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摘要：目的：建立测定一种朝医方保健食品中淫羊藿苷含量的高效液相色谱方法。方法：采用 Kromasil C18柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为乙腈—水（30：70），流速1ml·min-1，检测波长为270nm，柱温30℃，保留时间15min。结果：淫羊藿苷在0.5-2.5μg范围内，淫羊藿苷进样量与峰面积呈良好的线性关系（r=0.9999）。平均加样回收率为98.72%，RSD为0.27%。结论：该方法简便快速，重复性好，结果准确。
关键词：淫羊藿苷；高效液相色谱；保健食品；朝医
Determination of Icariin in One Kind Of Korean Medical
Prescription Health Food by HPLC
ZHU le，WANG xue，XU ling-shan，WANG dong-xue，AO yu-tao，GUO jian-peng﹡
（College of Pharmacy， Yanbian University，Yanji 133000， China）
[Abstract] Objective： To establish a method for HPLC determination of icariin in one kind of Korean medical prescription health food.Method： The separation was preformed on a Kromasil C18 column with acetonitrile- water on 270 nm at 1. 0 ml·min-1.Result： The standard curve was liner in the range of 0.5-2.5μg and the correlation coefficient was 0.9999. The coverage recovery was 98.72% with RSD 0.27% .Conclusion： The method is simple，separating result，acuracy and reproducibility，can be used for the quality control of one kind of Korean medical prescription health food.
Key words： Icariin；HPLC；Health food；Korean medicine
淫羊藿具有调节雄性发育、调节免疫、抑制肿瘤、改善心血管系统功能、缓解妇女更年期症状、抗氧化、抗衰老等多种生理活性等功效[1-4]，主要含有黄酮类和多糖，此外还含有生物碱、木脂素类、蒽醌类、萜类化合物、必需脂肪酸、微量元素等营养成分或生物活性成分[5]，其中淫羊藿苷是缓解体力疲劳成分之一[6]。目前未见测定保健食品中淫羊藿苷的HPLC方法学研究。本文采用HPLC法对一种具有缓解体力疲劳功能的朝医方保健食品中的淫羊藿苷进行测定， 为该保健食品的质量控制提供了评价方法。
1、仪器与试药
岛津SCL-10AtVP液相色谱系统（Class-vP 色谱工作站） ；FA2004电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；淫羊藿苷对照品（（中国药品生物制品检定所， 批号：489327-120613，纯度>98%） ；淫羊藿（由同仁堂提供，经延边大学药学院刘永镇教授鉴定为淫羊藿 Epimedium brevicornu Maxim）；一种朝医方保健食品由吉林省中医药管理局中药药剂学实验室（延边大学）制备（批号：20140303、20140304、20140305）；乙睛、甲醇为色谱纯；水为重蒸馏水；其他试剂均为分析纯。
2、方法与结果
2.1 溶液配制
2.1.1 对照品溶液 精密称取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇配制成0.1mg·ml-1的溶液，即得。
2.1.2 供试品溶液 取样品研细成粉末，精密称定3g，置于具塞锥形瓶中，超声处理1h，置20ml容量瓶中定容，摇匀，滤过，即得。
2.1.3 阴性对照品溶液 取不含淫羊藿的样品3 g，同供试品制备方法制备。
2.2检测波长的选择[7] 精密称取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇制成每1 ml 含0. 2 mg 的溶液，依照紫外-可见分光光度法，在波长200～600 nm 进行紫外扫描。结果在270 nm 波长处有最大吸收。因此，确定检测波长为270 nm。
