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[摘要]目的：探讨IL-32在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的形成过程中所起的生物学作用。方法：收集2009年10月至2011年6月广东医学院附属医院整形外科手术切除的瘢痕疙瘩组织12例，增生性瘢痕组织12例，正常皮肤24 例，分别应用免疫组织化学技术、RT-PCR和Western Blot检测IL-32在它们中的表达情况。结果：IL-32在正常皮肤增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中均有表达，在正常皮肤中表达较强，在增生性瘢痕及瘢痕疙瘩组织中表达较弱；IL-32mRNA和IL-32蛋白在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中的表达较正常皮肤明显降低（P均<0.05），而增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组之间差异无统计学意义 （P>0.05）。结论：IL-32在病理性瘢痕组织的形成过程中起着一定的重要作用，有进一步研究的价值。
[关键词]IL-32；增生性瘢痕；瘢痕疙瘩
[中图分类号]R619+.6 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）11-1991-03
病理性瘢痕包括瘢痕疙瘩与增生性瘢痕，迄今尚无很好的治疗方法，是整形外科临床面临的棘手问题之一。1992年Dahl等[1]发现炎性细胞因子人白介素32 （interleukin-32， IL-32），2005年Kim SH等[2] 提出其有很多炎症反应细胞因子的特性。近来研究证实其不但可诱导炎性细胞因子的产生，而且在调节细胞增殖与凋亡过程中有重要的作用[3]，已经成为肿瘤和结缔组织疾病防治研究的重要对象[4]。病理性瘢痕包括瘢痕疙瘩与增生性瘢痕，瘢痕疙瘩具有肿瘤样生长的生物学特性，且被认为是一种免疫性、炎症性疾病[5]。IL-32基因是否在病理性瘢痕的发生发展过程中起作用，据笔者所查文献目前国内外尚未见报道。本实验旨在通过检测IL-32在病理性瘢痕组织的表达来初步揭示IL-32 在病理性瘢痕形成中所起的生物学作用，进而从另一角度认识病理性瘢痕的发病机制，可能从分子水平上为瘢痕防治提供新的思路。
1 材料和方法
1.1 材料：2009年10月至2011年6月收集广东医学院附属医院整形外科手术切除的瘢痕疙瘩组织标本12例，其中男性5例，女性7例，年龄17～42岁，平均年龄29.5岁；增生性瘢痕组织标本12例，其中男性4例，女性8例，年龄9～41岁，平均年龄25岁；正常皮肤标本24 例，其中男性17例，女性7例。年龄10～45岁，平均年龄29岁。标本取自先天性畸形、外伤、除皱术及包皮切除患者，取材部位为头面、胸腹及四肢，瘢痕病变时间3～6个月。所有患者均无慢性疾病史，无长期服用药物病史，瘢痕未行局部药物注射治疗，并知情同意。
1.2 免疫组化检测标本中IL-32的表达：常规制备石蜡切片，干燥保存备用。按试剂盒说明书进行免疫组织化学（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结，SP）法，中性树胶封片。每一批标本均设已知阳性对照和用PBS替代一抗的空白对照，染色结果的判断以细胞质和细胞膜出现棕黄色或者棕褐色颗粒为阳性染色。按盲法原则分别独立对实验结果进行评估。具体判断标准：采用专业图像分析软件IPP6.0对IL-32蛋白的表达进行定量分析。每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的累积光密度和所有细胞总面积，以每例5个视野的平均光密度作为该例的测量值，平均光密度=阳性反应的累积光密度/细胞总面积。
1.3 RT-PCR检测IL-32mRNA表达
1.3.1 主要试剂： Trizol 总RNA提取试剂盒、SuperScriptTMIII First-Strand synthesis system for RT-PCR和普通琼脂糖（大连宝生物工程公司），Pfu DNA Polymerase（Tiangen公司），100bp DNA marker（Santa cruz公司），焦碳酸己二酯（DEPC）、二甲基亚砜（DMSO）、核糖核酸酶A（RNase A）、溴化乙锭（EB）（Sigma公司）。
1.3.2 RT- PCR测定
1.4 Western Blot检测IL-32蛋白的表达：提取组织总蛋白后，用BCA蛋白定量试剂盒测浓度。将标准品按0μl、1μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、20μl 加到96孔板的标准品孔中，加PBS补足到20μl，每一浓度做三个复孔。测定A562，计算各浓度蛋白标准的平均吸光度，绘制标准曲线，计算回归方程。取上述蛋白样品各20μg，进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测。
1.5 统计学分析：实验数据统一采用SPSS15.0统计学软件分析，计量资料结果用均数±标准差（x±s）表示；两组间差异比较用t检验，三组间差异比较用方差分析和q检验。P>0.05差异无统计学意义，P<0.05差异有统计学意义。
2 结果
2.1 免疫组化检测结果：IL-32在正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中均有表达（图1～3），其中在正常皮肤中表达较强，在增生性瘢痕及瘢痕疙瘩组织中表达较弱，增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组IL-32蛋白的相对表达量与正常皮肤相比，其之间差异具有统计学意义（P<0.01），增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组的IL-32蛋白的相对表达量差异无统计学意义（P >0.05）（表1），表明IL-32蛋白的表达与瘢痕的增生有关。
