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摘要：花叶金线莲为福建省农业科学院作物研究所自主选育的金线莲新品种，其叶色墨绿色与金黄色相嵌，形成鲜明的色彩对比，色泽亮丽，具有较高的观赏价值，特别适合于试管花卉的开发应用。从无菌材料获得、培养容器选择与灭菌、培养基配制与灭菌分装、试管工艺接种培养等方面总结了花叶金线莲试管工艺制作技术。
关键词：花叶金线莲;试管花卉;工艺制作
DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2018.11.001
金线莲Anoectochilus roxburghii（wall.）lindl.为兰科开唇兰属多年生草本植物，是我国传统名贵药材，也是十分珍贵的室内小型观叶植物[1-4]。花叶金线莲是从福建金线莲组培快繁中发现的突变单株，经定向选择而育成的新品种，其叶色墨绿色与金黄色相嵌，形成鲜明的色彩对比，色泽亮丽，具有较高的观赏价值，特别适合于试管花卉的开发应用。本文从其组培快繁、试管工艺制作规程等方面总结了花叶金线莲试管工艺制作技术。
1基本设备要求
1.1试验场所
环境清洁、空气干燥的实验室，主要包括化学实验室、洗涤室、灭菌室、接种室、培养室等。
1.2仪器设备
主要有高压灭菌锅、超净工作台、药品柜、冰箱、电磁炉、电子天平、搅拌器、pH计、空调、培养架、紫外线灯、培养瓶、工艺瓶、常用玻璃仪器、手术刀、镊子等，以及所需的化学试剂。
1.3培养条件
根据培养目的进行调控，培养温度一般保持在（25±2）℃;光照强度根据培养目的和培养阶段进行调控，母瓶材料繁殖一般为1500～2000 lx，试管工艺产品预培养一般为1000～1500 lx;光照时间10 h·d-1。
2组培快繁
2.1外植体制备
花叶金线莲系诱变获得的新材料，资源保存主要有通过移栽种植活体保存与母瓶材料无菌保存2种方式。若选取活体保存的材料需重新建立无菌系。外植体制备方法：选取健康、无病虫害的母株，去除叶片、根系，留下茎段，先用洗洁精溶液浸泡5 min，再用自来水冲洗干净，移至超净工作台上;先用75%酒精浸泡60 s，再用0.1%HgCl2灭菌8～10 min后取出，用无菌水彻底冲洗 4～5 次，备用。
2.2诱导培养
将消毒后的外植体切割成带节茎段（长度1 cm）接入诱导培养基中进行培养。诱导培养7 d后茎段节结处的潜伏芽开始萌动膨大，培养10～15 d后可观察乳白色主芽形成，随后主芽基部发生一级侧芽，一级侧芽可发生二级侧芽，二级侧芽又可发生三级侧芽……从而形成主轴分枝型的丛生芽。
2.3增殖培养
以诱导出的主轴分枝型的丛生芽为材料，以主轴分枝型的丛生芽增殖途径实现不断增殖。继代增殖培养周期控制在50～55 d，增殖系数控制在3.0～4.0。培养周期过长芽苗易伸长，不利于增殖培养与试管工艺制作。
3试管工艺制作
3.1培养容器选择与灭菌
3.1.1培养容器选择采用球型玻璃工艺瓶或艺术化的玻璃器皿均可，在选择球型玻璃工艺瓶作为培养容器时，要考虑培养基固定问题，即瓶底不能滑动，否则会影响造景美观效果。
3.1.2培养容器灭菌花叶金线莲主要以直径8 cm的球型玻璃瓶作为培养容器，先用牛皮纸包裹球型玻璃瓶，后装入保鲜袋，封口后，放入高压灭菌锅121℃下灭菌40 min，灭菌后在温度80℃的干燥箱中充分干燥，备用。
3.2培养基制备
3.2.1母液配制分为大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机化合物母液、食用色素母液和抗菌剂母液。根据花叶金线莲所需的培养基组分（表1），先将母液配制为以下浓度：（1）大量元素母液为20的倍数关系;（2）微量元素母液为200的倍数关系;（3）铁盐母液为100的倍数关系;（4）有机化合物母液为100的倍数关系;（5）抗菌剂母液浓度为1.0 mg·mL-1;（6）食用色素母液浓度配为1.0 mg·mL-1;配制培养基所用试剂纯度为化学纯以上。配制用水除无机化合物母液使用无菌的蒸馏水外，其余均用去离子水配制。将配置好的母液贴上标签，标明母液名称、浓度和配制日期。微量元素母液和铁盐母液用棕色瓶储藏。母液
