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摘 要：目的：通过皮下埋植双氢睾酮（DHT）缓释剂并结合运动，探讨雄激素对骨骼肌内mTOR通路和MAPK通路的影响，旨在对雄激素促进骨骼肌蛋白合成的调控机制进行深入研究。方法：24只雄性成熟SD大鼠在适应性训练后随机分为安静对照组（S）、DHT组（D）、运动组（E）和DHT运动组（ED）。在大鼠颈背部皮下埋植DHT缓释剂，在作用10 d后于末次运动后12 h取材。分别检测肌肉湿重、肌纤维横断面、IGFI和AR基因表达，MHC含量及AR、MEK、ERK、p90RSK、mTOR、p70S6K和4EBP1磷酸化。结果：1）DHT、运动组和DHT运动组的腓肠肌湿重分别比对照组高3.1%、2.1%和6.7%，肌纤维横截面积比对照组增加了28%、5%和27%。MHC比对照组增加了25%、27%和44%。2）DHT组、运动组和DHT运动组AR基因分别为对照组的3.43倍、1.97倍和5.92倍。IGFI基因分别为对照组的2.48倍、1.63倍和3.59倍。3）DHT组AR、MEK、ERK、p90RSK、mTOR、p70S6K和4EBP1磷酸化分别增加21%、35%、31%、30%、26%、28%和23%；运动组的分别增加25%、30%、23%、24%、38%、27%和32%；DHT运动组的分别增加45%、72%、53%、60%、59%、44%和55%。结论：1）DHT明显促进了骨骼肌的肥大，使肌肉横断面、肌肉湿重和MHC明显增加。而且，运动加强了雄激素的这种促合成效应。2）DHT和运动均能促进肌肉内IGFI的生物合成，且运动具有协同增强效应。3）DHT明显促进肌肉内MAPK通路和mTOR通路活性的增强。
关键词：双氢睾酮（DHT）；雄激素受体（AR）；mTOR通路；MAPK通路；适应性肌肉肥大；骨骼肌；腓肠肌；肌肉蛋白
中图分类号：G804.2 文献标志码：A 文章编号：1007-3612（2012）11-0046-08
The Effects of Androgen Regulating on the MAPK and mTOR Pathway of Skeletal Muscle
ZHAO Hua， ZENG Fanxing
（Beijing Sport University， Beijing 100084， China）
Abstract：Objective： The researchers focused on the mechanism of androgen regulating muscle hypertrophy， and investigated the changing characteristics and regular pattern of MAPK pathway and mTOR pathway of skeletal muscle by exercise and exogenous DHT. Methods： 24 adult male SpragueDawley rats （8 weeks old） were randomly divided into 4 groups after adaptive training： sedentary （S）， subcutaneous（SC） implant of DHT （D）， exercise （E）， and combination of exercise and sc implant of DHT （ED）. For DHT administration， each animal received an subcutaneous implant of a DHTcontaining pellet. The others had sham operation. White gastrocnemius was isolated at 12 h after last exercise. The protein concentration of skeletal muscle was determined by BCA assay. The CSA of gastrocnemius were analyzed by HE staining. The AR and IGFI mRNA were analyzed by realtime fluorescence quantitative RTPCR assay. The protein expression of MHC and the phosphorylation expression of AR， MEK， ERK， p90RSK， mTOR， p70S6K and 4EBP1 of skeletal muscle were examined by western blotting analysis. Results： 1） Contrast to S group， wet muscle weight of D， E and ED group were increased 3.1%， 2.1% and 6.7%. CSA were increased 28%， 5% and 27%. MHC were incresed 25%， 27% and 44%. 2） Contrast to S group， AR mRNA of D， E and ED group were increased to 3.43 folds， 1.97 folds and 5.92 folds. IGFI mRNA were increased to 2.48 folds， 1.63 folds and 3.59 folds. 3） Phosphorylation expression of AR， MEK， ERK， p90RSK， mTOR， p70S6K and 4EBP1 of D group were increased 21%， 35%， 31%， 30%， 26%， 28% and 23%. E Group’s were increased 25%， 30%， 23%， 24%， 38%， 27% and 32%. ED group’s were increased 45%， 72%， 53%， 60%， 59%， 44% and 55%. Conclusions： These results suggest that： 1） DHT promoted muscular hypertrophy. CSA， wet muscle weight and MHC were significantly elevated by DHT. Exercise had synergistic effect of DHT on muscular hypertrophy. 2） The muscular IGFI could enhanced by DHT and exercise， which had synergistic effect. 3） The muscular MAPK pathway and mTOR pathway could enhanced by DHT. Key words： dihydrotestosterone （DHT）； androgen receptor （AR）； mTOR pathway， MAPK pathway， adaptive muscular hypertrophy；skeletal muscle； gastrocnemius muscle； muscle protein