2.3 色谱条件及系统适应性[8] 色谱柱为依特利Kromasil 100-5PHENYL（4.6mm×250mm，5μm），流动相为乙腈-水（30：70），流速为1ml·min-1；检测波长为270nm，柱温30℃，进样量：10 μL。在本色谱条件下淫羊藿苷的保留时间为10.07min，理论板数不低于1500，对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液色谱图见图1。
2.4线性关系的考察 精密量取对照品溶液5，10，15，20，25μl，注入色谱柱，测定峰面积，以峰面积（Y）对进样量（X）进行回归，得回归方程为Y=2.3E+6X-25753，r = 1.0000（n=5），结果表明，在0.5-2.5μg范围内，淫羊藿苷进样量与峰面积呈良好的线性关系。
2.5精密度考察 精密吸取上述淫羊藿苷对照品，每次进样10μl，重复进样5次，测定RSD为1.45%，结果表明仪器精密度良好。
2.6稳定性考察 精密吸取同一批供试品溶液，分别于0，2，4，8，12h，每次进样10μl，测定，RSD为2.03%，结果表明供试品溶液在12h小时内稳定。 2.7重现性考察 精密度称取同一批样品5份，按供试品溶液项下制备，每次进样10μl，测定，RSD为1.91%，表明重现性良好。
2.8加样回收率考察 精密称取已知含量的样品溶液高、中、低3份，分别精密加入对照品适量，按供试品溶液项下制备，每次进样量10μl，测定，计算回收率，结果见表1。
2.9样品含量测定 按上述测定方法对3批样品进行测定，以外标法计算，结果见表2。
3 讨论
3.1 样品前处理条件的选择 为充分提取样品的目标成分，分别考察了水、40%乙醇、75%乙醇和无水乙醇溶液为溶剂，采用超声、浸渍、加热回流3种提取方法。结果表明，以75%乙醇为溶剂采用超声法提取率最高。在此基础上，又对提取溶剂用量、提取时间和提取次数分别进行了考察，结果表明，总溶剂用量为样品量7倍，提取1次，每次1h便可将目标成分基本提取完全，再增加提取溶剂用量和提取次数，目标成分增加量不明显，并且消耗的时间、资源比较多，没有实际应用价值。
3.2 流动相与流速的选择 在实验过程中，比较了乙腈-水（30 ： 70）、甲醇-水-冰乙酸（54∶46∶1） 以及甲醇-1. 5%冰乙酸（55∶45）的分离效果，结果以乙腈-水（30∶70）的分离效果最好。流速为1.2 ml·min-1时，目标成分保留时间较早且不能良好分离，在流速为1ml·min-1时目标成分分离效果良好，因此确定流速为1 ml·min-1。
参考文献：
[1] MENG F H， LI Y B， XIONG Z L， et al. Osteoblastic proliferative activity of Epimediumbrevicornum Maxim[J]. Phytomedicine， 2005，12： 189-193.
[2] CHEN KK， CHIU J H. Effect of Epimedium brevicornum Maximextract on elicitation of penile erection in the rat[J]. Urology， 2006， 67： 631-635.
[3] PAN Ying，KONG Lingdong， LIYucheng， et al. Icariin from Epimedium brevicornum attenuates chronic mild stress-induced behavioral and neuroendocrinological alterations in male Wistar rats[J]. Pharmacol Biochem Behav， 2007， 87： 130-140.
[4] LU Yu， WANG Deyun， HU Yuanliang， et al. Sulfated modification of Epimedium polysaccharide and effects of the modifiers on cellular infectivity of IBDV[J]. Carbohydr Polym， 2008， 71： 180-186.
[5] 付亮，袁璟亚，周永红.淫羊藿多糖的研究进展及开发前景[J].食品科学， 2012，33，（3）：261-263
[6] 纵艳芳，焦贤春，尚茂林.淫羊藿苷抗大鼠运动性疲劳的实验研究[J].吉林体育学院学报，2010，26 （2）：90-93.
[7] 郭佳超， 陆蕊杭， 苑雅萍.HPLC测定壮阳祛风颗粒中淫羊藿苷的含量[J] .中国实验方剂学杂志.2011.17（3）：111-112.
[8] 王艳艳， 刘长河.HPLC法测定补肾助孕胶囊中淫羊蕾普的含量[J] .中国医药指南.2012.7 （10）21：435-437.