2.2 RT-PCR检测结果：IL-32mRNA的扩增曲线、熔解曲线（图4），增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组IL-32 mRNA的相对表达量分别比正常皮肤组明显降低（P均<0.05）；增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组的相比差异无统计学意义（P>0.05）（表2），表明病理性瘢痕中IL-32基因在mRNA水平与正常皮肤差异显著。
2.3 Western Blot检测结果：电泳结果（图5、6），可见增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组IL-32蛋白表达较正常皮肤明显减少。增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组IL-32蛋白的相对表达量分别与正常皮肤相比，其之间差异具有统计学意义（P均<0.05），增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组的IL-32蛋白的相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）（表3），说明病理性瘢痕中IL-32基因在蛋白表达水平与正常皮肤差异显著。 3 讨论
目前研究发现IL-32的生物学功能如下：①诱导炎症细胞因子的产生[4]；②是重要的调节细胞增殖与凋亡的基因，如T细胞中IL-32的大量表达可诱导细胞凋亡[6]；③在自身免疫性/炎症性疾病里起重要的作用[7-10]，如IL-32可诱导多种细胞因子的产生且与多种炎症性疾病密切相关，是一种前炎症反应细胞因子，它与疾病的严重性程度有关，且在适应性免疫应答和固有性免疫应答中都发挥作用。IL-32基因已被证实可诱导炎症细胞因子的产生，其是否与增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的发生有关，尚未见文献报道。
本实验RT-PCR结果表明IL-32基因在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中表达与正常皮肤相比均明显减弱（P<0.05），差异有统计学意义，说明IL-32基因在mRNA转录水平表达异常。由此推测，在病理性瘢痕的形成过程中可能存在着IL-32基因的缺失、突变或不表达进而导致瘢痕异常增生，提示了IL-32基因在病理性瘢痕的形成过程中起着重要的作用。
免疫组织化学研究结果表明： IL-32蛋白在正常皮肤组织中的表达最强，而在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中的表达均显著低于正常皮肤中的表达。Western Blot检测结果进一步明确在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中IL-32蛋白表达量分别与正常皮肤相比明显减少（P均<0.05），表明IL-32基因在蛋白翻译水平同样发生异常。由此推断， IL-32蛋白在病理性瘢痕中的表达减少可能是由于IL-32mRNA的表达减少而引起或与相关上游的调控蛋白表达异常有关。上述实验结果揭示IL-32是病理性瘢痕发生发展中的关键因素之一，值得进一步深入研究。
[参考文献]
[1]Poon TC， Hui AY， Chan HL， et al. Prediction of liver fibrosis and cirrhosis in chronic hepatitis B infection by serum proteomic fingerprinting： a pilot study[J]. Clin Chem，2005， 51：328-335.
[2]Kim SH，Han SY，Azam T， et al. Interleukin-32： a cytokine and inducer of TNFalpha[J]. Immunity， 2005， 22（1）：131-142.
[3]李惠斌，蔡景龙.瘢痕疙瘩治疗研究进展[J].中华医学美学美容杂志，2004，10（2）：126-128.
[4]Joosten LA，Netea MG，Kim SH，et al.IL-32，a proinflammatory cy-tokine in rheumatoid arthritis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（9）∶3298-3303.
[5]Netea MG， Azam T，Ferwerda G， et al. IL-32 synergizes with nucleo-tide oligomerization domain（NOD）land（NOD）2 ligands for IL-1βand IL-6 production through a caspase 1- dependent mechanism[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（45）：16309-16314.
[6].Goda C， Kanaji T， Kanaji S， et al. Involvement of IL-32 inactivation-induced cell death in T cells [J]. Int Immunol， 2006， 18（2）：233-240.
[7]Pisitkun T， Johmstone R， Knepper MA. Discovery of urinary biomarkers[J]. Mol.Cell Proteomics， 2006， 5：1760-1771.
[8]Dianrello CA， Kim SH. IL-32， a novel cytokine with a possible role in disease[J]. Ann Rheum Dis， 2006， 65（supplⅢ）：61-64.
[9]Netea MG， Azam T， Lewis EC. Et al. Mycobacterium tuberc？Losis induces interleukin-32 production through a caspase-1/IL-18/ interferon-γdependent mechanism[J]. PLoS Med 3（8）：e277.