雄激素是强有力的促肌肉合成物质。它能有效地增强肌肉体积及力量，并能减少脂肪积累。雄激素发挥其促肌肉肥大效应的机制，以前认为主要是基因作用。雄激素到达靶细胞后，与靶细胞内的AR结合，使AR构像发生改变，雄激素雄激素受体复合物在细胞核内与ARE结合，促进雄激素效应基因的转录。而近些年的一些研究发现，雄激素也具有非基因作用。它的非基因途径主要与细胞的一些信号通路有关。近些年的研究发现，雄激素可促进MAPK通路的表达。而同时发现，其与骨骼肌内蛋白合成信号通路最重要的mTOR也有一定的密切联系。而这两条通路都是受到上位的IGFI来调控的。有研究发现，雄激素能促进肌肉内IGFI的表达。据此推测，雄激素可能是通过以IGFI为介导来发挥它的非基因作用。此外，雄激素功能的发挥主要依赖于与AR的相互作用，AR的活性对雄激素功能的发挥起着重要作用。本研究旨在研究雄激素对运动骨骼肌内IGFI、AR、MAPK通路和mTOR通路的影响，并且弄清在雄激素作用下，这些细胞信号通路的地位如何。本研究采用皮下埋植DHT缓释剂并结合运动，观察骨骼肌内AR、IGFI、MAPK通路和mTOR通路的变化，旨在对雄激素促进骨骼肌蛋白合成机制进行深入研究。
1 研究对象与方法
1.1 实验对象 雄性、SPF级、8周龄SD大鼠，体重（290.9±13.5）g，由北京维通利华实验动物中心提供，许可证号：SCXK（京）2006-2009。在清华大学生物技术中心的实验动物房饲养。每箱四只，自由饮食。昼夜12-12 h循环照明。自由饮食。
正式实验前，动物在跑台上进行4 d的适应性训练，休息3 d。24只大鼠分为安静对照组、DHT组、运动组和DHT运动组（表1）。将动物随机分在各个实验组中，组间体重无显著性差异（P>0.05）。
1.2 动物干预方案 正式训练按以下一次性运动负荷方案进行：速度20 m/min，坡度10%，持续时间60 min。
术后3 d休息，并每天注射青霉素以抗术后炎症反应，自第四天起停止注射青霉素。在第四天到第10 d每天进行训练。最后一次运动在上午进行，于运动后12 h取材（当天进行）。同一批次的单纯运动组也同时进行运动，也于末次运动后12 h取材。
1.3 雄激素给药与方法 DHT缓释剂： 5αDHT片剂，50 mg/片（购自美国Innovative Research of America公司）。
干预方式：颈肩部皮下埋植（严格按产品说明书要求操作及外科手术常规操作）。先以50 mg/kg体重的戊巴比妥钠（1%浓度）进行腹腔麻醉，将颈背部手术区的毛发剪除，消毒后在颈背部正中间处的皮肤纵向切开约1 cm的小口，置入DHT缓释片后进行手术缝合。术后臀肌注射青霉素以抗炎症反应。
1.4 测试样本采集与处理 各运动组动物分别在运动后12 h麻醉取材。以5 mL/kg剂量，腹腔注射20%乌拉坦麻醉。麻醉后先进行腹主动脉取血，再迅速取出完整腓肠肌，去除筋膜和脂肪等，取其白腓肠肌（位于腓肠肌外侧浅层）。用OCT（SAKURA，O.C.T. Compound）包裹后，投入用液氮预冷的装有异戊烷（-70℃）的小烧杯中速冻，之后迅速用锡纸包好标记放入液氮中，取出后用封口袋密封后于-70℃冻存，用于冷冻切片。安静组以同样的麻醉剂量和取材方法提取白腓肠肌。
切去用于形态学研究的肌肉块后，剩下白腓肠肌切成每块重约100 mg大小分装，用锡纸包好、标记后放入液氮中，于-70℃冻存，留做匀浆用。
1.5 指标测试方法
1.5.1 提取蛋白 匀浆缓冲液的配制：取RIPA裂解液100 mL，分别加入蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂（Roche公司）各10片，最后取PMSF（100 mM）1 000 μL加入。PMSF于临用前数分钟加入。于匀浆前新鲜配制。
用精密天平称取100 mg腓肠肌，迅速剪碎后在研钵内用液氮研磨成粉，并迅速加入到装有预冷1 mL匀浆液的EP管中。冰上静置20 min。于4℃，12 000 g，15 min离心，取上清液，分装后保存于-70℃待测。
1.5.2 肌肉蛋白浓度测试 采用BCA测试方法。标准曲线制备：取1 mg/mL BSA 标准蛋白分别配制0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mg/mL浓度梯度。将标准品及适当稀释的样本加入微孔板内，各孔200 μL BCA工作液，室温放置2 h。测定A630 nm。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
1.5.3 Western Blot测试［1］ 取40 μg总蛋白配制成上样体系，置95℃沸水中 5 min，再于4℃中冷却，上样前以3 000 r/min离心5 min。配制分离胶6%（mTOR和MHC）、10%（AR、MEK1/2、ERK1/2、p90RSK、p70S6K、βactin）或15%（4EBP1），以及5%浓缩胶。浓缩胶用80 V恒压，分离胶换120 V恒压电泳。再用半干转将蛋白转到NC膜上，以恒压20 V半干转。封闭90min后用加入一抗，不同抗体稀释比例分别为Fast Myosin Skeletal Heavy chain antibody ［MY-32］ （Abcam公司）为1：2 000，PhosphoAR（Ser210）（Abcam公司）为1：800，PhosphoERK1/2（T202/Y204）（Cell Signaling公司）为1：1 000，PhosphoMEK1/2（Ser217/221）（Cell Signaling公司）为1：800，Phosphop90RSK（Thr573）（Cell Signaling公司）为1：400，PhosphomTOR（Ser2448）（Cell Signaling公司）为1：500，Phosphop70S6K（Thr389）（Cell Signaling公司）为1：400，Phospho-4EBP1（Thr37/46）（Cell Signaling公司）为1：800，βactin（Sant Cruz公司）为1：500，4℃孵育过夜。TBST洗膜后用不同浓度二抗室温孵育60 min。用ECL发光试剂与膜在暗室中反应、曝光。曝光底片用凝胶成像系统的透光进行拍照，用Quantity One图像分析系统分析。将每个条带与相应样品的βactin条带光密度值进行比较，计算出目的条带的相对含量值。 1.5.4 基因测试
1.5.4.1 引物设计 引物设计：AR、IGFI和GAPDH基因引物采用Primer Premier 6和Oligo 7软件进行引物设计和校验，并在Pubmed基因数据库比对筛选（表2）。上述引物及Oligo（dT）15且均由上海生工生物公司合成。引物设计基于以下基因合成：
AR基因序列：NM_012502.1_cdsid_NP_036634.1；
IGFI（all）基因序列：NM_001082477.2_cdsid_NP_001075946.2；
GAPDH基因序列：NM_017008.3_cdsid_NP_058704.1。
1.5.4.2 RNA抽提［2， 3］ 取100 mg腓肠肌组织进行液氮研磨后，采用TRIzol法抽提总RNA。
1.5.4.3 RNA质量鉴定
1）定性分析：琼脂糖水平电泳。
2）定量分析：紫外分光光度计测试。通过对A230 nm、A325 nm和A260 nm/A280 nm计算，观察样本被污染的程度，以及RNA样本的纯度。
计算样本中RNA的量：公式C（μg/mL）=A2600.025［4］。
