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摘 要：建立了分散液液微萃取（DLLME）-超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）对茶饮料中的黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2进行同时测定的方法。样品以盐酸为分散剂，3-氯苯胺为萃取剂进行萃取，调节pH至6后，离心分层，弃去上层水相，下层乙腈定容，使用电喷雾电离源正离子模式进行测定。结果表明，两种黄曲霉毒素在1.0～100 μg/L范围内呈良好线性关系，相关系数r大于0.999 3，平均回收率为71.2%～91.0%，检出限均为20.0 ng/kg，定量限均为50.0 ng/kg，相对标准偏差为2.23%～6.43%。该方法操作快速简便、回收率好、灵敏度高、重现性好，适用于日常测定茶饮料中的黄曲霉毒素。
关键词：分散液液微萃取;超高效液相色谱-串联质谱;茶饮料;黄曲霉毒素
黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是由黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的一类次生代谢物[1]，从化学结构上，均属于双呋喃香豆素衍生物，是一类毒性极强的双呋喃环类毒素。由于AFT产生菌在自然界中广泛存在，很多的动植物源性食品都有可能存在污染[2]，尤其在植物的种植、加工、运输、储存等过程都有可能被产生菌污染，从而产生毒素[3]。同时，黄曲霉毒素在自然条件下稳定性较强，极性较低，难以用水或紫外线完全除去，只有在强碱性条件下容易分解[4]，过多的摄入引起致癌、致畸和致突变等毒性效应[5]，其中以黄曲霉毒素B1的毒性致癌性最强。近年来，我国黄曲霉毒素污染事件频繁发生，因此，建立高效、通用、灵敏的相关检测方法，对企业生产，消费者安全都有十分重要的意义。
目前，国内外对黄曲霉毒素的检测方法主要有高效液相色谱法[6-7]、液相色谱-串联质谱法[8-9]或液相色谱-高分辨质谱法[10]、免疫学检测法[11-12]。高效液相色谱法操作烦琐，尽管检测器灵敏度高，但杂质多，分析时间较长，免疫学检测法虽然能大批量检测，但易与类似结构的化合物发生反应，出现假阳性，结果偏差较大。质谱法应用较广，前处理简单，定性定量能力好，但高分辨质谱价格昂贵，难以广泛应用。本文以分散液液微萃取为前处理手段，建立了液相色谱-串联质谱法对茶饮料中的黄曲霉毒素B1和B2进行测定。方法学验证结果表明，方法整体方便快捷，灵敏度高，回收率好，可日常大批量检测。
1 材料与方法
1.1 仪器与设备
API4000Q质谱仪、岛津LC-20AD液相色谱系统、4k-15离心机、IKA Vortex4涡旋混匀器、Milli-Q Advantage A10 超纯水系统。
1.2 材料与试剂
茶饮料，广州市售;黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2，纯度大于98%，德国Dr.Ehrenstorfer公司;甲酸、乙腈、3-氯苯胺、三氯甲烷，均为HPLC级，美国Thermo Fisher公司;盐酸、磷酸钠，均为分析纯，广州试剂厂;实验用水为Milli-Q超纯水。
1.3 样品前处理
于15 mL尖底离心管中加入1 mL 2 mol/L的盐酸溶液和50 μL 3-氯苯胺充分混匀，然后加入5 mL样品，涡旋提取10 min，使用1 mol/L的磷酸钠溶液调节pH至6，涡旋混匀后置于离心机中以4 500 r/min离心5 min，使3-氯苯胺沉淀。除去上层水相，下层3-氯苯胺用乙腈定容至
200 μL，待测定。
1.4 标准曲线的绘制
标准储备溶液：分别准确称取黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2标准品各0.050 0 g于100 mL棕色具塞容量瓶中，用乙腈稀释成500 mg/L的储备液。
标准中间溶液：用乙腈将上述储备液稀释成浓度为10 mg/L的标准中间液。
溶剂曲线：使用乙腈配制成1.0 ?g/L、2.0 ?g/L、5.0 ?g/L、10 ?g/L、20 ?g/L、50 ?g/L和100 ?g/L的标准使用液，绘制校准曲线。
基质曲线：使用空白乌龙茶基质液配制校准曲线，浓度点与溶剂曲线相同。
1.5 色谱及质谱条件
1.5.1 色谱条件
色谱柱：Xbridge BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，3.0 ?m）;进样体积：10 ?L;流速0.5 mL/min;柱温：35 ℃;流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸（B）;等度洗脱程序：0.0～5.0 min，75% A。