[10]Hansen KK， Sherman PM， Cellars L， et al. A major role for proteolytic activity and proteinase-activated receptors-2 in the pathogenesis of infectious colitis[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2005，102：8363-8368.
[收稿日期]2012-09-21 [修回日期]2011-11-03
编辑/张惠娟
[关键词]IL-32；增生性瘢痕；瘢痕疙瘩
[中图分类号]R619+.6 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）11-1991-03
病理性瘢痕包括瘢痕疙瘩与增生性瘢痕，迄今尚无很好的治疗方法，是整形外科临床面临的棘手问题之一。1992年Dahl等[1]发现炎性细胞因子人白介素32 （interleukin-32， IL-32），2005年Kim SH等[2] 提出其有很多炎症反应细胞因子的特性。近来研究证实其不但可诱导炎性细胞因子的产生，而且在调节细胞增殖与凋亡过程中有重要的作用[3]，已经成为肿瘤和结缔组织疾病防治研究的重要对象[4]。病理性瘢痕包括瘢痕疙瘩与增生性瘢痕，瘢痕疙瘩具有肿瘤样生长的生物学特性，且被认为是一种免疫性、炎症性疾病[5]。IL-32基因是否在病理性瘢痕的发生发展过程中起作用，据笔者所查文献目前国内外尚未见报道。本实验旨在通过检测IL-32在病理性瘢痕组织的表达来初步揭示IL-32 在病理性瘢痕形成中所起的生物学作用，进而从另一角度认识病理性瘢痕的发病机制，可能从分子水平上为瘢痕防治提供新的思路。
1 材料和方法
1.1 材料：2009年10月至2011年6月收集广东医学院附属医院整形外科手术切除的瘢痕疙瘩组织标本12例，其中男性5例，女性7例，年龄17～42岁，平均年龄29.5岁；增生性瘢痕组织标本12例，其中男性4例，女性8例，年龄9～41岁，平均年龄25岁；正常皮肤标本24 例，其中男性17例，女性7例。年龄10～45岁，平均年龄29岁。标本取自先天性畸形、外伤、除皱术及包皮切除患者，取材部位为头面、胸腹及四肢，瘢痕病变时间3～6个月。所有患者均无慢性疾病史，无长期服用药物病史，瘢痕未行局部药物注射治疗，并知情同意。
1.2 免疫组化检测标本中IL-32的表达：常规制备石蜡切片，干燥保存备用。按试剂盒说明书进行免疫组织化学（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结，SP）法，中性树胶封片。每一批标本均设已知阳性对照和用PBS替代一抗的空白对照，染色结果的判断以细胞质和细胞膜出现棕黄色或者棕褐色颗粒为阳性染色。按盲法原则分别独立对实验结果进行评估。具体判断标准：采用专业图像分析软件IPP6.0对IL-32蛋白的表达进行定量分析。每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的累积光密度和所有细胞总面积，以每例5个视野的平均光密度作为该例的测量值，平均光密度=阳性反应的累积光密度/细胞总面积。
1.3 RT-PCR检测IL-32mRNA表达
1.3.1 主要试剂： Trizol 总RNA提取试剂盒、SuperScriptTMIII First-Strand synthesis system for RT-PCR和普通琼脂糖（大连宝生物工程公司），Pfu DNA Polymerase（Tiangen公司），100bp DNA marker（Santa cruz公司），焦碳酸己二酯（DEPC）、二甲基亚砜（DMSO）、核糖核酸酶A（RNase A）、溴化乙锭（EB）（Sigma公司）。
1.3.2 RT- PCR测定
1.4 Western Blot检测IL-32蛋白的表达：提取组织总蛋白后，用BCA蛋白定量试剂盒测浓度。将标准品按0μl、1μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、20μl 加到96孔板的标准品孔中，加PBS补足到20μl，每一浓度做三个复孔。测定A562，计算各浓度蛋白标准的平均吸光度，绘制标准曲线，计算回归方程。取上述蛋白样品各20μg，进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测。
1.5 统计学分析：实验数据统一采用SPSS15.0统计学软件分析，计量资料结果用均数±标准差（x±s）表示；两组间差异比较用t检验，三组间差异比较用方差分析和q检验。P>0.05差异无统计学意义，P<0.05差异有统计学意义。
2 结果
2.1 免疫组化检测结果：IL-32在正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中均有表达（图1～3），其中在正常皮肤中表达较强，在增生性瘢痕及瘢痕疙瘩组织中表达较弱，增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组IL-32蛋白的相对表达量与正常皮肤相比，其之间差异具有统计学意义（P<0.01），增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组的IL-32蛋白的相对表达量差异无统计学意义（P >0.05）（表1），表明IL-32蛋白的表达与瘢痕的增生有关。
2.2 RT-PCR检测结果：IL-32mRNA的扩增曲线、熔解曲线（图4），增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组IL-32 mRNA的相对表达量分别比正常皮肤组明显降低（P均<0.05）；增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组的相比差异无统计学意义（P>0.05）（表2），表明病理性瘢痕中IL-32基因在mRNA水平与正常皮肤差异显著。
