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摘要[目的]研究铁皮石斛组织培养与快速繁殖方法。[方法]以铁皮石斛蒴果为材料，分别探究不同培养基及培养基添加物对铁皮石斛原球茎诱导、增殖及生根的影响。[结果]最适宜的铁皮石斛萌发的培养基为1/2MS，加入0.2mg/LNAA的培养基中原球茎增殖率达120%，在培养基中加入1.0mg/L6BA和20%香蕉提取液均对其芽的增殖有良好的促进作用，添加0.25mg/LNAA、2.0mg/L6BA和20%马铃薯提取液的培养基中其再生率可高达220%，0.2mg/LNAA和20%马铃薯提取液均可显著提高铁皮石斛苗生根生长。[结论]该研究为铁皮石斛快速繁殖技术的应用奠定了理论基础。
关键词铁皮石斛；组织培养；快速繁殖
中图分类号S503.53文献标识码A文章编号0517-6611（2015）28-077-02
ResearchonTissueCultureandRapidPropagationofDendrobiiofficmalisCaulisSeedlings
ZHANGYan，LIUZonghuan，YANGChao，LIUTailin *etal
（TianjinTianshiCollege，Tianjin301700）
Abstract[Objective]TheaimwastoresearchthetissuecultureandrapidpropagationofDendrobiiofficmalisCaulis.[Method]Usingcapsularfruitasexplants，theeffectsoftheculturemediumsandadditivestotheprotocorminducing，proliferationandrootingwerediscussed.[Result]TheoptimummediumforinducingtheprotocormofDendrobiioficmalisCauliswas1/2MS.Thegrowthrateofprotocormwas120%inthemediumcontained0.2mg/LNAA.Themediumincluded1.0mg/L6BAor20%bananaextractingsolutionhadpromotiveeffecttothegerminalproliferation.Theregenerationreachedupto220%inthemediumwhichcontained0.25mg/LNAA，2.0mg/L6BAand20%potatoextractingsolution.Themediumadded0.2mg/LNAAor20%potatoextractingsolutionbothimprovedthepotatorootgrowthapparently.[Conclusion]ThestudylaidatheoreticalfoundationforapplicationofrapidpropagationtechniqueofDendrobiiofficmalisCaulis.
KeywordsDendrobiiofficmalisCaulis；Tissueculture；Rapidpropagation
铁皮石斛（DendrobiiOfficmalisCaulis），又名黑节草，为兰科植物铁皮石斛的干燥茎 [1-2]。其含有的多糖、石斛碱、多种人体所需的微量元素和氨基酸等有效成分，在抗肿瘤、提高人体免疫力、治疗胃肠道疾病、抗衰老、抗氧化、抗血小板聚集、降低血糖和治疗白内障等方面均有良好疗效 [3-4]。由于铁皮石斛对生长环境要求苛刻，自然繁殖率极低，生长缓慢，因此国内市场供应紧缺 [5]。该研究以铁皮石斛蒴果为材料，研究了多种不同有机物及其组合对铁皮石斛试管苗鲜重、苗高、长叶、发芽、生根及长势等情况的影响，对其快速繁育和推广种植具有一定的意义 [6-10]。
1材料与方法
1.1材料及处理
未开裂的铁皮石斛蒴果购于北京农业科学研究院，铁皮石斛组培苗由天津市北辰区董新房子村赵辅林提供。挑选饱满、未开裂的蒴果，流水冲洗15min，双蒸水冲洗3～5次。
1.2外植体灭菌
