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摘要 [目的]分离并鉴定菜豆花中的1株内生优势细菌（WBF1）。[方法]从菜豆花中分离出1株内生优势细菌WBF通过革兰氏染色、16S rDNA及生理生化实验对其进行鉴定。[结果]革兰氏染色结果显示该菌为革兰氏阴性杆菌，16S rDNA序列分析显示其为变形杆菌科不动杆菌属假单胞杆菌；其生理生化特征符合假单胞杆菌特性；该菌定植于菜豆花中，生长温度为20～43℃。[结论]该菌是菜豆基因工程生防菌宿主菌的良好候选菌株。
关键词 菜豆；内生菌；染色；序列分析
中图分类号 S182文献标识码 A文章编号 0517-6611（2016）26-0020-0
The Isolation of an Endogenous Pseudomonas sp. from the Bean and Identification
Abstract [Objective]To isolate and identify an endogenous do minant （WBF1） from the bean flower. [Method]An endogenous dominant （WBF1） isolated from the bean flower was identified by gram staining， 16S rDNA and physiological and biochemical test. [Result]The gram staining result showed it was gram negative bacillus， and the 16S rDNA sequence analysis showed it belonged to Pseudomonas sp.， Acinetobacter， Proteus. The physiological and biochemical characters corresponded with that of Pseudomonas sp. The bacterium grew in bean flower， and growth temperature was between 20 and 43℃. [Conclusion]The bacterium was an ideal candidate to be the engineered biocontrol host for the bean.
Key words Bean； Endogenous bacteria； Staining； Sequence analysis
菜豆，又称四季豆、芸豆，其嫩荚是国人喜爱的蔬菜品种。菜豆在美洲已有几千年的栽培史，是当地印第安人的主要蔬菜和粮食作物，大概在16世纪末传入中国，并逐渐形成了一些有中国特色的栽培种和品种[1]。 菜豆开花期至收采期常见的病害有炭疽和锈病，虫害有蚜虫和豆螟，目前对于这些病虫害没有有效的防治方法，传统农药仍然是防治菜豆花期病虫害的主要手段。”治花不治荚”是所有豆科植物预防病虫害的原则，菜豆防治的重点也在于花期的虫害控制。
植物内生菌是指可以定殖于健康植物组织中，而对植物特征及功能均无影响的微生物。内生菌与植物在长期“协同进化”过程中形成了“互利互惠”的关系，内生菌从宿主植物中获得稳定的养分和生长环境[2-3]，不易受外界条件影响[4-5]。同时，内生菌的次级代谢产物常常帮助宿主抵御虫害及外来微生物的侵害[6-7]。因此，内生菌是基因工程生防菌非常理想的宿主菌，也是近年来农业微生物研究的新热点。但菜豆中内生菌的研究报道在国内外仍处于空白。
鉴于此，笔者从菜豆花中分离出1株内生假单胞杆菌（WBF1），并对该菌进行了鉴定，旨在为利用基因工程生防菌控制菜豆花期病虫害提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 从菜豆花中分离出的1株内生优势细菌WBF1。
1.2 方法
1.2.1 内生菌的分离。
菜豆花表面清净后，采用0.1%HgCl2、75%乙醇消毒处理，然后无菌研磨，离心，取上清涂布NA培养基，于25℃恒温培养箱中倒置培养48 h，平板得到的单菌落划线纯化并保种。
1.2.2 形态鉴定。菌株活化到对数生长期后，进行革兰氏染色，油镜观察。
1.2.3 细菌16S rDNA扩增。
提取细菌基因组，采用16S rDNA通用引物，引物序列为1492R，5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT -3′和27F，5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′。PCR反应参数为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共30个循环；最后72 ℃ 15 min。
1.2.4 序列分析。
应用Blastn程序在核酸序列数据库GenBank中搜索与测序结果相似的序列，并应用软件Mega 5.0进行分析，得到该菌种属情况。
1.2.5 生长温度范围考察。菌落涂布LB固体平板，置于不同温度培养箱中培养，观察并记录菌落生长情况。
1.2.6 生理生化实验。
菌落过夜活化，对数生长期的菌体进行糖发酵实验、H2S产生实验、V.P实验、吲哚实验、柠檬酸盐利用实验、淀粉水解实验和油脂水解实验。
2 结果与分析
2.1 革兰氏染色
分离到的内生菌菌体在油镜下为革兰氏阴性短杆状菌（图1）。
2.2 16S rDNA测序结果
Mega软件分析结果显示，分离的内生菌16S rDNA序列与不动杆菌属中的变形杆菌纲假 单胞菌目菌的序列相似度达99%，因此，该内生菌属于假单胞杆菌目，变形杆菌纲，不动杆菌属。
2.3 生理生化实验结果 分离得到的内生假单胞菌，其糖发酵、V.P、柠檬酸和油脂分解实验结果为阳性，淀粉水解、H2S产生、吲哚实验结果为阴性。
2.4 菌落生长温度范围 菌体在温度20～43 ℃生长情况良好。
3 结论与讨论
该研究分离得到1株菜豆花的内生假单胞杆菌，该菌可以在菜豆花中定殖，在各期花中属于优势菌株，但在菜豆其他部位未分离到。该内生菌的生长温度为20～43 ℃，与菜豆开花结荚的温度吻合。16S rDNA序列显示，该内生菌为假单胞菌目，变形杆菌纲，不动杆菌属。该菌生理生化特征符合假单胞杆菌的特性。研究报道，假单胞菌可以通过产生抗生物质使植物抵御病害，并且其次级代谢产物可促进植物吸收和生长[8]；同时假单胞菌具有帮助植物抗磷、耐镉等对抗重金属的特性[9]，是植物益生菌及抗虫害菌的理想菌株。因此，通过基因工程的方法转入杀虫的基因，并利用该菌可以在菜豆花中特异性地定殖和繁殖，其生长繁殖对植株生长无不良影响的特点，使其有望成为菜豆基因工程生防菌宿主菌的理想候选菌株。
参考文献
[1]张箭.菜豆：四季豆发展传播史研究[J].农业考古，2014（4）：218-229.
