时清开灵仍使细胞释放组胺明显增加，而血塞通未见明显变化。关氏等[10]研究亦表明，无明显细胞毒作用下的甲氧基聚乙二醇-聚乳酸共聚物40/60（mPEG- PDLLA40/60）、吐温80也能促进RBL-2H3细胞脱颗粒。综合以上现象提示，RBL-2H3细胞脱颗粒可能会受药物细胞毒作用影响，但仍能一定程度上反映药物潜在的致类过敏反应性。
综合本实验研究结果，清开灵、血塞通均具有一定直接刺激RBL-2H3细胞脱颗粒作用，且均能使小鼠耳廓出现明显蓝染，进一步说明清开灵、血塞通具有潜在致类过敏反应性，同时提示RBL-2H3细胞在评价类过敏研究中具有一定的参考应用价值。此外，本研究表明，RBL-2H3细胞脱颗粒可能会受药物细胞毒作用影响，但仍能一定程度上反映药物潜在的类过敏反应性，因此建议研究时采用IC10以下浓度并参考临床剂量，设多个浓度组，既能减少药物毒性对细胞脱颗粒的影响，又能为临床应用提供一定的参考。
参考文献：
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[10] 关翠雯，金晶，李佳，等.常用注射用辅料刺激RBL-2H3细胞脱颗粒的作用[J].毒理学杂志，2012，26（2）：98-101.
（收稿日期：2014-01-24；编辑：华强）
关键词：清开灵注射液；血塞通注射液；RBL-2H3细胞；类过敏反应
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.09.016
中图分类号：R285.6 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）09-0053-05
基金项目：国家科技重大专项-重大新药创制（2009ZX0902- 002、2011ZX09301-009）
通讯作者：金若敏，E-mail：rmj801@126.com
在迄今中药注射剂的不良反应报道中，严重的不良反应以过敏反应表现为主。在已报道的过敏反应中，不排除其中有相当一部分为类过敏反应所致，而目前在类过敏反应评价实验中，多以整体实验为主。在离体实验中，肥大细胞是过敏反应和类过敏研究中主要效应细胞之一。RBL-2H3细胞表面表达高亲和力的IgE受体，能模拟肥大细胞的多种生物功能，在免疫性或非免疫性刺激下，RBL-2H3细胞均具有脱颗粒特性，因此，常用于与肥大细胞脱颗粒相关研究[1]。本研究以临床常用的清开灵注射液、血塞通注射液为主要研究药物，考察药物细胞毒作用及对细胞脱颗粒的影响，并结合动物整体研究结果，进一步对该细胞用于中药注射剂类过敏评价中的可行性进行研究。
1 实验材料
1.1 动物与细胞
清洁级雄性ICR小鼠，体质量24～27 g，购于上海西普尔必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK （沪）2008-0016，饲养于上海中医药大学动物实验中心。RBL-2H3细胞，购于中国科学院细胞资源中心，以含15%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养于37 ℃、95%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中，每3 d以1∶3稀释传代培养1次。
1.2 药物与配制
清开灵注射液（以下简称“清开灵”），10 mL/支，河北某药业有限公司，批号0907046；血塞通注射液（以下简称“血塞通”），规格100 mg/支，昆明某药业有限公司，批号09FJ21；Compound48/80（C48/80， Sigma公司，C2313-100MG）。
细胞实验药物配制：清开灵或血塞通各1支，用培养液或台式稀释液稀释至所需浓度即可。