在超净工作台上将洗净的蒴果用75%乙醇冲洗3次后，用酒精棉球擦拭果实表面，无菌水冲洗2～3次，然后用0.1%升汞浸泡2～5min，用无菌水漂洗5次，于酒精灯上灼烧数秒后用灭菌解剖刀切开口，接种于培养基上，用遮阳布将培养皿包住，暗处培养3d，再转入光下进行培养。
1.3增殖培养
外植体在增殖培养基上生长30d后，选取直径大小在0.5～1.0cm，颜色淡绿色、没有玻璃化的团状原球茎，接种到MS培养基上。
1.4培养基和培养条件
铁皮石斛采用MS作为增殖的基本培养基。用于外植体预培养的启动培养基为1/2MS，pH6.0左右，培养条件为温度（25±2）℃、光照强度1500～2000lx、湿度60%～75%、光照12h/d。
2结果与分析
2.1不同启动培养基对无菌苗体系建立的影响
试验结果表明，MS、1/2MS、B5、N6培养基的平均萌芽率分别为80%、90%、84%、70%，可见MS培养基平均萌芽率低于B5培养基而高于N6培养基的平均萌芽率，而1/2MS培养基的平均萌芽率最高。
2.2不同浓度NAA对铁皮石斛原球茎增殖的影响
由表1可知，当培养基中添加等量6BA、不同浓度NAA时，原球茎增殖率有所增加；当NAA浓度为0.2mg/L时原球茎增殖率最大，达120%。
2.3不同浓度6BA的培养基对铁皮石斛芽增殖的影响 由表2可知，在添加等量NAA的条件下，向培养基中添加一定浓度的6BA，铁皮石斛的芽增殖率显著上升，而后随其浓度的增加而下降。1.0mg/L6BA的添加量表现出最高的繁殖率。
2.4不同浓度的香蕉、马铃薯提取液对铁皮石斛芽增殖的影响
由表3可知，在培养基中添加香蕉提取液对芽增殖效果比添加相同浓度的马铃薯提取液好。同时发现添加20%香蕉提取液时，芽及平均叶片数的倍增率最高，植株均强，叶片呈深绿色，且生出了根。
2.5不同添加物组合对铁皮石斛再生率的影响
由表4可知，在添加20%马铃薯提取液的培养基中，加入不同浓度的NAA与6BA，当NAA浓度在0.25mg/L、6BA浓度在2.0mg/L时，铁皮石斛不但分化率高且生根率也是较高的，由此可见NAA对铁皮石斛的生根有很大作用，而6BA对分化有很大作用。
2.6不同浓度NAA对铁皮石斛苗生根的影响
由表5可知，随NAA的添加浓度的增加，生根率和平均每株生根数也随之增加，但平均根长却显著缩短且出现黄叶现象。以此判断虽然高浓度的NAA对生根有利，但却会对生长产生不良影响。故在这组处理中0.2mg/L的NAA是最为适宜的浓度。
2.7不同浓度的香蕉和马铃薯提取液对铁皮石斛苗生根生长的影响
由表6可知，添加香蕉提取液对生根生长影响不大，而马铃薯提取液对生根生长有显著的促进作用，且当提取液添加量为20%时最适宜。
3结论与讨论
植物组织培养的困难之一是建立无菌体系，消毒的一个基本原则是既要杀死植物材料表面的微生物，同时尽可能降低对植物材料的伤害。亦有报道显示，适宜浓度的ABA、KT、NAA、6BA对原球茎的增殖起促进作用。该试验结果表明，最适宜的铁皮石斛萌发的培养基为1/2MS，加入0.2mg/LNAA的培养基中原球茎增殖率达120%，在培养基中加入1.0mg/L6BA和20%香蕉提取液均对其芽的增殖有良好的促进作用，添加0.25mg/LNAA、2.0mg/L6BA和20%马铃薯提取液的培养基中其再生率可高达220%，0.2mg/LNAA和20%马铃薯提取液均可显著提高铁皮石斛苗生根生长。
参考文献
[1]邵华，张玲琪，李俊梅，等.铁皮石斛研究进展[J].中草药，2004（1）：109-112.
[2]斯金平，诸燕，朱玉球，等.铁皮石斛人工栽培技术研究与应用进展[J].浙江林业科技，2009，29（6）：66-70.
[3]郭勇，程晓磊.石斛在恶性肿瘤治疗中的作用[J].浙江中西医结合杂志，2007，17（7）：454-455.
[4]张沂平，马胜林，朱远.铁皮枫斗精对肿瘤患者放化疗辅助治疗的疗效观察[J].中国中西医综合杂志，2000，120（8）：628.
[5]刘强，殷寿华，黄文，等.流苏石斛濒危原因及资源保护[J].亚热带植物科学，2007，36（4）：45-47.
[6]肖昌泰，毛昆明，杨自琼，等.不同基质对铁皮石斛组培苗成活和生长的影响[J].现在农业科技，2012（4）：147-149.
[7]何俊平，涂小云.不同培养及配方对铁皮石斛生根培养的影响[J].江苏农业科学，2013，41（2）：57-59.
[8]黄万琳.不同培养基激素配比及营养因子对云南热区铁皮石斛苗的影响[J].曲靖师范学院学报，2013，32（3）：60-63.