1.5.4.4 逆转录反应 将总RNA与Oligo（dT）15、dNTP混合物加入无核酶的EP管中，在PCR仪上用65℃反应5 min，然后迅速冰上冷却。短暂离心后，加入5×第一链合成缓冲液、DTT和RNaseOUT核酸酶抑制剂后，在PCR仪上37℃下孵育2 min。室温下加入MMLV逆转录酶。在PCR仪上反应（37℃，50 min；70℃，15 min）。
1.5.4.5 荧光定量PCR反应 将Platinum SYBR Green qPCR SuperMixUDG、上游引物、下游引物、ROX参考染料、cDNA样放入EP管后，放入荧光定量PCR仪进行反应。设置如下：50℃，2 min；95℃，2 min；95℃，15 s；60℃，60 s（40循环），同时收集数据。再进行PCR产物的熔解曲线分析。
1.5.5 肌肉HE染色
1.5.5.1 冰冻切片［5］ 组织块温度平衡后进行切片（8 μm），用有APES涂层的洁净玻片贴取切片。而后浸入4℃预冷的丙酮中固定5 min。再于室温下风干，冻存于-20℃待测。
1.5.5.2 HE染色 常规HE染色，用中性树胶封片。室温保存。
1.5.5.3 染色结果分析 HE染色玻片置于奥林帕斯光学显微镜下，用配套IPP图像采集系统拍照。图片结果用ImagePro Plus 6.0软件进行分析。
1.6 统计学分析 实验数据的计量资料用均数士标准差（SD）表示。数据处理应用SPSS 13.0软件。组间比较采用双因素方差分析（UNIANOVA）和单因素方差分析（OneWay ANOVA）。采用LSD或Tamhane’s T2方法进行组间多重比较。显著性检验水平以P<0.05表示差异具有显著性差异，P<0.01表示具有非常显著性差异。
2 实验结果
2.1 腓肠肌湿重 在皮下埋值DHT 10 d后，各组腓肠肌的湿重如表3和图1所示。
DHT埋植10 d后，各组间的腓肠肌湿重虽然没有显著性差异，但仍表现出一定的趋势。其中以DHT运动组为最高，其次为DHT组，再者为运动组，最后为对照组。与对照组相比，分别增长6.7%、3.1%和2.1%。
DHT埋植10 d后，DHT因素明显促进了腓肠肌的肌纤维横截面积（P<0.01），运动因素和DHT结合运动有促进的趋势（P>0.05）。DHT运动组（P<0.05）和DHT组（P<0.05）肌纤维横截面积均显著高于对照组，但运动虽高于对照组，但未达显著性（P>0.05）。与对照组相比，DHT组、运动组和DHT运动组分别增长了28%（P<0.05）、5%（P>0.05）和27%（P<0.05）。DHT组与DHT运动组间无显著差异。
2.3 腓肠肌AR和IGFI基因表达结果 皮下埋植DHT剂10 d后腓肠肌AR基因和IGFI基因表达值的变化。荧光定量PCR扩增反应后的熔解曲线分析呈现良好的单峰状态（表5，图4）。
DHT干预10 d后，DHT因素（P<0.01）和运动因素（P<0.01）均显著促进AR基因和IGFI基因的表达。对于AR基因来说，单纯DHT埋植10 d使其表达为对照的3.43倍（P<0.01），单纯运动则使其为对照的1.97倍（P<0.01），而当两者结合后，能使其为对照的5.92倍（P<0.01）。而且，两者在促进AR基因表达方面，具有明显协同促进作用（P<0.01）。
对于IGFI基因来说，单纯DHT埋植10 d使其表达为对照的2.48倍（P<0.01），单纯运动则使其为对照的1.63倍（P<0.01），而当两者结合后，能使其为对照的3.59倍（P<0.01）。两者在促进IGFI基因表达方面，具有明显协同促进作用（P<0.01）。
2.4 Western blotting结果 皮下埋植DHT 10 d后，测试不同组别腓肠肌各信号蛋白的相对含量变化（表6，图5）。
DHT干预10 d后，DHT因素（P<0.01）、运动因素（P<0.01）和DHT结合运动（P<0.05）均显著促进腓肠肌的肌球蛋白重链（MHC）的表达。单纯DHT（P<0.01）、运动（P<0.01）或两者结合（P<0.01）分别使其表达增加25%、27%和44%。
DHT因素（P<0.01）和运动因素（P<0.01）均显著促进AR Ser210、MEK Ser217/221、ERK T202/Y204、p90RSK Thr573、mTOR Ser2448、p70S6K Thr389和4EBP1 Thr37/46磷酸化的表达，DHT结合运动（P<0.01）显著促进MEK磷酸化表达，对AR、ERK、p90RSK、mTOR、p70S6K和4EBP1磷酸化有促进趋势（P>0.05）。单纯DHT作用下，可使AR、MEK、ERK、p90RSK、mTOR、p70S6K和4EBP1磷酸化分别增加21%、35%、31%、30%、26%、28%和23%；单纯运动可使其分别增加25%、30%、23%、24%、38%、27%和32%；两者结合情况下，可使其分别增加45%、72%、53%、60%、59%、44%和55%。 3 分析与讨论
3.1 雄激素及运动对骨骼肌形态和肌肉蛋白的影响 机体的雄激素主要有睾酮和DHT。本研究显示，皮下埋植DHT明显增加了肌纤维的横截面积。在DHT作用10 d后，使肌纤维横截面积增加了28%。这与其它学者的研究，如Serra［6］、Frese ［7］等研究结果一致。而本研究中运动的促肌肉肥大效应未能充分体现，仅有增加的趋势（增长5%，P>0.05）。这可能与本研究实验设计的时间较短有关。本研究所选的运动模型带有一定程度的抗阻效果，在其它学者如曾凡星［8］、贺道远［9］、朱一力［10］等的研究中得到证实：SD大鼠以10%的坡度，速度达到20 m/min的跑台训练，即可引起肌肉的肥大。抗阻练习引起肌肉肥大主要是以快肌为主，而雄激素对肌肉的肥大效应也主要以快肌为主。Frese等［7］研究发现，给大鼠以去甲雄烯二酮、去氧甲基睾酮或睾酮（1 mg/kg体重）12 d后，腓肠肌所发生的肥大主要以Ⅱx/d型纤维为主，而Ⅰ型纤维和Ⅱa型纤维的横截面积变化不大，但Ⅱb型纤维面积明显下调（即使与去势大鼠相比）。
本研究还对各组腓肠肌MHC含量结果进行了检测。当DHT干预10 d后，DHT因素（P<0.01）和运动因素（P<0.01）均显著促进肌肉MHC的表达。单纯DHT（P<0.01）、运动（P<0.01）或两者结合（P<0.01）分别使其表达增加25%、27%和44%。各组肌肉MHC含量值与肌纤维横截面积的变化较为相似。不过运动组虽然促进肌纤维横截面积的增长，但未达到显著性。而运动对肌肉MHC的影响达到一个比较高的水平，形成肌肉中的蛋白增多，而纤维却较细的现象。这可能与运动应力引起肌肉纤维排列更有规律所致，具体还有待于进一步的研究。
虽然DHT组和DHT运动组的腓肠肌湿重增长了3.1%和6.7%，但这种增长未达到显著性（P>0.05）。有研究表明，雄激素在促进肌肉增长的同时，也具有一定的减脂效果［11- 12］。在大鼠腓肠肌明显肥大的同时，肌肉湿重增长的幅度却与之不相一致。这可能由于水分和/或脂肪成分同步减少所致。虽然本实验未能同时对肌肉内的脂肪成分进行检测，但许多研究发现有雄激素可以增强肌肉的脂代谢的现象存在。Ibebunjo等［13］研究发现，去势小鼠在补充雄激素后，骨骼肌内除Ⅱ型纤维面积增大外，SDH活性也明显增加。后者有利于机体的脂代谢过程。van Breda等［14］的研究显示，在大鼠皮下埋植睾酮剂（净含0.013 g睾酮）两周后，比目鱼肌内的肌型脂肪结合蛋白（FABP）含量增加了16%。虽然快肌成份较高的趾长伸肌并没有明显变化，但实验表明睾酮可使慢肌纤维的脂代谢增强。本实验所取肌肉为腓肠肌，白腓肠肌的快肌比例几乎为100%，而红腓肠肌的慢肌比例约为21%～25%［15］。本研究所测湿重为整块腓肠肌，出现的这种肌肉肥大但湿重却未同步快速增长的原因很可能是由于在DHT作用下，肌肉内的脂肪代谢加强所致。