1.5.2 质谱条件
离子源：ESI源;离子化模式：电喷雾电离源正模式（ESI+）;氣帘气压：241 kPa;毛细管电压：5 500 V;离子源温度（TEM）：550 ℃;雾化气压力：345 kPa;加热辅助气压力：345 kPa;碰撞气（CAD）：中等;采集模式：多反应监测（MRM）模式。
2 结果与分析
2.1 定性定量分析依据的收集
根据黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2的化学结构，其含有较多含O基团，在离子化过程中倾向于得到质子，因此分别以其相对分子质量加上H+质量，初步确定母离子质荷比。以混合流动相的流动注射的方式向离子源注射标准溶液，在m/z 313.1和m/z 315.1处，均得到较高响应的[M+H]+离子，同时以多反应监测（MRM）模式采集二级碎片。进一步优化去簇电压DP和碰撞电压CE，得到较优响应，二级质谱图见图1，详细质谱信息见表1。
2.2 分散剂的选择
分散液液微萃取过程中，加入分散剂和待测样液互溶，加入萃取剂振荡形成微小的液滴，这些液滴在移动的过程中于对目标物进行连续萃取，形成水/分散剂/萃取剂形成均相乳浊液体系，快速完成分析物在水溶液与萃取剂之间的分配平衡。选择盐酸作为分散剂。在本实验中，当分散剂用量小于0.6 mL时，提取回收率低于70%，使用量为1.0 mL时，回收率达到最高，随着使用量提高至1.2 mL，回收率有所回降。所以盐酸分散剂用量选取为1.0 mL。详细结果见图2。 2.3 萃取剂体积的选择
在分散剂体积为1 mL的条件下，分别用30 μL、50 μL、70 μL、90 μL、110 μL和130 μL的3-氯苯胺进行萃取，考察了不同体积的萃取剂对萃取回收率的影响，结果如图3所示。随着3-氯苯胺体积增大，回收率也增大，而当体积大于50 μL时，回收率增大不明显，而且3-氯苯胺的使用体积越大，pH回调的幅度也越大，实验更耗时，最终定容液3-氯苯胺的占比也越大，对于含有甲酸的流动相体系，容易造成溶剂效应，使峰型变差。因此，最终确定3-氯苯胺50 μL为最佳萃取体积。
2.4 基质效应的探讨
市售的茶饮料会添加糖、色素、酸度调节剂或其他添加剂，且含量远超于黄曲霉毒素可能存在的含量，加上茶叶本身含有较多的天然物，因此有可能造成较严重的基质效应（ME），使定量结果偏差较大。为了探究实验实际存在的基质效应，分别用空白基质液和乙腈配制了基质曲线和纯溶剂曲线，并以基质曲线和纯溶剂曲线的斜率比ME值为判断依据，当ME在80%～120%时，则说明基质效应不明显。实验结果显示，黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2的ME值分别为23.2%和26.5%，说明基质负效应明显，因此最终选择使用基质曲线进行定量，以校正基质效应造成的偏差。
2.5 定量分析结果
使用空白基质溶液配制标准曲线，线性范围为1.0～100 ?g/L，将该曲线于优化后的条件下测定，以质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。同时以信噪比S/N=3和信噪比S/N=10分别确定方法的检测限与定量限。黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2定量离子流图见图4。
结果表明，黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2的相关系数r分别为0.999 6和0.999 3，基质曲线方程分别为Y=5 050X+2 240和Y=3 090X+2 750，检测限均为20.0 ng/kg，定量限均为50.0 ng/kg。由分析结果可知，本方法定量能力好，检出限低，可有效对茶饮料中的黄曲霉毒素进行定量分析。
2.6 回收率及精密度分析
分别对市售的3种茶饮料（绿茶、乌龙茶、红茶）进行测定，结果均为阴性。使用该样品进行加标回收实验。每种样品均按照定量限的1倍、2倍和10倍进行添加，即0.05 μg/kg、0.10 μg/kg、0.50 μg/kg浓度水平，每个浓度水平在日内平均测定6次，平均回收率和相对标准偏差结果见表2。
3种样品的平均回收率范围在71.2%～91.0%，RSD范圍在2.23%～6.43%，方法回收率、精密度及准确度良好，可用于实际样品的测定。
3 结论
以液液微萃取为基础，建立前处理方法，方法整体高效简单，通过调节pH，较大限度回收萃取剂，提高了回收率;建立UPLC-MS/MS法，优化了色谱及质谱条件，两种黄曲霉毒素在样3 min内出峰，且峰型良好。使用基质曲线对定量结果进行校准，降低了基质效应对结果的影响。回收率和相对标准偏差数据表明，方法灵敏度高、重现性好，可为茶饮料中毒素测定方法的开发提供
依据。
参考文献
[1]潘中华，徐燕芳，成恒嵩.黄曲霉毒素分析方法进展[J].农业环境与发展，1995，12（2）：30-33.