[9]张治国，王黎，刘骅，等.铁皮石斛原球茎分化适宜培养基研究[J].中国中药杂志，1993，18（1）：16-19.
[10]张铭，朱峰，魏小勇，等.铁皮石斛种胚萌发和原球茎质量控制[J].浙江大学学报（理学版），2000，27（1）：92-94.
关键词铁皮石斛；组织培养；快速繁殖
中图分类号S503.53文献标识码A文章编号0517-6611（2015）28-077-02
ResearchonTissueCultureandRapidPropagationofDendrobiiofficmalisCaulisSeedlings
ZHANGYan，LIUZonghuan，YANGChao，LIUTailin *etal
（TianjinTianshiCollege，Tianjin301700）
Abstract[Objective]TheaimwastoresearchthetissuecultureandrapidpropagationofDendrobiiofficmalisCaulis.[Method]Usingcapsularfruitasexplants，theeffectsoftheculturemediumsandadditivestotheprotocorminducing，proliferationandrootingwerediscussed.[Result]TheoptimummediumforinducingtheprotocormofDendrobiioficmalisCauliswas1/2MS.Thegrowthrateofprotocormwas120%inthemediumcontained0.2mg/LNAA.Themediumincluded1.0mg/L6BAor20%bananaextractingsolutionhadpromotiveeffecttothegerminalproliferation.Theregenerationreachedupto220%inthemediumwhichcontained0.25mg/LNAA，2.0mg/L6BAand20%potatoextractingsolution.Themediumadded0.2mg/LNAAor20%potatoextractingsolutionbothimprovedthepotatorootgrowthapparently.[Conclusion]ThestudylaidatheoreticalfoundationforapplicationofrapidpropagationtechniqueofDendrobiiofficmalisCaulis.
KeywordsDendrobiiofficmalisCaulis；Tissueculture；Rapidpropagation
铁皮石斛（DendrobiiOfficmalisCaulis），又名黑节草，为兰科植物铁皮石斛的干燥茎 [1-2]。其含有的多糖、石斛碱、多种人体所需的微量元素和氨基酸等有效成分，在抗肿瘤、提高人体免疫力、治疗胃肠道疾病、抗衰老、抗氧化、抗血小板聚集、降低血糖和治疗白内障等方面均有良好疗效 [3-4]。由于铁皮石斛对生长环境要求苛刻，自然繁殖率极低，生长缓慢，因此国内市场供应紧缺 [5]。该研究以铁皮石斛蒴果为材料，研究了多种不同有机物及其组合对铁皮石斛试管苗鲜重、苗高、长叶、发芽、生根及长势等情况的影响，对其快速繁育和推广种植具有一定的意义 [6-10]。
1材料与方法
1.1材料及处理
未开裂的铁皮石斛蒴果购于北京农业科学研究院，铁皮石斛组培苗由天津市北辰区董新房子村赵辅林提供。挑选饱满、未开裂的蒴果，流水冲洗15min，双蒸水冲洗3～5次。
1.2外植体灭菌
在超净工作台上将洗净的蒴果用75%乙醇冲洗3次后，用酒精棉球擦拭果实表面，无菌水冲洗2～3次，然后用0.1%升汞浸泡2～5min，用无菌水漂洗5次，于酒精灯上灼烧数秒后用灭菌解剖刀切开口，接种于培养基上，用遮阳布将培养皿包住，暗处培养3d，再转入光下进行培养。
1.3增殖培养
外植体在增殖培养基上生长30d后，选取直径大小在0.5～1.0cm，颜色淡绿色、没有玻璃化的团状原球茎，接种到MS培养基上。
1.4培养基和培养条件