3.2 雄激素及运动对骨骼肌IGFI和AR的影响 IGFI是已知的能明显促进骨骼肌肥大的物质之一。对它作用机制的研究较为深入，其主要通过mTOR通路来促进肌肉肥大。但对于IGFI与雄激素相互作用的研究较为少见。有研究发现，对雄激素的抑制能使明显降低肌肉内的IGFI。Mauras等［16］进行的一项人体实验发现，通过给健康青年男子每隔3周注射Lupron（一种长效的GnRH类似物质，剂量为7.5 mg），共进行10周的干预后，血液睾酮非常显著地降低（血液睾酮由（535±141） ng/dL降至（31±9） ng/dL）。血液里的GH和IGFI含量虽未明显减少，但肌肉内的IGFI mRNA表达却显著减少。在皮下埋植DHT 10 d后，DHT因素（P<0.01）和运动因素（P<0.01）均显著促进IGFI基因的表达。腓肠肌IGFI mRNA表达在DHT作用10 d后明显增强（为对照组的2.48倍），而运动因素的影响也非常明显（为对照组的1.63倍），但低于DHT的影响。当皮下埋植DHT剂并结合运动时，表现出对肌肉IGFI mRNA表达更强的效应（达到对照组的3.59倍）。两者结合时，呈现出对肌肉IGFI mRNA表达的叠加效应。
DHT干预10 d后，DHT因素（P<0.01）和运动因素（P<0.01）均显著促进AR基因的表达。而且，两者在促进AR基因表达方面，具有明显协同促进作用（P<0.01）。Bamman等［17］的研究也发现，在肌肉不管是离心练习还是向心收缩后，肌肉IGFI基因和AR基因的表达均显著增加。本实验所设计的急性运动，明显增强了肌肉内的AR系统和IGFI系统。研究显示，雄激素可以促进AR的表达。Mukherjee等［18］的一项离体研究发现，在LNCaP给予DHT（5 nM）处理后发现，在24 h和48 h两个时间点时，AR含量明显升高（分别为对照组2.3倍和4倍）。皮下埋植DHT 10 d后，DHT因素（P<0.01）和运动因素（P<0.01）均显著促进AR磷酸化的表达。在Mukherjee等［18］研究中发现，LNCaP施加外源性DHT（5 nM）处理后3 h时间时，即可观察到AR的活性增加了7倍，而在24 h时有很大程度的回落，但仍达2倍。本研究是在整体状态下研究DHT对AR的影响，也发现有类似现象，即DHT能明显促进AR的生物合成和活性，而且运动有协同增强效应。
3.3 雄激素及运动对骨骼肌MAPK通路的影响 对雄激素非基因途径研究较多的通路为MAPK通路，而其中主要就是MEK/ERK/RSK通路［19］。研究认为，肌肉活动可使肌肉内ERK1/2的活性迅速增加［20］。Wretman等［21］发现不管在离心收缩后还是在向心收缩后，大鼠趾长伸肌ERK1/2磷酸化显著增加。运动后ERK1/2磷酸化的增加幅度与运动强度也呈正相关。强度越大，ERK1/2的活性也就越强［22］。而且只发生在有活动的肌肉内［23］。本研究也观察到了同样的现象。另外，由于现有的研究很少将MEK/ERK/RSK通路的3个信号同时检测，本实验尝试同时检测这3个信号。研究发现，它们的磷酸化在运动后12 h时表现出同时增强的现象，尤其以ERK1/2的变化最为明显。这也意味着运动激活了此条通路。而且，在雄激素的作用之下，表现出协同增强MAPK通路的效应。 当皮下埋植DHT 10 d后，DHT因素（P<0.01）和运动因素（P<0.01）均显著促进MEK、ERK和p90RSK磷酸化的表达。单纯DHT作用下，可使MEK、ERK和p90RSK磷酸化分别增加35%、31%和30%；单纯运动可使其分别增加30%、23%和24%；两者结合情况下，可使其分别增加72%、53%和60%。Hamdi等［24］发现外源性DHT能使MAPK/ERK通路活性的增强，并引起肌纤维收缩力量的增强。当给予MAPK通路的抑制剂PD98059后，DHT失去使ERK1/2磷酸化的能力。DHT在使用一段时间后，可有效增强肌力。本研究虽未对肌力进行检测，但骨骼肌的形态学结果显示，DHT作用10 d时，骨骼肌纤维发生了明显的肥大。同时，DHT对MEK/ERK/RSK通路的效应持续保持较高的激活状态。而且运动对MEK/ERK/RSK通路的激活程度得到加强。这种现象与反复训练增强了mTOR通路活性一致［25］，也表现出多次运动对MAPK通路的累加效应。
3.4 雄激素及运动对骨骼肌mTOR通路的影响 许多研究证实，mTOR通路是骨骼肌适应性肥大过程中的核心信号通路。该通路在骨骼肌蛋白合成中起着重要作用［26-29］，而运动能明显增强这条通路的活性［25， 30-31］。Bodine等［27］发现用雷帕霉素（mTOR的阻断剂）能阻断95%的肌肉肥大。且在离体情况下，Akt/mTOR通路及其下游信号——p70S6K和4EBP1的激活能影响骨骼肌纤维的形态与功能，并能对抗废用性肌萎缩。Burd等［31］的研究发现，力量型运动员完成一组以70%的1 RM负荷做伸膝练习后，受试者MPS在恢复期后5 h时明显增加，达到2.3倍于安静水平。直到恢复期的29 h才回复正常。p70S6K的磷酸化与MPS的变化呈正相关。恢复期5 h时，p70S6K的磷酸化增加61%。
有研究显示，雄激素能影响mTOR通路。而对AR的阻断，可明显减弱mTOR通路的表达［19］。研究发现，在AR促进细胞增殖的过程中，mTOR起着非常关键的作用。Xu等［32］的一项研究显示，1 nM的DHT能明显增加LNCaP前列腺癌细胞的mTOR活性，使位于其下游的p70S6K和4EBP1磷酸化明显增强，并继而通过mTOR信号通路影响周期蛋白D，促进细胞增殖。Xu等［33］对去势大鼠皮下注射DHT（3 mg/kg体重）6 h后，肛提肌内的p70S6K磷酸化迅速增加。而同时结合使用flutamide（120 mg/kg体重）时，p70S6K磷酸化则受到了明显抑制。可见，DHT引起p70S6K磷酸化的增加主要发生于对雄激素敏感的肌肉里。Gatson等［34］的研究显示，外源性DHT能显著增强C6细胞内Akt的磷酸化，而使用flutamide（一种AR抑制剂）时，它们的磷酸化随即被阻断。Wu等［35］发现在睾酮诱导L6型肌细胞肥大的过程，mTOR磷酸化在作用后20 min就有明显增强，p70S6K磷酸化在作用后2 h时明显增强。而当使用mTOR的阻断剂时，则完全抑制了L6型肌细胞的这种肥大效应。
当DHT皮下埋植10 d后，DHT因素（P<0.01）和运动因素（P<0.01）均显著促进mTOR、p70S6K和4EBP1磷酸化的表达。单纯DHT作用下，可使mTOR、p70S6K和4EBP1磷酸化分别增加26%、28%和23%；单纯运动可使其分别增加38%、27%和32%；两者结合情况下，可使其分别增加59%、44%和55%。此时，仍然表现出运动对mTOR通路的效应强于DHT，但两者对mTOR通路仍具有协同促进效应。
有研究认为，在雄激素的非基因效应中，mTOR通路可能是主要的非基因途径。Pang等［36］为观察阻断AR介导的非基因途径后的生理效应，对3周龄的C57BL/6J小鼠皮下埋植DHT剂6周后，肌肉内的Akt磷酸增加了1.5倍，而ERK磷酸化却没有明显变化。这有可能提示，短期效应体现为MAPK通路和mTOR通路的共同参与，但在较长时间的效应，则有可能以mTOR通路为主。近些年关于前列癌的研究采用了结合mTOR抑制剂的治疗，取得了良好的效果。Schiewer等［37］的一项关于对AR敏感的前列腺癌症研究中将传统的放疗，并结合雷帕霉素来治疗，发现雷帕霉素能明显加强CRPC型前列腺癌的癌细胞对放疗的敏感性。mTOR在细胞周期中的G1期起着重要的促进作用，它能通过增强周期蛋白D而促进细胞的增殖。通过雷帕霉素来抑制细胞周期的进程，同时通过放疗来杀灭癌细胞。本实验未对相关信号加以阻断，虽然观察到MAPK通路和mTOR通路均发现了激活，但无法判断两条通路在其中的重要性。