[2]赵亚荣，刘香香，赵晓丽，等.生姜及其制品中常见真菌毒素污染与检测方法研究进展[J].农产品质量与安全，2020（4）：49-54.
[3]NAIR K P P.The Postharvest and industrial processing of ginger [M].Oxford： Elsevier，2013.
[4]杨惠宇，赵莹，潘发林.鱼类饲料中黄曲霉毒素B1检测技术研究进展[J].河北渔业，2020（8）：52-55.
[5]OMOTAYO O P， OMOTAYO A O， BABALOLA O O， et al. Dataset on the toxic effects of aflatoxin and ochratoxin A on the human gastric smooth muscle cells[J].Data in Brief， 2019，25：104089.
[6]华丽霞，曾华兰，蒋秋平，等.免疫亲和净化-光化学衍生液相色谱检测不同样品中的黄曲霉毒素[J].中国农业科技导报，2020，22（7）：181-187.
[7]石格鑫.高效液相色谱法测定小麦中黄曲霉毒素B1含量[J].现代食品，2020（10）：204-206.
[8]孙夏荣，葛晓明，王建花.QuEChERS超高效液相色谱-串联质谱法检测中药饮片中黄曲霉毒素[J].中国药业，2020，29（11）：44-47.
[9]华宇，高和杨，聂兴娜，等.同位素内标-高效液相色谱-串联质谱法检测牛奶及奶粉中黄曲霉毒素M1[J].食品安全质量检测学报，2020，11（6）：1978-1984.
[10]姚婷，王丹，李双，等.超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法快速检测发酵黑茶中黄曲霉毒素B1[J].分析测试学报，2017，36（11）：1346-1351.
[11]Iqbal J， Asghar M A， Ahmed A， et al. Aflatoxins contamination in Pakistani brown rice： a comparison of TLC， HPLC， LC-MS/MS and ELISA techniques[J]. Toxicol Mech Method， 2014，24（8）：544-551.
[12]Juki H， Dedi S， Rodi M， et al. Determination of Aflatoxin M1 in Raw Milk by the ELISA Method in the Una-Sana Canton[M]. 30th Scientific-Experts Conference of Agriculture and Food Industry，2020.
关键词：分散液液微萃取;超高效液相色谱-串联质谱;茶饮料;黄曲霉毒素
黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是由黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的一类次生代谢物[1]，从化学结构上，均属于双呋喃香豆素衍生物，是一类毒性极强的双呋喃环类毒素。由于AFT产生菌在自然界中广泛存在，很多的动植物源性食品都有可能存在污染[2]，尤其在植物的种植、加工、运输、储存等过程都有可能被产生菌污染，从而产生毒素[3]。同时，黄曲霉毒素在自然条件下稳定性较强，极性较低，难以用水或紫外线完全除去，只有在强碱性条件下容易分解[4]，过多的摄入引起致癌、致畸和致突变等毒性效应[5]，其中以黄曲霉毒素B1的毒性致癌性最强。近年来，我国黄曲霉毒素污染事件频繁发生，因此，建立高效、通用、灵敏的相关检测方法，对企业生产，消费者安全都有十分重要的意义。
目前，国内外对黄曲霉毒素的检测方法主要有高效液相色谱法[6-7]、液相色谱-串联质谱法[8-9]或液相色谱-高分辨质谱法[10]、免疫学检测法[11-12]。高效液相色谱法操作烦琐，尽管检测器灵敏度高，但杂质多，分析时间较长，免疫学检测法虽然能大批量检测，但易与类似结构的化合物发生反应，出现假阳性，结果偏差较大。质谱法应用较广，前处理简单，定性定量能力好，但高分辨质谱价格昂贵，难以广泛应用。本文以分散液液微萃取为前处理手段，建立了液相色谱-串联质谱法对茶饮料中的黄曲霉毒素B1和B2进行测定。方法学验证结果表明，方法整体方便快捷，灵敏度高，回收率好，可日常大批量检测。
1 材料与方法
1.1 仪器与设备
API4000Q质谱仪、岛津LC-20AD液相色谱系统、4k-15离心机、IKA Vortex4涡旋混匀器、Milli-Q Advantage A10 超纯水系统。
1.2 材料与试剂