[2]BABALOLA O O.Beneficial bacteria of agricultural importance[J].Biotechnol Lett，2010，32（11）：1559-1570.
[3]SOLTER L F，MADDOX J V，VOSSBRINCK C R.Physiological host specificity： A model using the European corn borer， Ostrinia nubilalis （Hübner） （Lepidoptera： Crambidae） and microsporidia of row crop and other stalk-boring hosts[J].J Invertebr Pathol，2005，90（2）：127-130.
[4]杨威，刘苏闵，郭坚华.细菌定殖能力与其生物防治功能相关性研究进展[J].中国生物防治，2010，26（S1）：90-94.
[5]徐玲玲，单庆红，郭斌.植物内生菌研究进展及应用展望[J].安徽农业科学，2013，41（13）：5641-5643，5709.
[6]刘峰，蒋宇扬，刘世英，等.植物内生菌抗虫工程研究进展[J].生物技术通讯，2004，15（4）：417-419.
[7]陈泽斌，靳松，张永福，等.植物内生菌生物防治研究进展及存在的问题[J].昆明学院学报，2014，36（3）：40-42.
[8]汪来发，邱德勋.假单胞杆菌防治植物病害的研究进展[J].陕西林业科技，1997，68（4）：60-668.
[9]陈雪姣，郭雪玲，南昊，等.一株耐镉假单胞杆菌的分离鉴定及其对镉的吸附研究[J].湖北农业科学，2016，55（8）：2765-2768，2773.
关键词 菜豆；内生菌；染色；序列分析
中图分类号 S182文献标识码 A文章编号 0517-6611（2016）26-0020-0
The Isolation of an Endogenous Pseudomonas sp. from the Bean and Identification
Abstract [Objective]To isolate and identify an endogenous do minant （WBF1） from the bean flower. [Method]An endogenous dominant （WBF1） isolated from the bean flower was identified by gram staining， 16S rDNA and physiological and biochemical test. [Result]The gram staining result showed it was gram negative bacillus， and the 16S rDNA sequence analysis showed it belonged to Pseudomonas sp.， Acinetobacter， Proteus. The physiological and biochemical characters corresponded with that of Pseudomonas sp. The bacterium grew in bean flower， and growth temperature was between 20 and 43℃. [Conclusion]The bacterium was an ideal candidate to be the engineered biocontrol host for the bean.