置于4℃左右的冰箱中，储藏时间不超过1个月。母液若有沉淀、结晶、微生物和藻类生长应废弃不用。
3.2.2培养基配制、灭菌与分装依照花叶金线莲试管工艺培养基配方（表1）以及需要配制的培养基体积，量取70%最终体积的蒸馏水，按比例分取大量元素、微量元素、铁盐、有机化合物及食用色素、抗菌剂母液，称取所需的固化剂、花宝1号和糖等，转至不锈钢加热容器内。边加热边搅拌，控制沸腾程度，直至固化剂和糖完全溶解后，将培养基定容至最终所需体积。用1.0 mol·L-1氢氧化钠调整培养基pH值至5.8左右。
将配置好的培养基装入650 mL的组培瓶4/5处，旋紧瓶盖，放入高压灭菌锅于121℃下灭菌20 min，灭菌后取出冷却至45～50℃，待分装。
在超净工作台上，拆开已灭菌过的工艺球型玻璃瓶，置于台面上，用高温灭菌过的烧标量取培养基40 mL，再用无菌漏斗注入球型瓶口，封紧瓶塞，然后静置冷却、凝固。
3.3接種
3.3.1准备工作（1）接种人员保洁。接种操作人员进入接种室前，在缓冲间更换拖鞋，穿接种服，戴帽子、口罩，用洗洁剂洗净手。（2）物品灭菌。接种器械、接种盘等物品使用前应进行灭菌， 灭菌方法：用牛皮纸包裹后装入保鲜袋放入高压灭菌锅于121℃下灭菌40 min，备用。（3）接种室灭菌。接种人员先打开超净工作台、接种室和缓冲间的紫外灯进行灭菌30 min，在关闭紫外灯15 min后人员方可进入接种室;接种人员对超净工作台上的工具、台面和两侧挡板用75%酒精或0.1%新洁尔灭进行擦拭灭菌，灭菌后对超净工作台开机通风30 min;在开始接种前15 min打开接种用电热灭菌器。 3.3.2接种用棉花球制作与灭菌无菌干燥的棉花球制作方法：配置质量浓度为8%的表面活性剂溶液，可使用市售立白洗洁精与蒸馏水按比例配制而成，将脱脂棉浸泡其中后，挤出水分，在温度80℃的干燥箱中充分干燥，将干燥后的棉花做成直径0.8～1.0 cm的小棉球，并在121℃灭菌40 min即得无菌干燥的棉花球，其制作原理是表面活性剂可以减少水在玻璃瓶内的张力，使其流下不在瓶壁上聚集。
3.3.3接种操作（1）消毒。接种人员在接种操作前用75%酒精喷洒台面，酒精棉彻底擦拭双手及台面。（2）灭菌。接种操作过程要对接种的工具（镊子、切割刀、接种盘等）进行灭菌，在接种前应高压灭菌镊子、切割刀、接种盘，用时在接种器具杀菌器中消毒，插入280～290℃的导热石英珠杀菌筒中15～20 s，便可完成杀菌过程，消毒后的切割刀、镊子放在专用插槽或搁置架上，待冷却后使用。使用过的接种工具要重新灭菌后晾放备用，避免交叉污染。（3）接种方法。A.无菌试管苗切割：在超净工作台上，打开母瓶材料瓶口时应拿成斜角，以免灰尘落入瓶中;用镊子取出瓶中的材料放入接种盘中，右手拿切割刀，左手拿镊子，将取出的材料进行切割，切割成1～3芽，备用。B.用无菌干燥的棉花球擦拭球型玻璃瓶壁上的水珠或水汽，使瓶壁透亮;然后将长势一致的花叶金线无菌试管苗接种至工艺玻璃瓶中的培养基上，接种数为3个芽，芽以斜插或直插方式植入培养基2/3深处，并进行造型布局，接种后及时盖好瓶盖。
3.3.4接种后处理关闭接种器具杀菌器、清洁超净工作台和接种室，最后关闭超净工作台及电源 。
3.4工艺品培养
将接有无菌试管苗的工艺玻璃瓶放置在温度（25±2）℃、光照强度1500～2000 lx、光照时间为10 h·d-1的条件下进行培养，培养时间为21～28 d，之后转入室温、散射光条件下继续培养即可。
参考文献：
[1]羅晓青，吴明开，查兰松.珍稀药用植物金线莲研究现状与发展趋势[J].贵州农业科学，2011，39（3）：71-74.