4 结 论
1）DHT明显促进了骨骼肌的肥大，使肌肉横断面、肌肉湿重和MHC明显增加。而且，运动加强了雄激素的这种促合成效应。
2）DHT促进肌肉内IGFI和AR的生物合成，并促进AR活性的增强，且运动具有协同增强效应。
3）DHT明显促进肌肉内MAPK通路和mTOR通路活性的增强。
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关键词：双氢睾酮（DHT）；雄激素受体（AR）；mTOR通路；MAPK通路；适应性肌肉肥大；骨骼肌；腓肠肌；肌肉蛋白
中图分类号：G804.2 文献标志码：A 文章编号：1007-3612（2012）11-0046-08
The Effects of Androgen Regulating on the MAPK and mTOR Pathway of Skeletal Muscle
ZHAO Hua， ZENG Fanxing
（Beijing Sport University， Beijing 100084， China）
Abstract：Objective： The researchers focused on the mechanism of androgen regulating muscle hypertrophy， and investigated the changing characteristics and regular pattern of MAPK pathway and mTOR pathway of skeletal muscle by exercise and exogenous DHT. Methods： 24 adult male SpragueDawley rats （8 weeks old） were randomly divided into 4 groups after adaptive training： sedentary （S）， subcutaneous（SC） implant of DHT （D）， exercise （E）， and combination of exercise and sc implant of DHT （ED）. For DHT administration， each animal received an subcutaneous implant of a DHTcontaining pellet. The others had sham operation. White gastrocnemius was isolated at 12 h after last exercise. The protein concentration of skeletal muscle was determined by BCA assay. The CSA of gastrocnemius were analyzed by HE staining. The AR and IGFI mRNA were analyzed by realtime fluorescence quantitative RTPCR assay. The protein expression of MHC and the phosphorylation expression of AR， MEK， ERK， p90RSK， mTOR， p70S6K and 4EBP1 of skeletal muscle were examined by western blotting analysis. Results： 1） Contrast to S group， wet muscle weight of D， E and ED group were increased 3.1%， 2.1% and 6.7%. CSA were increased 28%， 5% and 27%. MHC were incresed 25%， 27% and 44%. 2） Contrast to S group， AR mRNA of D， E and ED group were increased to 3.43 folds， 1.97 folds and 5.92 folds. IGFI mRNA were increased to 2.48 folds， 1.63 folds and 3.59 folds. 3） Phosphorylation expression of AR， MEK， ERK， p90RSK， mTOR， p70S6K and 4EBP1 of D group were increased 21%， 35%， 31%， 30%， 26%， 28% and 23%. E Group’s were increased 25%， 30%， 23%， 24%， 38%， 27% and 32%. ED group’s were increased 45%， 72%， 53%， 60%， 59%， 44% and 55%. Conclusions： These results suggest that： 1） DHT promoted muscular hypertrophy. CSA， wet muscle weight and MHC were significantly elevated by DHT. Exercise had synergistic effect of DHT on muscular hypertrophy. 2） The muscular IGFI could enhanced by DHT and exercise， which had synergistic effect. 3） The muscular MAPK pathway and mTOR pathway could enhanced by DHT. Key words： dihydrotestosterone （DHT）； androgen receptor （AR）； mTOR pathway， MAPK pathway， adaptive muscular hypertrophy；skeletal muscle； gastrocnemius muscle； muscle protein
雄激素是强有力的促肌肉合成物质。它能有效地增强肌肉体积及力量，并能减少脂肪积累。雄激素发挥其促肌肉肥大效应的机制，以前认为主要是基因作用。雄激素到达靶细胞后，与靶细胞内的AR结合，使AR构像发生改变，雄激素雄激素受体复合物在细胞核内与ARE结合，促进雄激素效应基因的转录。而近些年的一些研究发现，雄激素也具有非基因作用。它的非基因途径主要与细胞的一些信号通路有关。近些年的研究发现，雄激素可促进MAPK通路的表达。而同时发现，其与骨骼肌内蛋白合成信号通路最重要的mTOR也有一定的密切联系。而这两条通路都是受到上位的IGFI来调控的。有研究发现，雄激素能促进肌肉内IGFI的表达。据此推测，雄激素可能是通过以IGFI为介导来发挥它的非基因作用。此外，雄激素功能的发挥主要依赖于与AR的相互作用，AR的活性对雄激素功能的发挥起着重要作用。本研究旨在研究雄激素对运动骨骼肌内IGFI、AR、MAPK通路和mTOR通路的影响，并且弄清在雄激素作用下，这些细胞信号通路的地位如何。本研究采用皮下埋植DHT缓释剂并结合运动，观察骨骼肌内AR、IGFI、MAPK通路和mTOR通路的变化，旨在对雄激素促进骨骼肌蛋白合成机制进行深入研究。