Key words Bean； Endogenous bacteria； Staining； Sequence analysis
菜豆，又称四季豆、芸豆，其嫩荚是国人喜爱的蔬菜品种。菜豆在美洲已有几千年的栽培史，是当地印第安人的主要蔬菜和粮食作物，大概在16世纪末传入中国，并逐渐形成了一些有中国特色的栽培种和品种[1]。 菜豆开花期至收采期常见的病害有炭疽和锈病，虫害有蚜虫和豆螟，目前对于这些病虫害没有有效的防治方法，传统农药仍然是防治菜豆花期病虫害的主要手段。”治花不治荚”是所有豆科植物预防病虫害的原则，菜豆防治的重点也在于花期的虫害控制。
植物内生菌是指可以定殖于健康植物组织中，而对植物特征及功能均无影响的微生物。内生菌与植物在长期“协同进化”过程中形成了“互利互惠”的关系，内生菌从宿主植物中获得稳定的养分和生长环境[2-3]，不易受外界条件影响[4-5]。同时，内生菌的次级代谢产物常常帮助宿主抵御虫害及外来微生物的侵害[6-7]。因此，内生菌是基因工程生防菌非常理想的宿主菌，也是近年来农业微生物研究的新热点。但菜豆中内生菌的研究报道在国内外仍处于空白。
鉴于此，笔者从菜豆花中分离出1株内生假单胞杆菌（WBF1），并对该菌进行了鉴定，旨在为利用基因工程生防菌控制菜豆花期病虫害提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 从菜豆花中分离出的1株内生优势细菌WBF1。
1.2 方法
1.2.1 内生菌的分离。
菜豆花表面清净后，采用0.1%HgCl2、75%乙醇消毒处理，然后无菌研磨，离心，取上清涂布NA培养基，于25℃恒温培养箱中倒置培养48 h，平板得到的单菌落划线纯化并保种。
1.2.2 形态鉴定。菌株活化到对数生长期后，进行革兰氏染色，油镜观察。
1.2.3 细菌16S rDNA扩增。
提取细菌基因组，采用16S rDNA通用引物，引物序列为1492R，5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT -3′和27F，5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′。PCR反应参数为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共30个循环；最后72 ℃ 15 min。
1.2.4 序列分析。
应用Blastn程序在核酸序列数据库GenBank中搜索与测序结果相似的序列，并应用软件Mega 5.0进行分析，得到该菌种属情况。
1.2.5 生长温度范围考察。菌落涂布LB固体平板，置于不同温度培养箱中培养，观察并记录菌落生长情况。
1.2.6 生理生化实验。
菌落过夜活化，对数生长期的菌体进行糖发酵实验、H2S产生实验、V.P实验、吲哚实验、柠檬酸盐利用实验、淀粉水解实验和油脂水解实验。
2 结果与分析
2.1 革兰氏染色
分离到的内生菌菌体在油镜下为革兰氏阴性短杆状菌（图1）。
2.2 16S rDNA测序结果
Mega软件分析结果显示，分离的内生菌16S rDNA序列与不动杆菌属中的变形杆菌纲假 单胞菌目菌的序列相似度达99%，因此，该内生菌属于假单胞杆菌目，变形杆菌纲，不动杆菌属。
2.3 生理生化实验结果 分离得到的内生假单胞菌，其糖发酵、V.P、柠檬酸和油脂分解实验结果为阳性，淀粉水解、H2S产生、吲哚实验结果为阴性。
2.4 菌落生长温度范围 菌体在温度20～43 ℃生长情况良好。
3 结论与讨论
该研究分离得到1株菜豆花的内生假单胞杆菌，该菌可以在菜豆花中定殖，在各期花中属于优势菌株，但在菜豆其他部位未分离到。该内生菌的生长温度为20～43 ℃，与菜豆开花结荚的温度吻合。16S rDNA序列显示，该内生菌为假单胞菌目，变形杆菌纲，不动杆菌属。该菌生理生化特征符合假单胞杆菌的特性。研究报道，假单胞菌可以通过产生抗生物质使植物抵御病害，并且其次级代谢产物可促进植物吸收和生长[8]；同时假单胞菌具有帮助植物抗磷、耐镉等对抗重金属的特性[9]，是植物益生菌及抗虫害菌的理想菌株。因此，通过基因工程的方法转入杀虫的基因，并利用该菌可以在菜豆花中特异性地定殖和繁殖，其生长繁殖对植株生长无不良影响的特点，使其有望成为菜豆基因工程生防菌宿主菌的理想候选菌株。
参考文献
[1]张箭.菜豆：四季豆发展传播史研究[J].农业考古，2014（4）：218-229.
[2]BABALOLA O O.Beneficial bacteria of agricultural importance[J].Biotechnol Lett，2010，32（11）：1559-1570.
[3]SOLTER L F，MADDOX J V，VOSSBRINCK C R.Physiological host specificity： A model using the European corn borer， Ostrinia nubilalis （Hübner） （Lepidoptera： Crambidae） and microsporidia of row crop and other stalk-boring hosts[J].J Invertebr Pathol，2005，90（2）：127-130.
[4]杨威，刘苏闵，郭坚华.细菌定殖能力与其生物防治功能相关性研究进展[J].中国生物防治，2010，26（S1）：90-94.
[5]徐玲玲，单庆红，郭斌.植物内生菌研究进展及应用展望[J].安徽农业科学，2013，41（13）：5641-5643，5709.
[6]刘峰，蒋宇扬，刘世英，等.植物内生菌抗虫工程研究进展[J].生物技术通讯，2004，15（4）：417-419.
[7]陈泽斌，靳松，张永福，等.植物内生菌生物防治研究进展及存在的问题[J].昆明学院学报，2014，36（3）：40-42.
[8]汪来发，邱德勋.假单胞杆菌防治植物病害的研究进展[J].陕西林业科技，1997，68（4）：60-668.
[9]陈雪姣，郭雪玲，南昊，等.一株耐镉假单胞杆菌的分离鉴定及其对镉的吸附研究[J].湖北农业科学，2016，55（8）：2765-2768，2773.