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摘要：吉拉尔迪嗜铜菌（Cupriavidus gilardii）是一种需氧、氧化酶阳性、无芽孢、端鞭毛或周身鞭毛运动的葡萄糖非发酵革兰阴性杆菌。根据16S rRNA测序和表型的差异，该菌先后被命名为吉拉尔迪罗斯顿菌（Ralstonia gilardii），吉拉尔迪沃特斯菌（Wautersia gilardii）和吉拉尔迪嗜铜菌（Cupriavidus gilardii）。
关键词：吉拉尔迪嗜铜菌，痰液，药敏试验，儿童
【中图分类号】R720.5 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2020）06-291-02
吉拉尔迪嗜铜菌的生物致病性尚不清楚，引起人类感染的频率较低，但临床已经从脑脊液，血液，疖，伤口，咽拭子，大便，导管，脓肿引流物中分离出来[1]。本例中，我们在临床上从 1 例儿童患者痰液中分离出一株吉拉尔迪嗜铜菌，现报道如下并对相关文献进行复习。
1 病例报道
患者女，2岁10月，既往有癫痫病史，KCNQ2基因杂合变异（与癫痫性脑病有关）。此次由于反复发热5天，最高39.6℃，伴咳嗽，痰难排出就诊于急诊科，5天前于当地医院查白细胞2.74×109 /L，中性粒细胞94%，HB：86g/L， PLT：29×109 /L，CRP：26.4 mg/dl，PCT：22.58 ng/ml，胸片显示双肺肺炎，遂予阿奇霉素，头孢哌酮舒巴坦钠抗感染，治疗期间患者血常规三系降低，不排除血液系统疾病，于我院急诊就诊。入院后查白细胞2.9×109 /L，中性粒细胞61%，HB：74g/L， PLT：22×109 /L，CRP：11.65 mg/dl，PCT：13.24 ng/ml。體格检查，体温 38. 4 ℃，全身皮肤苍白，双肺呼吸音粗，可闻及干啰音，以1：全血细胞减少，待查 2：支气管肺炎 3：癫痫 4：发育指标延迟 5：蛋白质-能量营养不良收入院。入院后予完善呼吸道病原检查，肺炎支原体，肺炎衣原体，腺病毒，呼吸道合胞病毒，肠道病毒，甲型流感病毒，乙型流感病毒，副流感病毒，Q热立克次体，嗜肺军团菌均阴性，胸部X片：双肺炎症，胸部CT：1：双侧肺炎，2：双侧胸腔少量积液。入院后予亚胺培南抗感染，止咳化痰，雾化等治疗。后予复查呼吸道病原检查：腺病毒，流感病毒，人博卡病毒，人偏肺病毒，鼻病毒阴性，EB病毒抗体检查阳性，EB病毒DNA检查阴性，患者病情较重，转入PICU后予气管插管术，中心静脉置管术，患者痰液较多，难以排出，予气管插管后吸痰送培养，检出纯培养菌落吉拉尔迪嗜铜菌。先后予亚胺培南，美罗培南，万古霉素，头孢哌酮舒巴坦抗感染治疗，患者出院时无发热，无咳嗽，咳痰，白细胞5.8×109 /L，中性粒细胞47%，HB：85g/L， PLT：458×109 /L，CRP：1.5mg/dl，胸片显示双肺渗出灶较前减少。
2 微生物鉴定与药敏
患者因痰较难排出，入住PICU予气管插管后吸痰送培养，按照标准操作流程接种于哥伦比亚血平板，巧克力平板及麦康凯平板，35℃，5%CO2孵箱中培养24h，同时涂片镜检，镜检发现白细胞>25个/LP，鳞状上皮细胞>25个/LP，同时镜下可见少量革兰阴性杆菌，标本合格。24h后哥伦比亚血平板，巧克力平板及麦康凯平板均长出菌落，菌落较小、半透明、凸起，无溶血菌落，麦康凯平板上为不发酵葡萄糖。涂片为革兰氏染色阴性杆菌，氧化酶阳性，H2O2酶阳性，Bruker BioTyper 质谱仪（德国 Bruker 公司）鉴定为吉拉尔迪嗜铜菌（Cupriavidus gilardii），鉴定率为99.9%。