1 研究对象与方法
1.1 实验对象 雄性、SPF级、8周龄SD大鼠，体重（290.9±13.5）g，由北京维通利华实验动物中心提供，许可证号：SCXK（京）2006-2009。在清华大学生物技术中心的实验动物房饲养。每箱四只，自由饮食。昼夜12-12 h循环照明。自由饮食。
正式实验前，动物在跑台上进行4 d的适应性训练，休息3 d。24只大鼠分为安静对照组、DHT组、运动组和DHT运动组（表1）。将动物随机分在各个实验组中，组间体重无显著性差异（P>0.05）。
1.2 动物干预方案 正式训练按以下一次性运动负荷方案进行：速度20 m/min，坡度10%，持续时间60 min。
术后3 d休息，并每天注射青霉素以抗术后炎症反应，自第四天起停止注射青霉素。在第四天到第10 d每天进行训练。最后一次运动在上午进行，于运动后12 h取材（当天进行）。同一批次的单纯运动组也同时进行运动，也于末次运动后12 h取材。
1.3 雄激素给药与方法 DHT缓释剂： 5αDHT片剂，50 mg/片（购自美国Innovative Research of America公司）。
干预方式：颈肩部皮下埋植（严格按产品说明书要求操作及外科手术常规操作）。先以50 mg/kg体重的戊巴比妥钠（1%浓度）进行腹腔麻醉，将颈背部手术区的毛发剪除，消毒后在颈背部正中间处的皮肤纵向切开约1 cm的小口，置入DHT缓释片后进行手术缝合。术后臀肌注射青霉素以抗炎症反应。
1.4 测试样本采集与处理 各运动组动物分别在运动后12 h麻醉取材。以5 mL/kg剂量，腹腔注射20%乌拉坦麻醉。麻醉后先进行腹主动脉取血，再迅速取出完整腓肠肌，去除筋膜和脂肪等，取其白腓肠肌（位于腓肠肌外侧浅层）。用OCT（SAKURA，O.C.T. Compound）包裹后，投入用液氮预冷的装有异戊烷（-70℃）的小烧杯中速冻，之后迅速用锡纸包好标记放入液氮中，取出后用封口袋密封后于-70℃冻存，用于冷冻切片。安静组以同样的麻醉剂量和取材方法提取白腓肠肌。
切去用于形态学研究的肌肉块后，剩下白腓肠肌切成每块重约100 mg大小分装，用锡纸包好、标记后放入液氮中，于-70℃冻存，留做匀浆用。
1.5 指标测试方法
1.5.1 提取蛋白 匀浆缓冲液的配制：取RIPA裂解液100 mL，分别加入蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂（Roche公司）各10片，最后取PMSF（100 mM）1 000 μL加入。PMSF于临用前数分钟加入。于匀浆前新鲜配制。
用精密天平称取100 mg腓肠肌，迅速剪碎后在研钵内用液氮研磨成粉，并迅速加入到装有预冷1 mL匀浆液的EP管中。冰上静置20 min。于4℃，12 000 g，15 min离心，取上清液，分装后保存于-70℃待测。
1.5.2 肌肉蛋白浓度测试 采用BCA测试方法。标准曲线制备：取1 mg/mL BSA 标准蛋白分别配制0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mg/mL浓度梯度。将标准品及适当稀释的样本加入微孔板内，各孔200 μL BCA工作液，室温放置2 h。测定A630 nm。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
1.5.3 Western Blot测试［1］ 取40 μg总蛋白配制成上样体系，置95℃沸水中 5 min，再于4℃中冷却，上样前以3 000 r/min离心5 min。配制分离胶6%（mTOR和MHC）、10%（AR、MEK1/2、ERK1/2、p90RSK、p70S6K、βactin）或15%（4EBP1），以及5%浓缩胶。浓缩胶用80 V恒压，分离胶换120 V恒压电泳。再用半干转将蛋白转到NC膜上，以恒压20 V半干转。封闭90min后用加入一抗，不同抗体稀释比例分别为Fast Myosin Skeletal Heavy chain antibody ［MY-32］ （Abcam公司）为1：2 000，PhosphoAR（Ser210）（Abcam公司）为1：800，PhosphoERK1/2（T202/Y204）（Cell Signaling公司）为1：1 000，PhosphoMEK1/2（Ser217/221）（Cell Signaling公司）为1：800，Phosphop90RSK（Thr573）（Cell Signaling公司）为1：400，PhosphomTOR（Ser2448）（Cell Signaling公司）为1：500，Phosphop70S6K（Thr389）（Cell Signaling公司）为1：400，Phospho-4EBP1（Thr37/46）（Cell Signaling公司）为1：800，βactin（Sant Cruz公司）为1：500，4℃孵育过夜。TBST洗膜后用不同浓度二抗室温孵育60 min。用ECL发光试剂与膜在暗室中反应、曝光。曝光底片用凝胶成像系统的透光进行拍照，用Quantity One图像分析系统分析。将每个条带与相应样品的βactin条带光密度值进行比较，计算出目的条带的相对含量值。 1.5.4 基因测试
1.5.4.1 引物设计 引物设计：AR、IGFI和GAPDH基因引物采用Primer Premier 6和Oligo 7软件进行引物设计和校验，并在Pubmed基因数据库比对筛选（表2）。上述引物及Oligo（dT）15且均由上海生工生物公司合成。引物设计基于以下基因合成：
AR基因序列：NM_012502.1_cdsid_NP_036634.1；
IGFI（all）基因序列：NM_001082477.2_cdsid_NP_001075946.2；
GAPDH基因序列：NM_017008.3_cdsid_NP_058704.1。
1.5.4.2 RNA抽提［2， 3］ 取100 mg腓肠肌组织进行液氮研磨后，采用TRIzol法抽提总RNA。
1.5.4.3 RNA质量鉴定
1）定性分析：琼脂糖水平电泳。
2）定量分析：紫外分光光度计测试。通过对A230 nm、A325 nm和A260 nm/A280 nm计算，观察样本被污染的程度，以及RNA样本的纯度。
计算样本中RNA的量：公式C（μg/mL）=A2600.025［4］。
1.5.4.4 逆转录反应 将总RNA与Oligo（dT）15、dNTP混合物加入无核酶的EP管中，在PCR仪上用65℃反应5 min，然后迅速冰上冷却。短暂离心后，加入5×第一链合成缓冲液、DTT和RNaseOUT核酸酶抑制剂后，在PCR仪上37℃下孵育2 min。室温下加入MMLV逆转录酶。在PCR仪上反应（37℃，50 min；70℃，15 min）。
1.5.4.5 荧光定量PCR反应 将Platinum SYBR Green qPCR SuperMixUDG、上游引物、下游引物、ROX参考染料、cDNA样放入EP管后，放入荧光定量PCR仪进行反应。设置如下：50℃，2 min；95℃，2 min；95℃，15 s；60℃，60 s（40循环），同时收集数据。再进行PCR产物的熔解曲线分析。
1.5.5 肌肉HE染色