作者简介：朱乐（1989-）女（满），硕士研究生，主要从事中药新剂型与新技术研究.
*通讯作者：郭建鹏（1971-）男（汉），教授，从事中药新剂型与新技术研究.
关键词：淫羊藿苷；高效液相色谱；保健食品；朝医
Determination of Icariin in One Kind Of Korean Medical
Prescription Health Food by HPLC
ZHU le，WANG xue，XU ling-shan，WANG dong-xue，AO yu-tao，GUO jian-peng﹡
（College of Pharmacy， Yanbian University，Yanji 133000， China）
[Abstract] Objective： To establish a method for HPLC determination of icariin in one kind of Korean medical prescription health food.Method： The separation was preformed on a Kromasil C18 column with acetonitrile- water on 270 nm at 1. 0 ml·min-1.Result： The standard curve was liner in the range of 0.5-2.5μg and the correlation coefficient was 0.9999. The coverage recovery was 98.72% with RSD 0.27% .Conclusion： The method is simple，separating result，acuracy and reproducibility，can be used for the quality control of one kind of Korean medical prescription health food.
Key words： Icariin；HPLC；Health food；Korean medicine
淫羊藿具有调节雄性发育、调节免疫、抑制肿瘤、改善心血管系统功能、缓解妇女更年期症状、抗氧化、抗衰老等多种生理活性等功效[1-4]，主要含有黄酮类和多糖，此外还含有生物碱、木脂素类、蒽醌类、萜类化合物、必需脂肪酸、微量元素等营养成分或生物活性成分[5]，其中淫羊藿苷是缓解体力疲劳成分之一[6]。目前未见测定保健食品中淫羊藿苷的HPLC方法学研究。本文采用HPLC法对一种具有缓解体力疲劳功能的朝医方保健食品中的淫羊藿苷进行测定， 为该保健食品的质量控制提供了评价方法。
1、仪器与试药
岛津SCL-10AtVP液相色谱系统（Class-vP 色谱工作站） ；FA2004电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；淫羊藿苷对照品（（中国药品生物制品检定所， 批号：489327-120613，纯度>98%） ；淫羊藿（由同仁堂提供，经延边大学药学院刘永镇教授鉴定为淫羊藿 Epimedium brevicornu Maxim）；一种朝医方保健食品由吉林省中医药管理局中药药剂学实验室（延边大学）制备（批号：20140303、20140304、20140305）；乙睛、甲醇为色谱纯；水为重蒸馏水；其他试剂均为分析纯。
2、方法与结果
2.1 溶液配制
2.1.1 对照品溶液 精密称取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇配制成0.1mg·ml-1的溶液，即得。
2.1.2 供试品溶液 取样品研细成粉末，精密称定3g，置于具塞锥形瓶中，超声处理1h，置20ml容量瓶中定容，摇匀，滤过，即得。
2.1.3 阴性对照品溶液 取不含淫羊藿的样品3 g，同供试品制备方法制备。
2.2检测波长的选择[7] 精密称取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇制成每1 ml 含0. 2 mg 的溶液，依照紫外-可见分光光度法，在波长200～600 nm 进行紫外扫描。结果在270 nm 波长处有最大吸收。因此，确定检测波长为270 nm。
2.3 色谱条件及系统适应性[8] 色谱柱为依特利Kromasil 100-5PHENYL（4.6mm×250mm，5μm），流动相为乙腈-水（30：70），流速为1ml·min-1；检测波长为270nm，柱温30℃，进样量：10 μL。在本色谱条件下淫羊藿苷的保留时间为10.07min，理论板数不低于1500，对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液色谱图见图1。