Vitek 2 Compact 细菌自动鉴定仪配套 GN 鉴定卡无法鉴定，用GN335 药敏试验卡（法国梅里埃公司） 进行药敏实验，在35℃±2℃下孵育16-20小时，根据临床和实验室标准协会（CLSI）标准M100-S30提供的铜绿假单胞菌折点判断。细菌对各种抗菌剂的敏感性如下所示：对替卡西林/克拉维酸，哌拉西林/他唑巴坦，亚胺培南，美罗培南，妥布霉素，替加环素耐药，对头孢哌酮/舒巴坦，环丙沙星，左氧氟沙星敏感，对头孢他啶，阿米卡星，头孢吡肟，粘菌素中介。用PCR方法获得16S rDNA片段约1500bp，引物序列：27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT，经NCBI鉴定序列分析显示，与GenBank的Cupriavidus gilardii菌株AU2756的同源性为99.78%。
3 文献总结
共检索出近年来吉拉尔迪嗜铜菌病例文献 5篇，分别来源于咽拭子，血液，伤口分泌物，大便，导管，脓肿引流物等（Wauters等人，2001年;Karafin等人，2010年;Tena等人，2014年;Kobayashi等人，2016年;Zhen Zhang等人，2017年）。三名患者严重免疫功能受损，其中包括一名7岁女孩急性淋巴细胞白血病（Wauters等人，2001年），一名12岁儿童严重再生障碍性贫血（Karafin等人，2010年）和一名36岁男性肾移植术后肌肉脓肿（Tena，等人，2014年）。另外两名患者无明显免疫缺陷，但患者年龄较大，其中一名患者是90岁女性，由拉尔迪嗜铜菌引起的起搏器相关血流感染（Kobayashi等人，2016）。另一名患者是87岁男性，长期患有慢性阻塞性肺疾病，住院期间突发拉尔迪嗜铜菌血流感染。尽管目前尚不清楚吉拉尔迪嗜铜菌的真正致病性，但由于该生物体具有感染免疫缺陷患者和免疫能力强的人的能力，它发挥致病性的可能性不容忽视。
在美国 CLSI药敏试验指南中无明确的吉拉尔迪嗜铜菌药敏试验标准，参照铜绿假单胞菌药敏实验标准，可见多篇文献报道中，该菌对米诺环素，复方新诺明，左氧氟沙星，头孢呋辛，头孢曲松敏感，对庆大霉素、氨苄西林，美罗培南，氨曲南，妥布霉素等耐药，但对阿米卡星，亚胺培南，头孢他定，头孢吡肟，哌拉西林他唑巴坦，环丙沙星等药物结果不一致，即使在同一患者不同时期采样标本，头孢吡肟，哌拉西林他唑巴坦，环丙沙星，亚胺培南的结果也表现出变异性。Ruiz最近通过全基因组测序2，发现吉拉尔迪嗜铜菌的耐药性可能跟以下几方面有关：（i）多种多药外排泵机制，如铜绿假单胞菌MexAB-OprM泵的一个同系物，可能与美罗培南，其他β-内酰胺类和氨基糖苷类耐药有关;（ii）一个新的β-内酰胺酶（OXA-837）能降低对氨苄西林的敏感性，但对其他其他β-内酰胺类无效;（iii）一种新的氨基糖苷3-N-乙酰转移酶[AAC（3）-IVb，AacC10]，可降低对庆大霉素和妥布霉素的敏感性;以及（iv）一种新的部分保守的氨基糖苷3’’-腺苷酰转移酶降低对大观霉素和链霉素的敏感性，这也与我们综述文献的得到的药物敏感性结论一致。 4 讨论
可能由于该菌发现较晚，其生化反应与伯克霍尔德菌，假单胞菌，罗斯菌等菌属接近等因素有关，利用常规微生物鉴定方法难以区分，这是既往吉拉尔迪嗜铜菌感染报道少见的主要原因。本例中，VITEK细菌鉴定仪器无法鉴定，其他文献报道多数报道也是被误鉴定为产碱假单胞菌或鉴定仪提示为无法鉴定。随分子生物学技术逐渐成熟，16SrDNA 扩增测序技术和质谱仪的推广，近年来才有了资料较完整的临床病例报道。