1.5.5.1 冰冻切片［5］ 组织块温度平衡后进行切片（8 μm），用有APES涂层的洁净玻片贴取切片。而后浸入4℃预冷的丙酮中固定5 min。再于室温下风干，冻存于-20℃待测。
1.5.5.2 HE染色 常规HE染色，用中性树胶封片。室温保存。
1.5.5.3 染色结果分析 HE染色玻片置于奥林帕斯光学显微镜下，用配套IPP图像采集系统拍照。图片结果用ImagePro Plus 6.0软件进行分析。
1.6 统计学分析 实验数据的计量资料用均数士标准差（SD）表示。数据处理应用SPSS 13.0软件。组间比较采用双因素方差分析（UNIANOVA）和单因素方差分析（OneWay ANOVA）。采用LSD或Tamhane’s T2方法进行组间多重比较。显著性检验水平以P<0.05表示差异具有显著性差异，P<0.01表示具有非常显著性差异。
2 实验结果
2.1 腓肠肌湿重 在皮下埋值DHT 10 d后，各组腓肠肌的湿重如表3和图1所示。
DHT埋植10 d后，各组间的腓肠肌湿重虽然没有显著性差异，但仍表现出一定的趋势。其中以DHT运动组为最高，其次为DHT组，再者为运动组，最后为对照组。与对照组相比，分别增长6.7%、3.1%和2.1%。
DHT埋植10 d后，DHT因素明显促进了腓肠肌的肌纤维横截面积（P<0.01），运动因素和DHT结合运动有促进的趋势（P>0.05）。DHT运动组（P<0.05）和DHT组（P<0.05）肌纤维横截面积均显著高于对照组，但运动虽高于对照组，但未达显著性（P>0.05）。与对照组相比，DHT组、运动组和DHT运动组分别增长了28%（P<0.05）、5%（P>0.05）和27%（P<0.05）。DHT组与DHT运动组间无显著差异。
2.3 腓肠肌AR和IGFI基因表达结果 皮下埋植DHT剂10 d后腓肠肌AR基因和IGFI基因表达值的变化。荧光定量PCR扩增反应后的熔解曲线分析呈现良好的单峰状态（表5，图4）。
DHT干预10 d后，DHT因素（P<0.01）和运动因素（P<0.01）均显著促进AR基因和IGFI基因的表达。对于AR基因来说，单纯DHT埋植10 d使其表达为对照的3.43倍（P<0.01），单纯运动则使其为对照的1.97倍（P<0.01），而当两者结合后，能使其为对照的5.92倍（P<0.01）。而且，两者在促进AR基因表达方面，具有明显协同促进作用（P<0.01）。
对于IGFI基因来说，单纯DHT埋植10 d使其表达为对照的2.48倍（P<0.01），单纯运动则使其为对照的1.63倍（P<0.01），而当两者结合后，能使其为对照的3.59倍（P<0.01）。两者在促进IGFI基因表达方面，具有明显协同促进作用（P<0.01）。
2.4 Western blotting结果 皮下埋植DHT 10 d后，测试不同组别腓肠肌各信号蛋白的相对含量变化（表6，图5）。
DHT干预10 d后，DHT因素（P<0.01）、运动因素（P<0.01）和DHT结合运动（P<0.05）均显著促进腓肠肌的肌球蛋白重链（MHC）的表达。单纯DHT（P<0.01）、运动（P<0.01）或两者结合（P<0.01）分别使其表达增加25%、27%和44%。
DHT因素（P<0.01）和运动因素（P<0.01）均显著促进AR Ser210、MEK Ser217/221、ERK T202/Y204、p90RSK Thr573、mTOR Ser2448、p70S6K Thr389和4EBP1 Thr37/46磷酸化的表达，DHT结合运动（P<0.01）显著促进MEK磷酸化表达，对AR、ERK、p90RSK、mTOR、p70S6K和4EBP1磷酸化有促进趋势（P>0.05）。单纯DHT作用下，可使AR、MEK、ERK、p90RSK、mTOR、p70S6K和4EBP1磷酸化分别增加21%、35%、31%、30%、26%、28%和23%；单纯运动可使其分别增加25%、30%、23%、24%、38%、27%和32%；两者结合情况下，可使其分别增加45%、72%、53%、60%、59%、44%和55%。 3 分析与讨论
3.1 雄激素及运动对骨骼肌形态和肌肉蛋白的影响 机体的雄激素主要有睾酮和DHT。本研究显示，皮下埋植DHT明显增加了肌纤维的横截面积。在DHT作用10 d后，使肌纤维横截面积增加了28%。这与其它学者的研究，如Serra［6］、Frese ［7］等研究结果一致。而本研究中运动的促肌肉肥大效应未能充分体现，仅有增加的趋势（增长5%，P>0.05）。这可能与本研究实验设计的时间较短有关。本研究所选的运动模型带有一定程度的抗阻效果，在其它学者如曾凡星［8］、贺道远［9］、朱一力［10］等的研究中得到证实：SD大鼠以10%的坡度，速度达到20 m/min的跑台训练，即可引起肌肉的肥大。抗阻练习引起肌肉肥大主要是以快肌为主，而雄激素对肌肉的肥大效应也主要以快肌为主。Frese等［7］研究发现，给大鼠以去甲雄烯二酮、去氧甲基睾酮或睾酮（1 mg/kg体重）12 d后，腓肠肌所发生的肥大主要以Ⅱx/d型纤维为主，而Ⅰ型纤维和Ⅱa型纤维的横截面积变化不大，但Ⅱb型纤维面积明显下调（即使与去势大鼠相比）。
本研究还对各组腓肠肌MHC含量结果进行了检测。当DHT干预10 d后，DHT因素（P<0.01）和运动因素（P<0.01）均显著促进肌肉MHC的表达。单纯DHT（P<0.01）、运动（P<0.01）或两者结合（P<0.01）分别使其表达增加25%、27%和44%。各组肌肉MHC含量值与肌纤维横截面积的变化较为相似。不过运动组虽然促进肌纤维横截面积的增长，但未达到显著性。而运动对肌肉MHC的影响达到一个比较高的水平，形成肌肉中的蛋白增多，而纤维却较细的现象。这可能与运动应力引起肌肉纤维排列更有规律所致，具体还有待于进一步的研究。
虽然DHT组和DHT运动组的腓肠肌湿重增长了3.1%和6.7%，但这种增长未达到显著性（P>0.05）。有研究表明，雄激素在促进肌肉增长的同时，也具有一定的减脂效果［11- 12］。在大鼠腓肠肌明显肥大的同时，肌肉湿重增长的幅度却与之不相一致。这可能由于水分和/或脂肪成分同步减少所致。虽然本实验未能同时对肌肉内的脂肪成分进行检测，但许多研究发现有雄激素可以增强肌肉的脂代谢的现象存在。Ibebunjo等［13］研究发现，去势小鼠在补充雄激素后，骨骼肌内除Ⅱ型纤维面积增大外，SDH活性也明显增加。后者有利于机体的脂代谢过程。van Breda等［14］的研究显示，在大鼠皮下埋植睾酮剂（净含0.013 g睾酮）两周后，比目鱼肌内的肌型脂肪结合蛋白（FABP）含量增加了16%。虽然快肌成份较高的趾长伸肌并没有明显变化，但实验表明睾酮可使慢肌纤维的脂代谢增强。本实验所取肌肉为腓肠肌，白腓肠肌的快肌比例几乎为100%，而红腓肠肌的慢肌比例约为21%～25%［15］。本研究所测湿重为整块腓肠肌，出现的这种肌肉肥大但湿重却未同步快速增长的原因很可能是由于在DHT作用下，肌肉内的脂肪代谢加强所致。
3.2 雄激素及运动对骨骼肌IGFI和AR的影响 IGFI是已知的能明显促进骨骼肌肥大的物质之一。对它作用机制的研究较为深入，其主要通过mTOR通路来促进肌肉肥大。但对于IGFI与雄激素相互作用的研究较为少见。有研究发现，对雄激素的抑制能使明显降低肌肉内的IGFI。Mauras等［16］进行的一项人体实验发现，通过给健康青年男子每隔3周注射Lupron（一种长效的GnRH类似物质，剂量为7.5 mg），共进行10周的干预后，血液睾酮非常显著地降低（血液睾酮由（535±141） ng/dL降至（31±9） ng/dL）。血液里的GH和IGFI含量虽未明显减少，但肌肉内的IGFI mRNA表达却显著减少。在皮下埋植DHT 10 d后，DHT因素（P<0.01）和运动因素（P<0.01）均显著促进IGFI基因的表达。腓肠肌IGFI mRNA表达在DHT作用10 d后明显增强（为对照组的2.48倍），而运动因素的影响也非常明显（为对照组的1.63倍），但低于DHT的影响。当皮下埋植DHT剂并结合运动时，表现出对肌肉IGFI mRNA表达更强的效应（达到对照组的3.59倍）。两者结合时，呈现出对肌肉IGFI mRNA表达的叠加效应。