小鼠耳廓蓝染实验药物配制：取清开灵1支，用生理盐水稀释，再与0.8%伊文思蓝等体积混合后，得到含0.4%伊文思蓝的浓度为2.4、0.3、0.15 mL/mL清开灵药物稀释液，即为清开灵高、中、低剂量组；取血塞通1支（2 mL），用生理盐水稀释，再与0.8%伊文思蓝等体积混合后，即得到含0.4%伊文思蓝的浓度为24.0、3.0、1.5 mg/mL的血塞通药物稀释液，即为血塞通高、中、低剂量组；称取5 mg C48/80，用10 mL生理盐水溶解，得0.5 mg/mL C48/80母液，再与0.8%伊文思蓝等体积混匀，得含0.4%伊文思蓝的0.25 mg/mL C48/80溶液，作为C48/80组受试药物；空白对照组直接给予含有0.4%伊文思蓝的生理盐水。根据产品说明书，清开灵静脉滴注临床推荐剂量为20～40 mL/d，以10%葡萄糖注射液200 mL或生理盐水注射液100 mL稀释后使用。血塞通静脉注射临床推荐剂量为200～400 mg/次，以5%～10%葡萄糖注射液或生理盐水250～500 mL稀释后缓缓滴注，每日1次。因此本实验设计的中药注射剂高、中、低剂量组分别相当于临床推荐等效剂量上限的8倍、临床推荐剂量范围的上限、临床推荐剂量范围的下限。
1.3 试剂与配制
高糖DMEM培养基（Gibco公司，批号1290007），胎牛血清（HycLone公司，批号SV30087.02），双抗（Gibco，批号J112061），噻唑蓝溶液（MTT，Sigma，批号M2128），TritonX-100（北京鼎国生物，批号AR-0341），组胺试剂盒（Sigma公司，纯度≥99.0%），β-氨基己糖苷（Sigma公司，批号129K5008），伊文思蓝（国药集团，批号WC20080125）。
培养液配制：取1包高糖DMEM培养基粉末加入到1000 mL超纯水中，并加入1.5 g碳酸氢钠粉，搅拌均匀调整pH至7.2，用0.22 μm滤膜过滤除菌后，加入双抗至浓度为100 U/mL，再加入胎牛血清浓度至15%。台式缓冲液：NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，
glucose 5.6 mmol/L，CaCl2 1.8 mmol/L，MgCl2 1 mmol/L，
HEPES 20 mmol/L，BSA 1 g，pH 7.4。
MTT溶液配制：MTT 0.5 g，溶于100 mL的磷酸缓冲液（PBS），用0.22 μm滤膜过滤，4 ℃避光保存备用。 1.4 主要仪器
Thermo细胞培养箱，BioTek全自动酶标仪， TPL-40B水平低速离心机，OLympus倒置系统显微镜，西格玛2-16K冷冻离心机。
2 方法与结果
2.1 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据均用—x±s表示，方差齐者组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析；小鼠耳廓蓝染平均评分统计分析采用非参数检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2.2 IC10、IC50和IC80检测
取对数生长的RBL-2H3细胞，调整浓度至1×105/mL，以100 μL/孔接种于96孔板中，每孔补足培养液80 μL，即每孔总体积为180 μL。设空白组、不同浓度清开灵或血塞通药物组，每组设4个复孔。RBL-2H3细胞培养24 h后，药物组加入培养液稀释的清开灵或血塞通，空白组加入等体积培养液，继续培养20 h后，室温下1200 r/min离心5 min，弃上清液，加入200 μL培养液及5 mg/mL MTT溶液20 μL，4 h后室温离心，弃上清液，加入150 μL MTT溶解液（含10%SDS及50%N，N-二甲基甲酰胺），37 ℃溶解过夜，于570 nm处测OD值，计算抑制率[（空白组OD值-实验组OD值）÷空白组OD值×100%]。结果显示，清开灵和血塞通的IC80、IC50、IC10分别为50、12.5、1.56 μL/mL和33.3、12.5、3.33 μL/mL。
2.3 清开灵、血塞通对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响
2.3.1 组胺及β-氨基己糖苷酶的释放 取对数生长的细胞，调整浓度至1×105/mL，1 mL/孔接种于24孔板中，培养24 h后。弃上清液，用台式缓冲液清洗，避免培养液颜色干扰。每孔加入台式缓冲液360 μL，设空白组、C48/80组、不同浓度清开灵和血塞通中药组、总酶组，每组设3个复孔。C48/80组加入C48/80 40 μL （终浓度为80 μg/L）；中药组分别加入40 μL的含清开灵和血塞通的台式稀释液，使各孔中药物终浓度分别为其IC80、IC50、IC10，空白组加入等容积的台式缓冲液，总酶组加入等容积的0.5%TritonX-100。置于培养箱中30 min，取上清液，4 ℃、2000 r/min离心10 min， -20 ℃储存，用于检测组胺及β-氨基己糖苷酶释放率。