[2]赵云青，黄颖桢，陈菁瑛，等.金线莲白绢病病原菌分离及分子鉴定[J].福建农业学报，2013，28（4）：357-360.
[3]施满容，龚林光，陆志平，等.闽东野生金线莲有效成分含量的比较[J].福建农业学报，2016，31（9）：950-956.
[4]魏翠华，谢宇，秦建彬，等.不同肥料处理对金线莲产量和品质的影响[J].福建农业学报，2015，30（8）：793-796.
[5]叶秀仙，陈艺荃，钟淮钦，等.花叶金线莲茎段诱导植株再生培养技术研究[J].福建农业学报，2018，33（3）：258-262.
（责任编辑：陈文静）
关键词：花叶金线莲;试管花卉;工艺制作
DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2018.11.001
金线莲Anoectochilus roxburghii（wall.）lindl.为兰科开唇兰属多年生草本植物，是我国传统名贵药材，也是十分珍贵的室内小型观叶植物[1-4]。花叶金线莲是从福建金线莲组培快繁中发现的突变单株，经定向选择而育成的新品种，其叶色墨绿色与金黄色相嵌，形成鲜明的色彩对比，色泽亮丽，具有较高的观赏价值，特别适合于试管花卉的开发应用。本文从其组培快繁、试管工艺制作规程等方面总结了花叶金线莲试管工艺制作技术。
1基本设备要求
1.1试验场所
环境清洁、空气干燥的实验室，主要包括化学实验室、洗涤室、灭菌室、接种室、培养室等。
1.2仪器设备
主要有高压灭菌锅、超净工作台、药品柜、冰箱、电磁炉、电子天平、搅拌器、pH计、空调、培养架、紫外线灯、培养瓶、工艺瓶、常用玻璃仪器、手术刀、镊子等，以及所需的化学试剂。
1.3培养条件
根据培养目的进行调控，培养温度一般保持在（25±2）℃;光照强度根据培养目的和培养阶段进行调控，母瓶材料繁殖一般为1500～2000 lx，试管工艺产品预培养一般为1000～1500 lx;光照时间10 h·d-1。
2组培快繁
2.1外植体制备
花叶金线莲系诱变获得的新材料，资源保存主要有通过移栽种植活体保存与母瓶材料无菌保存2种方式。若选取活体保存的材料需重新建立无菌系。外植体制备方法：选取健康、无病虫害的母株，去除叶片、根系，留下茎段，先用洗洁精溶液浸泡5 min，再用自来水冲洗干净，移至超净工作台上;先用75%酒精浸泡60 s，再用0.1%HgCl2灭菌8～10 min后取出，用无菌水彻底冲洗 4～5 次，备用。
2.2诱导培养
将消毒后的外植体切割成带节茎段（长度1 cm）接入诱导培养基中进行培养。诱导培养7 d后茎段节结处的潜伏芽开始萌动膨大，培养10～15 d后可观察乳白色主芽形成，随后主芽基部发生一级侧芽，一级侧芽可发生二级侧芽，二级侧芽又可发生三级侧芽……从而形成主轴分枝型的丛生芽。
2.3增殖培养
以诱导出的主轴分枝型的丛生芽为材料，以主轴分枝型的丛生芽增殖途径实现不断增殖。继代增殖培养周期控制在50～55 d，增殖系数控制在3.0～4.0。培养周期过长芽苗易伸长，不利于增殖培养与试管工艺制作。
3试管工艺制作
3.1培养容器选择与灭菌
3.1.1培养容器选择采用球型玻璃工艺瓶或艺术化的玻璃器皿均可，在选择球型玻璃工艺瓶作为培养容器时，要考虑培养基固定问题，即瓶底不能滑动，否则会影响造景美观效果。
3.1.2培养容器灭菌花叶金线莲主要以直径8 cm的球型玻璃瓶作为培养容器，先用牛皮纸包裹球型玻璃瓶，后装入保鲜袋，封口后，放入高压灭菌锅121℃下灭菌40 min，灭菌后在温度80℃的干燥箱中充分干燥，备用。