吉拉尔迪嗜铜菌感染的有一部分为可疑为医院感染，这些患者住院期间有多种侵入性治疗，如本例的气管插管，文献1和文献2的静脉导管置入，文献3的膿肿引流，文献4的伤口清创，但可惜的是并未进行流行病学调查（医院设施、环境等），未能获得证据支持，文献5为社区发病患者，住院期间突发感染，感染源也不确定。
综上，吉拉尔迪嗜铜菌可能是一种重要的机会致病菌，可引起免疫力低下或老年人医院内感染和社区感染。近年来，越来越多的报告感染，其中一些是致命的，这些感染很难治疗，因为这种细菌天生对许多抗生素都有抗药性。现阶段常规鉴定方法鉴定为假单胞菌，但药敏结果表现为对庆大霉素、氨苄西林，美罗培南，氨曲南，妥布霉素耐药，对大多数头孢菌素等多数药物敏感时，应怀疑吉拉尔迪嗜铜菌感染，有条件者送去测序或者进行质谱鉴定。
参考文献：
[1].Wauters， G， Claeys， G， Verschraegen， G， De Baere， T， Vandecruys， E， Van Simaey， L， De Ganck， C， & Vaneechoutte， M（2001） Case of catheter sepsis with Ralstonia gilardii in a child with acute lymphoblastic leukemia. Journal of clinical microbiology， 39， 4583-4584.
[2].Ruiz C， McCarley A， Espejo ML， Cooper KK， Harmon DE. Comparative Genomics Reveals a Well-Conserved Intrinsic Resistome in the Emerging Multidrug-Resistant Pathogen Cupriavidus gilardii. mSphere. 2019;4（5）：e00631-19. Published 2019 Oct 2. doi：10.1128/mSphere.00631-19
关键词：吉拉尔迪嗜铜菌，痰液，药敏试验，儿童
【中图分类号】R720.5 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2020）06-291-02
吉拉尔迪嗜铜菌的生物致病性尚不清楚，引起人类感染的频率较低，但临床已经从脑脊液，血液，疖，伤口，咽拭子，大便，导管，脓肿引流物中分离出来[1]。本例中，我们在临床上从 1 例儿童患者痰液中分离出一株吉拉尔迪嗜铜菌，现报道如下并对相关文献进行复习。
1 病例报道
患者女，2岁10月，既往有癫痫病史，KCNQ2基因杂合变异（与癫痫性脑病有关）。此次由于反复发热5天，最高39.6℃，伴咳嗽，痰难排出就诊于急诊科，5天前于当地医院查白细胞2.74×109 /L，中性粒细胞94%，HB：86g/L， PLT：29×109 /L，CRP：26.4 mg/dl，PCT：22.58 ng/ml，胸片显示双肺肺炎，遂予阿奇霉素，头孢哌酮舒巴坦钠抗感染，治疗期间患者血常规三系降低，不排除血液系统疾病，于我院急诊就诊。入院后查白细胞2.9×109 /L，中性粒细胞61%，HB：74g/L， PLT：22×109 /L，CRP：11.65 mg/dl，PCT：13.24 ng/ml。體格检查，体温 38. 4 ℃，全身皮肤苍白，双肺呼吸音粗，可闻及干啰音，以1：全血细胞减少，待查 2：支气管肺炎 3：癫痫 4：发育指标延迟 5：蛋白质-能量营养不良收入院。