取200 μL待测细胞上清液加到含200 μL三蒸水中，加入50 μL 0.4 moL/L NaOH和10 μL邻苯二甲醛（OPT），混匀，室温避光反应10 min，用50 μL 0.1 moL/L盐酸终止反应，用荧光酶标仪于吸收光349 nm和发射光448 nm测定荧光值。以荧光强度为纵坐标，相应的组胺量为横坐标绘制标准曲线，可根据标准曲线图或标准曲线方程计算出被测量样品组胺浓度（ng/mL），计算释放率[（实验孔上清液组胺含量÷总酶孔上清液组胺含量）×100%]。
取各孔细胞上清液50 μL转入96孔培养板中，同时加入50 μL底物（1 mmol/L β-氨基己糖苷的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH 4.5），37 ℃孵育60 min，最后加入200 μL终止液（0.1 mmol/L Na2CO3/NaHCO3，pH 10.0）终止反应，在酶标仪405 nm处测OD值[2]，计算释放率[（实验孔上清液OD值÷总酶孔上清液OD值）×100%]。
结果显示，与空白组比较，C48/80能引起细胞明显释放β-氨基己糖苷酶、组胺（P<0.01）；血塞通、清开灵在IC80、IC50时β-氨基己糖苷酶、组胺释放明显增多（P<0.05，P<0.01）。清开灵在IC10可促组胺释放，两者比较，清开灵致细胞脱颗粒释放介质能力更强，见表1。
2.3.2 形态学观察
2.3.2.1 甲苯胺蓝染色 另取细胞，按照上述“2.3.1”项下实验过程中操作，每组3个复孔，分别加入C48/80、不同浓度清开灵和血塞通30 min后，弃上清液，加入1 mL含10%甲醛溶液的PBS室温固定10～15 min，弃固定液后，加入1 mL 1%甲苯胺蓝染色液室温染色10 min，弃染色液，显微镜下（×40倍）计数，每孔按“#”分成9个计数视野区域，随机计数其中3个视野区域，记录视野下细胞总数及脱颗粒细胞总数。脱颗粒细胞判定标准：正常细胞染色均匀，呈蓝色，边缘完整；脱颗粒细胞染色不均，呈蓝紫色，细胞膨胀或边缘破裂。计算脱颗粒率（脱颗粒细胞数÷视野下细胞总数×100%），相对脱颗粒倍数=药物组细胞脱颗粒率÷空白组细胞脱颗粒率。结果显示，与空白组比较，C48/80、清开灵及血塞通的IC10即可引起细胞明显脱颗粒（P<0.01），并呈一定的剂量依赖性。从相对脱颗粒倍数来看，清开灵和血塞通比较，以清开灵致细胞脱颗粒作用较强，见表1。
2.3.2.2 透射电镜观察 取对数生长期的细胞，按照“2.3.1”项细胞浓度直接培养在10 cm直径培养皿中，每个药物浓度组设1皿。按照“2.3.1”项操作加入不同浓度清开灵和血塞通处理后，分别收集各皿中全部细胞，离心，取细胞团块，用预冷的2.5%戊二醛4 ℃固定，进行透射电镜样本处理及超微结构观察。结果显示，正常组RBL-2H3细胞表面有大量绒毛，细胞内部有极少量空泡状结构；随清开灵、血塞通浓度增加，细胞表面绒毛减少，细胞内部空泡状结构增加，高剂量组部分细胞表面已无绒毛结构，细胞膜不完整，甚至破裂。
2.4 小鼠类过敏试验
参照文献[3]，将ICR小鼠随机分为清开灵高、中、低剂量组和血塞通高、中、低剂量组及空白组、C48/80组，每组10只。记录每只小鼠体质量；各组小鼠尾静脉注射给予生理盐水稀释的含小鼠有0.4%伊文思蓝的受试药物，给药体积为20 mL/kg，观察给药后30 min内动物耳廓蓝染情况，记录每组出现耳廓蓝染的动物数、蓝染总耳数、耳廓蓝染面积，进行耳廓蓝染面积评分。0分：双耳无蓝染；1分：0<蓝染面积≤1/8；2分：1/8<蓝染面积≤1/4；3分：1/4<蓝染面积≤1/2；4分：1/2<蓝染面积≤3/4；5分：3/4<蓝染面积≤1。处死动物，取双耳，剪碎，用2 mL丙酮-生理盐水（7∶3）混合浸泡，4 ℃过夜，3000 r/min离心15 min，取上清液200 μL于酶标仪610 nm处测光密度值（OD值），根据伊文思蓝标准曲线，计算伊文思蓝染料的渗出量。 结果显示，C48/80组小鼠蓝染率为90%，清开灵各剂量组小鼠蓝染率均为100%，与空白组比较平均得分明显增加（P<0.01）；血塞通高、中剂量组小鼠蓝染率为100%，血塞通低剂量组蓝染率为80%，除血塞通低剂量组外各组平均得分明显增加（P<0.01）。C48/80组、清开灵各剂量组、血塞通各剂量组使小鼠耳廓伊文思蓝渗出量明显增多（P<0.01）。