茶饮料，广州市售;黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2，纯度大于98%，德国Dr.Ehrenstorfer公司;甲酸、乙腈、3-氯苯胺、三氯甲烷，均为HPLC级，美国Thermo Fisher公司;盐酸、磷酸钠，均为分析纯，广州试剂厂;实验用水为Milli-Q超纯水。
1.3 样品前处理
于15 mL尖底离心管中加入1 mL 2 mol/L的盐酸溶液和50 μL 3-氯苯胺充分混匀，然后加入5 mL样品，涡旋提取10 min，使用1 mol/L的磷酸钠溶液调节pH至6，涡旋混匀后置于离心机中以4 500 r/min离心5 min，使3-氯苯胺沉淀。除去上层水相，下层3-氯苯胺用乙腈定容至
200 μL，待测定。
1.4 标准曲线的绘制
标准储备溶液：分别准确称取黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2标准品各0.050 0 g于100 mL棕色具塞容量瓶中，用乙腈稀释成500 mg/L的储备液。
标准中间溶液：用乙腈将上述储备液稀释成浓度为10 mg/L的标准中间液。
溶剂曲线：使用乙腈配制成1.0 ?g/L、2.0 ?g/L、5.0 ?g/L、10 ?g/L、20 ?g/L、50 ?g/L和100 ?g/L的标准使用液，绘制校准曲线。
基质曲线：使用空白乌龙茶基质液配制校准曲线，浓度点与溶剂曲线相同。
1.5 色谱及质谱条件
1.5.1 色谱条件
色谱柱：Xbridge BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，3.0 ?m）;进样体积：10 ?L;流速0.5 mL/min;柱温：35 ℃;流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸（B）;等度洗脱程序：0.0～5.0 min，75% A。
1.5.2 质谱条件
离子源：ESI源;离子化模式：电喷雾电离源正模式（ESI+）;氣帘气压：241 kPa;毛细管电压：5 500 V;离子源温度（TEM）：550 ℃;雾化气压力：345 kPa;加热辅助气压力：345 kPa;碰撞气（CAD）：中等;采集模式：多反应监测（MRM）模式。
2 结果与分析
2.1 定性定量分析依据的收集
根据黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2的化学结构，其含有较多含O基团，在离子化过程中倾向于得到质子，因此分别以其相对分子质量加上H+质量，初步确定母离子质荷比。以混合流动相的流动注射的方式向离子源注射标准溶液，在m/z 313.1和m/z 315.1处，均得到较高响应的[M+H]+离子，同时以多反应监测（MRM）模式采集二级碎片。进一步优化去簇电压DP和碰撞电压CE，得到较优响应，二级质谱图见图1，详细质谱信息见表1。
2.2 分散剂的选择
分散液液微萃取过程中，加入分散剂和待测样液互溶，加入萃取剂振荡形成微小的液滴，这些液滴在移动的过程中于对目标物进行连续萃取，形成水/分散剂/萃取剂形成均相乳浊液体系，快速完成分析物在水溶液与萃取剂之间的分配平衡。选择盐酸作为分散剂。在本实验中，当分散剂用量小于0.6 mL时，提取回收率低于70%，使用量为1.0 mL时，回收率达到最高，随着使用量提高至1.2 mL，回收率有所回降。所以盐酸分散剂用量选取为1.0 mL。详细结果见图2。 2.3 萃取剂体积的选择
在分散剂体积为1 mL的条件下，分别用30 μL、50 μL、70 μL、90 μL、110 μL和130 μL的3-氯苯胺进行萃取，考察了不同体积的萃取剂对萃取回收率的影响，结果如图3所示。随着3-氯苯胺体积增大，回收率也增大，而当体积大于50 μL时，回收率增大不明显，而且3-氯苯胺的使用体积越大，pH回调的幅度也越大，实验更耗时，最终定容液3-氯苯胺的占比也越大，对于含有甲酸的流动相体系，容易造成溶剂效应，使峰型变差。因此，最终确定3-氯苯胺50 μL为最佳萃取体积。
2.4 基质效应的探讨
市售的茶饮料会添加糖、色素、酸度调节剂或其他添加剂，且含量远超于黄曲霉毒素可能存在的含量，加上茶叶本身含有较多的天然物，因此有可能造成较严重的基质效应（ME），使定量结果偏差较大。为了探究实验实际存在的基质效应，分别用空白基质液和乙腈配制了基质曲线和纯溶剂曲线，并以基质曲线和纯溶剂曲线的斜率比ME值为判断依据，当ME在80%～120%时，则说明基质效应不明显。实验结果显示，黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2的ME值分别为23.2%和26.5%，说明基质负效应明显，因此最终选择使用基质曲线进行定量，以校正基质效应造成的偏差。
2.5 定量分析结果
