【摘 要】
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目的:探讨G蛋白偶联受体75(G-protein-coupled receptor 75,GPR75)介导的PLC/PKC信号通路在20-羟二十烷四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acid,20-HETE)诱导的乳鼠心肌细胞凋亡中的作用.方法:采用慢病毒转染敲减乳鼠心肌细胞GPR75基因表达;RT-qPCR和Western blot检测GPR75 mRNA及细胞色素C(cyto?chrome C,CytC)和caspase-3蛋白表达;ELISA法检测三磷酸肌醇(inosito
【机 构】
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遵义医科大学生理学教研室,贵州遵义563000
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目的:探讨G蛋白偶联受体75(G-protein-coupled receptor 75,GPR75)介导的PLC/PKC信号通路在20-羟二十烷四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acid,20-HETE)诱导的乳鼠心肌细胞凋亡中的作用.方法:采用慢病毒转染敲减乳鼠心肌细胞GPR75基因表达;RT-qPCR和Western blot检测GPR75 mRNA及细胞色素C(cyto?chrome C,CytC)和caspase-3蛋白表达;ELISA法检测三磷酸肌醇(inositol triphosphate,IP3)含量以及蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和NADPH氧化酶活性;Fluo-3/AM探针法检测细胞内Ca2+浓度;二氢乙啶(dihydroethidine,DHE)荧光探针检测细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的含量;TUNEL法检测细胞凋亡情况.结果:在培养的乳鼠心肌细胞中,GPR75在mRNA及蛋白水平均有表达,且20-HETE具有促进细胞内GPR75表达的作用(P<0.05);经20-HETE处理后,细胞内IP3含量升高,而敲减GPR75或应用磷脂酶C(phospholipase C,PLC)抑制剂U73122可显著阻断20-HETE的如上效应,细胞内IP3含量降低(P<0.05);敲减GPR75表达、应用PLC抑制剂以及IP3受体阻断剂2-氨基乙氧基二苯基硼酸酯(2-aminoethoxydiphenyl borate,2-APB)预处理,可抑制20-HETE诱导的细胞内Ca2+浓度升高(P<0.05);敲减GPR75表达、应用PKC抑制剂GF109203X或NADPH氧化酶抑制剂apocynin处理后,20-HETE诱导的细胞内ROS生成被抑制(P<0.05);同时,敲减GPR75表达可降低20-HETE作用的细胞中PKC、NADPH氧化酶的活性(P<0.05);最后,敲减GPR75表达、应用U73122或GF109203X,均可减少20-HETE诱导的心肌细胞凋亡率及凋亡相关蛋白CytC和caspase-3的表达(P<0.05).结论:GPR75介导的PLC/PKC信号通路通过引起心肌细胞钙超载、ROS生成增多,参与了20-HETE诱导的乳鼠心肌细胞凋亡进程.
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