2.3 Western Blot检测结果：电泳结果（图5、6），可见增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组IL-32蛋白表达较正常皮肤明显减少。增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组IL-32蛋白的相对表达量分别与正常皮肤相比，其之间差异具有统计学意义（P均<0.05），增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组的IL-32蛋白的相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）（表3），说明病理性瘢痕中IL-32基因在蛋白表达水平与正常皮肤差异显著。 3 讨论
目前研究发现IL-32的生物学功能如下：①诱导炎症细胞因子的产生[4]；②是重要的调节细胞增殖与凋亡的基因，如T细胞中IL-32的大量表达可诱导细胞凋亡[6]；③在自身免疫性/炎症性疾病里起重要的作用[7-10]，如IL-32可诱导多种细胞因子的产生且与多种炎症性疾病密切相关，是一种前炎症反应细胞因子，它与疾病的严重性程度有关，且在适应性免疫应答和固有性免疫应答中都发挥作用。IL-32基因已被证实可诱导炎症细胞因子的产生，其是否与增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的发生有关，尚未见文献报道。
本实验RT-PCR结果表明IL-32基因在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中表达与正常皮肤相比均明显减弱（P<0.05），差异有统计学意义，说明IL-32基因在mRNA转录水平表达异常。由此推测，在病理性瘢痕的形成过程中可能存在着IL-32基因的缺失、突变或不表达进而导致瘢痕异常增生，提示了IL-32基因在病理性瘢痕的形成过程中起着重要的作用。
免疫组织化学研究结果表明： IL-32蛋白在正常皮肤组织中的表达最强，而在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中的表达均显著低于正常皮肤中的表达。Western Blot检测结果进一步明确在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中IL-32蛋白表达量分别与正常皮肤相比明显减少（P均<0.05），表明IL-32基因在蛋白翻译水平同样发生异常。由此推断， IL-32蛋白在病理性瘢痕中的表达减少可能是由于IL-32mRNA的表达减少而引起或与相关上游的调控蛋白表达异常有关。上述实验结果揭示IL-32是病理性瘢痕发生发展中的关键因素之一，值得进一步深入研究。
[参考文献]
[1]Poon TC， Hui AY， Chan HL， et al. Prediction of liver fibrosis and cirrhosis in chronic hepatitis B infection by serum proteomic fingerprinting： a pilot study[J]. Clin Chem，2005， 51：328-335.
[2]Kim SH，Han SY，Azam T， et al. Interleukin-32： a cytokine and inducer of TNFalpha[J]. Immunity， 2005， 22（1）：131-142.
[3]李惠斌，蔡景龙.瘢痕疙瘩治疗研究进展[J].中华医学美学美容杂志，2004，10（2）：126-128.
[4]Joosten LA，Netea MG，Kim SH，et al.IL-32，a proinflammatory cy-tokine in rheumatoid arthritis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（9）∶3298-3303.
[5]Netea MG， Azam T，Ferwerda G， et al. IL-32 synergizes with nucleo-tide oligomerization domain（NOD）land（NOD）2 ligands for IL-1βand IL-6 production through a caspase 1- dependent mechanism[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（45）：16309-16314.
[6].Goda C， Kanaji T， Kanaji S， et al. Involvement of IL-32 inactivation-induced cell death in T cells [J]. Int Immunol， 2006， 18（2）：233-240.
[7]Pisitkun T， Johmstone R， Knepper MA. Discovery of urinary biomarkers[J]. Mol.Cell Proteomics， 2006， 5：1760-1771.
[8]Dianrello CA， Kim SH. IL-32， a novel cytokine with a possible role in disease[J]. Ann Rheum Dis， 2006， 65（supplⅢ）：61-64.
[9]Netea MG， Azam T， Lewis EC. Et al. Mycobacterium tuberc？Losis induces interleukin-32 production through a caspase-1/IL-18/ interferon-γdependent mechanism[J]. PLoS Med 3（8）：e277.
[10]Hansen KK， Sherman PM， Cellars L， et al. A major role for proteolytic activity and proteinase-activated receptors-2 in the pathogenesis of infectious colitis[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2005，102：8363-8368.
[收稿日期]2012-09-21 [修回日期]2011-11-03
编辑/张惠娟