2.4线性关系的考察 精密量取对照品溶液5，10，15，20，25μl，注入色谱柱，测定峰面积，以峰面积（Y）对进样量（X）进行回归，得回归方程为Y=2.3E+6X-25753，r = 1.0000（n=5），结果表明，在0.5-2.5μg范围内，淫羊藿苷进样量与峰面积呈良好的线性关系。
2.5精密度考察 精密吸取上述淫羊藿苷对照品，每次进样10μl，重复进样5次，测定RSD为1.45%，结果表明仪器精密度良好。
2.6稳定性考察 精密吸取同一批供试品溶液，分别于0，2，4，8，12h，每次进样10μl，测定，RSD为2.03%，结果表明供试品溶液在12h小时内稳定。 2.7重现性考察 精密度称取同一批样品5份，按供试品溶液项下制备，每次进样10μl，测定，RSD为1.91%，表明重现性良好。
2.8加样回收率考察 精密称取已知含量的样品溶液高、中、低3份，分别精密加入对照品适量，按供试品溶液项下制备，每次进样量10μl，测定，计算回收率，结果见表1。
2.9样品含量测定 按上述测定方法对3批样品进行测定，以外标法计算，结果见表2。
3 讨论
3.1 样品前处理条件的选择 为充分提取样品的目标成分，分别考察了水、40%乙醇、75%乙醇和无水乙醇溶液为溶剂，采用超声、浸渍、加热回流3种提取方法。结果表明，以75%乙醇为溶剂采用超声法提取率最高。在此基础上，又对提取溶剂用量、提取时间和提取次数分别进行了考察，结果表明，总溶剂用量为样品量7倍，提取1次，每次1h便可将目标成分基本提取完全，再增加提取溶剂用量和提取次数，目标成分增加量不明显，并且消耗的时间、资源比较多，没有实际应用价值。
3.2 流动相与流速的选择 在实验过程中，比较了乙腈-水（30 ： 70）、甲醇-水-冰乙酸（54∶46∶1） 以及甲醇-1. 5%冰乙酸（55∶45）的分离效果，结果以乙腈-水（30∶70）的分离效果最好。流速为1.2 ml·min-1时，目标成分保留时间较早且不能良好分离，在流速为1ml·min-1时目标成分分离效果良好，因此确定流速为1 ml·min-1。
参考文献：
[1] MENG F H， LI Y B， XIONG Z L， et al. Osteoblastic proliferative activity of Epimediumbrevicornum Maxim[J]. Phytomedicine， 2005，12： 189-193.
[2] CHEN KK， CHIU J H. Effect of Epimedium brevicornum Maximextract on elicitation of penile erection in the rat[J]. Urology， 2006， 67： 631-635.
[3] PAN Ying，KONG Lingdong， LIYucheng， et al. Icariin from Epimedium brevicornum attenuates chronic mild stress-induced behavioral and neuroendocrinological alterations in male Wistar rats[J]. Pharmacol Biochem Behav， 2007， 87： 130-140.
[4] LU Yu， WANG Deyun， HU Yuanliang， et al. Sulfated modification of Epimedium polysaccharide and effects of the modifiers on cellular infectivity of IBDV[J]. Carbohydr Polym， 2008， 71： 180-186.
[5] 付亮，袁璟亚，周永红.淫羊藿多糖的研究进展及开发前景[J].食品科学， 2012，33，（3）：261-263
[6] 纵艳芳，焦贤春，尚茂林.淫羊藿苷抗大鼠运动性疲劳的实验研究[J].吉林体育学院学报，2010，26 （2）：90-93.
[7] 郭佳超， 陆蕊杭， 苑雅萍.HPLC测定壮阳祛风颗粒中淫羊藿苷的含量[J] .中国实验方剂学杂志.2011.17（3）：111-112.
[8] 王艳艳， 刘长河.HPLC法测定补肾助孕胶囊中淫羊蕾普的含量[J] .中国医药指南.2012.7 （10）21：435-437.
作者简介：朱乐（1989-）女（满），硕士研究生，主要从事中药新剂型与新技术研究.
*通讯作者：郭建鹏（1971-）男（汉），教授，从事中药新剂型与新技术研究.