入院后予完善呼吸道病原检查，肺炎支原体，肺炎衣原体，腺病毒，呼吸道合胞病毒，肠道病毒，甲型流感病毒，乙型流感病毒，副流感病毒，Q热立克次体，嗜肺军团菌均阴性，胸部X片：双肺炎症，胸部CT：1：双侧肺炎，2：双侧胸腔少量积液。入院后予亚胺培南抗感染，止咳化痰，雾化等治疗。后予复查呼吸道病原检查：腺病毒，流感病毒，人博卡病毒，人偏肺病毒，鼻病毒阴性，EB病毒抗体检查阳性，EB病毒DNA检查阴性，患者病情较重，转入PICU后予气管插管术，中心静脉置管术，患者痰液较多，难以排出，予气管插管后吸痰送培养，检出纯培养菌落吉拉尔迪嗜铜菌。先后予亚胺培南，美罗培南，万古霉素，头孢哌酮舒巴坦抗感染治疗，患者出院时无发热，无咳嗽，咳痰，白细胞5.8×109 /L，中性粒细胞47%，HB：85g/L， PLT：458×109 /L，CRP：1.5mg/dl，胸片显示双肺渗出灶较前减少。
2 微生物鉴定与药敏
患者因痰较难排出，入住PICU予气管插管后吸痰送培养，按照标准操作流程接种于哥伦比亚血平板，巧克力平板及麦康凯平板，35℃，5%CO2孵箱中培养24h，同时涂片镜检，镜检发现白细胞>25个/LP，鳞状上皮细胞>25个/LP，同时镜下可见少量革兰阴性杆菌，标本合格。24h后哥伦比亚血平板，巧克力平板及麦康凯平板均长出菌落，菌落较小、半透明、凸起，无溶血菌落，麦康凯平板上为不发酵葡萄糖。涂片为革兰氏染色阴性杆菌，氧化酶阳性，H2O2酶阳性，Bruker BioTyper 质谱仪（德国 Bruker 公司）鉴定为吉拉尔迪嗜铜菌（Cupriavidus gilardii），鉴定率为99.9%。Vitek 2 Compact 细菌自动鉴定仪配套 GN 鉴定卡无法鉴定，用GN335 药敏试验卡（法国梅里埃公司） 进行药敏实验，在35℃±2℃下孵育16-20小时，根据临床和实验室标准协会（CLSI）标准M100-S30提供的铜绿假单胞菌折点判断。细菌对各种抗菌剂的敏感性如下所示：对替卡西林/克拉维酸，哌拉西林/他唑巴坦，亚胺培南，美罗培南，妥布霉素，替加环素耐药，对头孢哌酮/舒巴坦，环丙沙星，左氧氟沙星敏感，对头孢他啶，阿米卡星，头孢吡肟，粘菌素中介。用PCR方法获得16S rDNA片段约1500bp，引物序列：27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT，经NCBI鉴定序列分析显示，与GenBank的Cupriavidus gilardii菌株AU2756的同源性为99.78%。
3 文献总结
共检索出近年来吉拉尔迪嗜铜菌病例文献 5篇，分别来源于咽拭子，血液，伤口分泌物，大便，导管，脓肿引流物等（Wauters等人，2001年;Karafin等人，2010年;Tena等人，2014年;Kobayashi等人，2016年;Zhen Zhang等人，2017年）。三名患者严重免疫功能受损，其中包括一名7岁女孩急性淋巴细胞白血病（Wauters等人，2001年），一名12岁儿童严重再生障碍性贫血（Karafin等人，2010年）和一名36岁男性肾移植术后肌肉脓肿（Tena，等人，2014年）。另外两名患者无明显免疫缺陷，但患者年龄较大，其中一名患者是90岁女性，由拉尔迪嗜铜菌引起的起搏器相关血流感染（Kobayashi等人，2016）。另一名患者是87岁男性，长期患有慢性阻塞性肺疾病，住院期间突发拉尔迪嗜铜菌血流感染。尽管目前尚不清楚吉拉尔迪嗜铜菌的真正致病性，但由于该生物体具有感染免疫缺陷患者和免疫能力强的人的能力，它发挥致病性的可能性不容忽视。