铁皮石斛采用MS作为增殖的基本培养基。用于外植体预培养的启动培养基为1/2MS，pH6.0左右，培养条件为温度（25±2）℃、光照强度1500～2000lx、湿度60%～75%、光照12h/d。
2结果与分析
2.1不同启动培养基对无菌苗体系建立的影响
试验结果表明，MS、1/2MS、B5、N6培养基的平均萌芽率分别为80%、90%、84%、70%，可见MS培养基平均萌芽率低于B5培养基而高于N6培养基的平均萌芽率，而1/2MS培养基的平均萌芽率最高。
2.2不同浓度NAA对铁皮石斛原球茎增殖的影响
由表1可知，当培养基中添加等量6BA、不同浓度NAA时，原球茎增殖率有所增加；当NAA浓度为0.2mg/L时原球茎增殖率最大，达120%。
2.3不同浓度6BA的培养基对铁皮石斛芽增殖的影响 由表2可知，在添加等量NAA的条件下，向培养基中添加一定浓度的6BA，铁皮石斛的芽增殖率显著上升，而后随其浓度的增加而下降。1.0mg/L6BA的添加量表现出最高的繁殖率。
2.4不同浓度的香蕉、马铃薯提取液对铁皮石斛芽增殖的影响
由表3可知，在培养基中添加香蕉提取液对芽增殖效果比添加相同浓度的马铃薯提取液好。同时发现添加20%香蕉提取液时，芽及平均叶片数的倍增率最高，植株均强，叶片呈深绿色，且生出了根。
2.5不同添加物组合对铁皮石斛再生率的影响
由表4可知，在添加20%马铃薯提取液的培养基中，加入不同浓度的NAA与6BA，当NAA浓度在0.25mg/L、6BA浓度在2.0mg/L时，铁皮石斛不但分化率高且生根率也是较高的，由此可见NAA对铁皮石斛的生根有很大作用，而6BA对分化有很大作用。
2.6不同浓度NAA对铁皮石斛苗生根的影响
由表5可知，随NAA的添加浓度的增加，生根率和平均每株生根数也随之增加，但平均根长却显著缩短且出现黄叶现象。以此判断虽然高浓度的NAA对生根有利，但却会对生长产生不良影响。故在这组处理中0.2mg/L的NAA是最为适宜的浓度。
2.7不同浓度的香蕉和马铃薯提取液对铁皮石斛苗生根生长的影响
由表6可知，添加香蕉提取液对生根生长影响不大，而马铃薯提取液对生根生长有显著的促进作用，且当提取液添加量为20%时最适宜。
3结论与讨论
植物组织培养的困难之一是建立无菌体系，消毒的一个基本原则是既要杀死植物材料表面的微生物，同时尽可能降低对植物材料的伤害。亦有报道显示，适宜浓度的ABA、KT、NAA、6BA对原球茎的增殖起促进作用。该试验结果表明，最适宜的铁皮石斛萌发的培养基为1/2MS，加入0.2mg/LNAA的培养基中原球茎增殖率达120%，在培养基中加入1.0mg/L6BA和20%香蕉提取液均对其芽的增殖有良好的促进作用，添加0.25mg/LNAA、2.0mg/L6BA和20%马铃薯提取液的培养基中其再生率可高达220%，0.2mg/LNAA和20%马铃薯提取液均可显著提高铁皮石斛苗生根生长。
参考文献
[1]邵华，张玲琪，李俊梅，等.铁皮石斛研究进展[J].中草药，2004（1）：109-112.
[2]斯金平，诸燕，朱玉球，等.铁皮石斛人工栽培技术研究与应用进展[J].浙江林业科技，2009，29（6）：66-70.
[3]郭勇，程晓磊.石斛在恶性肿瘤治疗中的作用[J].浙江中西医结合杂志，2007，17（7）：454-455.
[4]张沂平，马胜林，朱远.铁皮枫斗精对肿瘤患者放化疗辅助治疗的疗效观察[J].中国中西医综合杂志，2000，120（8）：628.
[5]刘强，殷寿华，黄文，等.流苏石斛濒危原因及资源保护[J].亚热带植物科学，2007，36（4）：45-47.
[6]肖昌泰，毛昆明，杨自琼，等.不同基质对铁皮石斛组培苗成活和生长的影响[J].现在农业科技，2012（4）：147-149.
[7]何俊平，涂小云.不同培养及配方对铁皮石斛生根培养的影响[J].江苏农业科学，2013，41（2）：57-59.
[8]黄万琳.不同培养基激素配比及营养因子对云南热区铁皮石斛苗的影响[J].曲靖师范学院学报，2013，32（3）：60-63.
[9]张治国，王黎，刘骅，等.铁皮石斛原球茎分化适宜培养基研究[J].中国中药杂志，1993，18（1）：16-19.
[10]张铭，朱峰，魏小勇，等.铁皮石斛种胚萌发和原球茎质量控制[J].浙江大学学报（理学版），2000，27（1）：92-94.