DHT干预10 d后，DHT因素（P<0.01）和运动因素（P<0.01）均显著促进AR基因的表达。而且，两者在促进AR基因表达方面，具有明显协同促进作用（P<0.01）。Bamman等［17］的研究也发现，在肌肉不管是离心练习还是向心收缩后，肌肉IGFI基因和AR基因的表达均显著增加。本实验所设计的急性运动，明显增强了肌肉内的AR系统和IGFI系统。研究显示，雄激素可以促进AR的表达。Mukherjee等［18］的一项离体研究发现，在LNCaP给予DHT（5 nM）处理后发现，在24 h和48 h两个时间点时，AR含量明显升高（分别为对照组2.3倍和4倍）。皮下埋植DHT 10 d后，DHT因素（P<0.01）和运动因素（P<0.01）均显著促进AR磷酸化的表达。在Mukherjee等［18］研究中发现，LNCaP施加外源性DHT（5 nM）处理后3 h时间时，即可观察到AR的活性增加了7倍，而在24 h时有很大程度的回落，但仍达2倍。本研究是在整体状态下研究DHT对AR的影响，也发现有类似现象，即DHT能明显促进AR的生物合成和活性，而且运动有协同增强效应。
3.3 雄激素及运动对骨骼肌MAPK通路的影响 对雄激素非基因途径研究较多的通路为MAPK通路，而其中主要就是MEK/ERK/RSK通路［19］。研究认为，肌肉活动可使肌肉内ERK1/2的活性迅速增加［20］。Wretman等［21］发现不管在离心收缩后还是在向心收缩后，大鼠趾长伸肌ERK1/2磷酸化显著增加。运动后ERK1/2磷酸化的增加幅度与运动强度也呈正相关。强度越大，ERK1/2的活性也就越强［22］。而且只发生在有活动的肌肉内［23］。本研究也观察到了同样的现象。另外，由于现有的研究很少将MEK/ERK/RSK通路的3个信号同时检测，本实验尝试同时检测这3个信号。研究发现，它们的磷酸化在运动后12 h时表现出同时增强的现象，尤其以ERK1/2的变化最为明显。这也意味着运动激活了此条通路。而且，在雄激素的作用之下，表现出协同增强MAPK通路的效应。 当皮下埋植DHT 10 d后，DHT因素（P<0.01）和运动因素（P<0.01）均显著促进MEK、ERK和p90RSK磷酸化的表达。单纯DHT作用下，可使MEK、ERK和p90RSK磷酸化分别增加35%、31%和30%；单纯运动可使其分别增加30%、23%和24%；两者结合情况下，可使其分别增加72%、53%和60%。Hamdi等［24］发现外源性DHT能使MAPK/ERK通路活性的增强，并引起肌纤维收缩力量的增强。当给予MAPK通路的抑制剂PD98059后，DHT失去使ERK1/2磷酸化的能力。DHT在使用一段时间后，可有效增强肌力。本研究虽未对肌力进行检测，但骨骼肌的形态学结果显示，DHT作用10 d时，骨骼肌纤维发生了明显的肥大。同时，DHT对MEK/ERK/RSK通路的效应持续保持较高的激活状态。而且运动对MEK/ERK/RSK通路的激活程度得到加强。这种现象与反复训练增强了mTOR通路活性一致［25］，也表现出多次运动对MAPK通路的累加效应。
3.4 雄激素及运动对骨骼肌mTOR通路的影响 许多研究证实，mTOR通路是骨骼肌适应性肥大过程中的核心信号通路。该通路在骨骼肌蛋白合成中起着重要作用［26-29］，而运动能明显增强这条通路的活性［25， 30-31］。Bodine等［27］发现用雷帕霉素（mTOR的阻断剂）能阻断95%的肌肉肥大。且在离体情况下，Akt/mTOR通路及其下游信号——p70S6K和4EBP1的激活能影响骨骼肌纤维的形态与功能，并能对抗废用性肌萎缩。Burd等［31］的研究发现，力量型运动员完成一组以70%的1 RM负荷做伸膝练习后，受试者MPS在恢复期后5 h时明显增加，达到2.3倍于安静水平。直到恢复期的29 h才回复正常。p70S6K的磷酸化与MPS的变化呈正相关。恢复期5 h时，p70S6K的磷酸化增加61%。
有研究显示，雄激素能影响mTOR通路。而对AR的阻断，可明显减弱mTOR通路的表达［19］。研究发现，在AR促进细胞增殖的过程中，mTOR起着非常关键的作用。Xu等［32］的一项研究显示，1 nM的DHT能明显增加LNCaP前列腺癌细胞的mTOR活性，使位于其下游的p70S6K和4EBP1磷酸化明显增强，并继而通过mTOR信号通路影响周期蛋白D，促进细胞增殖。Xu等［33］对去势大鼠皮下注射DHT（3 mg/kg体重）6 h后，肛提肌内的p70S6K磷酸化迅速增加。而同时结合使用flutamide（120 mg/kg体重）时，p70S6K磷酸化则受到了明显抑制。可见，DHT引起p70S6K磷酸化的增加主要发生于对雄激素敏感的肌肉里。Gatson等［34］的研究显示，外源性DHT能显著增强C6细胞内Akt的磷酸化，而使用flutamide（一种AR抑制剂）时，它们的磷酸化随即被阻断。Wu等［35］发现在睾酮诱导L6型肌细胞肥大的过程，mTOR磷酸化在作用后20 min就有明显增强，p70S6K磷酸化在作用后2 h时明显增强。而当使用mTOR的阻断剂时，则完全抑制了L6型肌细胞的这种肥大效应。
当DHT皮下埋植10 d后，DHT因素（P<0.01）和运动因素（P<0.01）均显著促进mTOR、p70S6K和4EBP1磷酸化的表达。单纯DHT作用下，可使mTOR、p70S6K和4EBP1磷酸化分别增加26%、28%和23%；单纯运动可使其分别增加38%、27%和32%；两者结合情况下，可使其分别增加59%、44%和55%。此时，仍然表现出运动对mTOR通路的效应强于DHT，但两者对mTOR通路仍具有协同促进效应。
有研究认为，在雄激素的非基因效应中，mTOR通路可能是主要的非基因途径。Pang等［36］为观察阻断AR介导的非基因途径后的生理效应，对3周龄的C57BL/6J小鼠皮下埋植DHT剂6周后，肌肉内的Akt磷酸增加了1.5倍，而ERK磷酸化却没有明显变化。这有可能提示，短期效应体现为MAPK通路和mTOR通路的共同参与，但在较长时间的效应，则有可能以mTOR通路为主。近些年关于前列癌的研究采用了结合mTOR抑制剂的治疗，取得了良好的效果。Schiewer等［37］的一项关于对AR敏感的前列腺癌症研究中将传统的放疗，并结合雷帕霉素来治疗，发现雷帕霉素能明显加强CRPC型前列腺癌的癌细胞对放疗的敏感性。mTOR在细胞周期中的G1期起着重要的促进作用，它能通过增强周期蛋白D而促进细胞的增殖。通过雷帕霉素来抑制细胞周期的进程，同时通过放疗来杀灭癌细胞。本实验未对相关信号加以阻断，虽然观察到MAPK通路和mTOR通路均发现了激活，但无法判断两条通路在其中的重要性。
4 结 论
1）DHT明显促进了骨骼肌的肥大，使肌肉横断面、肌肉湿重和MHC明显增加。而且，运动加强了雄激素的这种促合成效应。
2）DHT促进肌肉内IGFI和AR的生物合成，并促进AR活性的增强，且运动具有协同增强效应。
3）DHT明显促进肌肉内MAPK通路和mTOR通路活性的增强。
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