血塞通组（低）
3 讨论
一般认为，类过敏反应不经IgE介导，在患者首次用药即可产生，其发生可能与致敏物质直接刺激肥大细胞释放组胺等炎性介质有关[4]，因此，肥大细胞是类过敏反应发生中的重要效应细胞之一，RBL-2H3细胞具有肥大细胞的特征，其在中药注射剂类过敏反应研究中应用越来越受到研究者的关注。
现代研究表明，清开灵能致Beagle犬产生明显类过敏症状及血清组胺含量升高，引起清开灵类过敏反应的物质可能与栀子提取物、黄芩苷、胆酸有关，而金银花、栀子中均含有绿原酸，但高纯度的绿原酸并未引起Beagle犬产生相应的类过敏反应[5-7]。本实验结果表明，清开灵直接刺激RBL-2H3细胞脱颗粒作用非常强，并呈现一定的剂量依赖性。清开灵IC80、IC50、IC10均能引起细胞组胺释放明显增加，甲苯胺蓝法及透射电镜下亦能观察到一定的细胞脱颗粒变化，因此，提示清开灵可能具有潜在致类过敏反应性。
血塞通主要成分为三七总皂苷，现代研究表明，血塞通所致的不良反应主要以皮肤反应为主，严重者可出现呼吸困难或过敏性休克等[8-9]。以不同浓度血塞通直接刺激RBL-2H3细胞可引起不同程度的细胞脱颗粒现象，并存在一定的剂量相关性，其中IC80、IC50均能引起细胞明显脱颗粒释放组胺、β-氨基己糖苷酶，甲苯胺蓝及透射电镜下亦能观察到一定的细胞脱颗粒变化，提示血塞通临床使用时具有一定潜在致类过敏反应性。
清开灵、血塞通在高于或等于临床等效剂量下，均能一定程度上使小鼠耳廓蓝染，但两药物产生耳廓蓝染特点存在明显差异。清开灵在临床推荐等效剂量范围内及以上剂量均导致小鼠耳廓出现明显蓝染。本实验进一步对清开灵的生理盐水稀释液pH值进行检测，结果其pH值均在6.93～7.10范围内，符合规定，因此，推测本实验中小鼠耳廓蓝染情况可能由注射剂中潜在的致类过敏成分所致。血塞通只在临床推荐的高剂量及其以上剂量时产生了明显致小鼠耳廓蓝染，而临床低剂量未见明显耳廓蓝染，进一步研究发现其生理盐水稀释液pH值稳定维持在6.19～6.22，符合规定。本研究结果提示，血塞通具有潜在的致类过敏反应性，并且与剂量呈正相关。
根据产品说明书，单次静脉给药后清开灵在血液内最大浓度约为6×10-3 mL/mL，本实验中所用清开灵IC80、IC50、IC10分别为50×10-3、12.5×10-3、1.56×10-3 mL/mL（约相当血液浓度的8、2、0.3倍），3个剂量均能刺激RBL-2H3细胞明显释放组胺，进一步提示在临床应用剂量范围内，清开灵具有一定的潜在类过敏反应性。
清开灵、血塞通在其IC80、IC50下均能明显影响细胞生长，表现一定的细胞毒作用，而在此浓度下2种注射液均能致RBL-2H3细胞出现明显脱颗粒现象，因此，推测细胞脱颗粒强度除药物本身类过敏反应所致外，还可能与注射液的细胞毒作用有关。但在IC10时清开灵仍使细胞释放组胺明显增加，而血塞通未见明显变化。关氏等[10]研究亦表明，无明显细胞毒作用下的甲氧基聚乙二醇-聚乳酸共聚物40/60（mPEG- PDLLA40/60）、吐温80也能促进RBL-2H3细胞脱颗粒。综合以上现象提示，RBL-2H3细胞脱颗粒可能会受药物细胞毒作用影响，但仍能一定程度上反映药物潜在的致类过敏反应性。
综合本实验研究结果，清开灵、血塞通均具有一定直接刺激RBL-2H3细胞脱颗粒作用，且均能使小鼠耳廓出现明显蓝染，进一步说明清开灵、血塞通具有潜在致类过敏反应性，同时提示RBL-2H3细胞在评价类过敏研究中具有一定的参考应用价值。此外，本研究表明，RBL-2H3细胞脱颗粒可能会受药物细胞毒作用影响，但仍能一定程度上反映药物潜在的类过敏反应性，因此建议研究时采用IC10以下浓度并参考临床剂量，设多个浓度组，既能减少药物毒性对细胞脱颗粒的影响，又能为临床应用提供一定的参考。
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（收稿日期：2014-01-24；编辑：华强）