在美国 CLSI药敏试验指南中无明确的吉拉尔迪嗜铜菌药敏试验标准，参照铜绿假单胞菌药敏实验标准，可见多篇文献报道中，该菌对米诺环素，复方新诺明，左氧氟沙星，头孢呋辛，头孢曲松敏感，对庆大霉素、氨苄西林，美罗培南，氨曲南，妥布霉素等耐药，但对阿米卡星，亚胺培南，头孢他定，头孢吡肟，哌拉西林他唑巴坦，环丙沙星等药物结果不一致，即使在同一患者不同时期采样标本，头孢吡肟，哌拉西林他唑巴坦，环丙沙星，亚胺培南的结果也表现出变异性。Ruiz最近通过全基因组测序2，发现吉拉尔迪嗜铜菌的耐药性可能跟以下几方面有关：（i）多种多药外排泵机制，如铜绿假单胞菌MexAB-OprM泵的一个同系物，可能与美罗培南，其他β-内酰胺类和氨基糖苷类耐药有关;（ii）一个新的β-内酰胺酶（OXA-837）能降低对氨苄西林的敏感性，但对其他其他β-内酰胺类无效;（iii）一种新的氨基糖苷3-N-乙酰转移酶[AAC（3）-IVb，AacC10]，可降低对庆大霉素和妥布霉素的敏感性;以及（iv）一种新的部分保守的氨基糖苷3’’-腺苷酰转移酶降低对大观霉素和链霉素的敏感性，这也与我们综述文献的得到的药物敏感性结论一致。 4 讨论
可能由于该菌发现较晚，其生化反应与伯克霍尔德菌，假单胞菌，罗斯菌等菌属接近等因素有关，利用常规微生物鉴定方法难以区分，这是既往吉拉尔迪嗜铜菌感染报道少见的主要原因。本例中，VITEK细菌鉴定仪器无法鉴定，其他文献报道多数报道也是被误鉴定为产碱假单胞菌或鉴定仪提示为无法鉴定。随分子生物学技术逐渐成熟，16SrDNA 扩增测序技术和质谱仪的推广，近年来才有了资料较完整的临床病例报道。
吉拉尔迪嗜铜菌感染的有一部分为可疑为医院感染，这些患者住院期间有多种侵入性治疗，如本例的气管插管，文献1和文献2的静脉导管置入，文献3的膿肿引流，文献4的伤口清创，但可惜的是并未进行流行病学调查（医院设施、环境等），未能获得证据支持，文献5为社区发病患者，住院期间突发感染，感染源也不确定。
综上，吉拉尔迪嗜铜菌可能是一种重要的机会致病菌，可引起免疫力低下或老年人医院内感染和社区感染。近年来，越来越多的报告感染，其中一些是致命的，这些感染很难治疗，因为这种细菌天生对许多抗生素都有抗药性。现阶段常规鉴定方法鉴定为假单胞菌，但药敏结果表现为对庆大霉素、氨苄西林，美罗培南，氨曲南，妥布霉素耐药，对大多数头孢菌素等多数药物敏感时，应怀疑吉拉尔迪嗜铜菌感染，有条件者送去测序或者进行质谱鉴定。
参考文献：
[1].Wauters， G， Claeys， G， Verschraegen， G， De Baere， T， Vandecruys， E， Van Simaey， L， De Ganck， C， & Vaneechoutte， M（2001） Case of catheter sepsis with Ralstonia gilardii in a child with acute lymphoblastic leukemia. Journal of clinical microbiology， 39， 4583-4584.
[2].Ruiz C， McCarley A， Espejo ML， Cooper KK， Harmon DE. Comparative Genomics Reveals a Well-Conserved Intrinsic Resistome in the Emerging Multidrug-Resistant Pathogen Cupriavidus gilardii. mSphere. 2019;4（5）：e00631-19. Published 2019 Oct 2. doi：10.1128/mSphere.00631-19