使用空白基质溶液配制标准曲线，线性范围为1.0～100 ?g/L，将该曲线于优化后的条件下测定，以质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。同时以信噪比S/N=3和信噪比S/N=10分别确定方法的检测限与定量限。黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2定量离子流图见图4。
结果表明，黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2的相关系数r分别为0.999 6和0.999 3，基质曲线方程分别为Y=5 050X+2 240和Y=3 090X+2 750，检测限均为20.0 ng/kg，定量限均为50.0 ng/kg。由分析结果可知，本方法定量能力好，检出限低，可有效对茶饮料中的黄曲霉毒素进行定量分析。
2.6 回收率及精密度分析
分别对市售的3种茶饮料（绿茶、乌龙茶、红茶）进行测定，结果均为阴性。使用该样品进行加标回收实验。每种样品均按照定量限的1倍、2倍和10倍进行添加，即0.05 μg/kg、0.10 μg/kg、0.50 μg/kg浓度水平，每个浓度水平在日内平均测定6次，平均回收率和相对标准偏差结果见表2。
3种样品的平均回收率范围在71.2%～91.0%，RSD范圍在2.23%～6.43%，方法回收率、精密度及准确度良好，可用于实际样品的测定。
3 结论
以液液微萃取为基础，建立前处理方法，方法整体高效简单，通过调节pH，较大限度回收萃取剂，提高了回收率;建立UPLC-MS/MS法，优化了色谱及质谱条件，两种黄曲霉毒素在样3 min内出峰，且峰型良好。使用基质曲线对定量结果进行校准，降低了基质效应对结果的影响。回收率和相对标准偏差数据表明，方法灵敏度高、重现性好，可为茶饮料中毒素测定方法的开发提供
依据。
参考文献
[1]潘中华，徐燕芳，成恒嵩.黄曲霉毒素分析方法进展[J].农业环境与发展，1995，12（2）：30-33.
[2]赵亚荣，刘香香，赵晓丽，等.生姜及其制品中常见真菌毒素污染与检测方法研究进展[J].农产品质量与安全，2020（4）：49-54.
[3]NAIR K P P.The Postharvest and industrial processing of ginger [M].Oxford： Elsevier，2013.
[4]杨惠宇，赵莹，潘发林.鱼类饲料中黄曲霉毒素B1检测技术研究进展[J].河北渔业，2020（8）：52-55.
[5]OMOTAYO O P， OMOTAYO A O， BABALOLA O O， et al. Dataset on the toxic effects of aflatoxin and ochratoxin A on the human gastric smooth muscle cells[J].Data in Brief， 2019，25：104089.
[6]华丽霞，曾华兰，蒋秋平，等.免疫亲和净化-光化学衍生液相色谱检测不同样品中的黄曲霉毒素[J].中国农业科技导报，2020，22（7）：181-187.
[7]石格鑫.高效液相色谱法测定小麦中黄曲霉毒素B1含量[J].现代食品，2020（10）：204-206.
[8]孙夏荣，葛晓明，王建花.QuEChERS超高效液相色谱-串联质谱法检测中药饮片中黄曲霉毒素[J].中国药业，2020，29（11）：44-47.
[9]华宇，高和杨，聂兴娜，等.同位素内标-高效液相色谱-串联质谱法检测牛奶及奶粉中黄曲霉毒素M1[J].食品安全质量检测学报，2020，11（6）：1978-1984.
[10]姚婷，王丹，李双，等.超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法快速检测发酵黑茶中黄曲霉毒素B1[J].分析测试学报，2017，36（11）：1346-1351.
[11]Iqbal J， Asghar M A， Ahmed A， et al. Aflatoxins contamination in Pakistani brown rice： a comparison of TLC， HPLC， LC-MS/MS and ELISA techniques[J]. Toxicol Mech Method， 2014，24（8）：544-551.
[12]Juki H， Dedi S， Rodi M， et al. Determination of Aflatoxin M1 in Raw Milk by the ELISA Method in the Una-Sana Canton[M]. 30th Scientific-Experts Conference of Agriculture and Food Industry，2020.