3.2培养基制备
3.2.1母液配制分为大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机化合物母液、食用色素母液和抗菌剂母液。根据花叶金线莲所需的培养基组分（表1），先将母液配制为以下浓度：（1）大量元素母液为20的倍数关系;（2）微量元素母液为200的倍数关系;（3）铁盐母液为100的倍数关系;（4）有机化合物母液为100的倍数关系;（5）抗菌剂母液浓度为1.0 mg·mL-1;（6）食用色素母液浓度配为1.0 mg·mL-1;配制培养基所用试剂纯度为化学纯以上。配制用水除无机化合物母液使用无菌的蒸馏水外，其余均用去离子水配制。将配置好的母液贴上标签，标明母液名称、浓度和配制日期。微量元素母液和铁盐母液用棕色瓶储藏。母液
置于4℃左右的冰箱中，储藏时间不超过1个月。母液若有沉淀、结晶、微生物和藻类生长应废弃不用。
3.2.2培养基配制、灭菌与分装依照花叶金线莲试管工艺培养基配方（表1）以及需要配制的培养基体积，量取70%最终体积的蒸馏水，按比例分取大量元素、微量元素、铁盐、有机化合物及食用色素、抗菌剂母液，称取所需的固化剂、花宝1号和糖等，转至不锈钢加热容器内。边加热边搅拌，控制沸腾程度，直至固化剂和糖完全溶解后，将培养基定容至最终所需体积。用1.0 mol·L-1氢氧化钠调整培养基pH值至5.8左右。
将配置好的培养基装入650 mL的组培瓶4/5处，旋紧瓶盖，放入高压灭菌锅于121℃下灭菌20 min，灭菌后取出冷却至45～50℃，待分装。
在超净工作台上，拆开已灭菌过的工艺球型玻璃瓶，置于台面上，用高温灭菌过的烧标量取培养基40 mL，再用无菌漏斗注入球型瓶口，封紧瓶塞，然后静置冷却、凝固。
3.3接種
3.3.1准备工作（1）接种人员保洁。接种操作人员进入接种室前，在缓冲间更换拖鞋，穿接种服，戴帽子、口罩，用洗洁剂洗净手。（2）物品灭菌。接种器械、接种盘等物品使用前应进行灭菌， 灭菌方法：用牛皮纸包裹后装入保鲜袋放入高压灭菌锅于121℃下灭菌40 min，备用。（3）接种室灭菌。接种人员先打开超净工作台、接种室和缓冲间的紫外灯进行灭菌30 min，在关闭紫外灯15 min后人员方可进入接种室;接种人员对超净工作台上的工具、台面和两侧挡板用75%酒精或0.1%新洁尔灭进行擦拭灭菌，灭菌后对超净工作台开机通风30 min;在开始接种前15 min打开接种用电热灭菌器。 3.3.2接种用棉花球制作与灭菌无菌干燥的棉花球制作方法：配置质量浓度为8%的表面活性剂溶液，可使用市售立白洗洁精与蒸馏水按比例配制而成，将脱脂棉浸泡其中后，挤出水分，在温度80℃的干燥箱中充分干燥，将干燥后的棉花做成直径0.8～1.0 cm的小棉球，并在121℃灭菌40 min即得无菌干燥的棉花球，其制作原理是表面活性剂可以减少水在玻璃瓶内的张力，使其流下不在瓶壁上聚集。
3.3.3接种操作（1）消毒。接种人员在接种操作前用75%酒精喷洒台面，酒精棉彻底擦拭双手及台面。（2）灭菌。接种操作过程要对接种的工具（镊子、切割刀、接种盘等）进行灭菌，在接种前应高压灭菌镊子、切割刀、接种盘，用时在接种器具杀菌器中消毒，插入280～290℃的导热石英珠杀菌筒中15～20 s，便可完成杀菌过程，消毒后的切割刀、镊子放在专用插槽或搁置架上，待冷却后使用。使用过的接种工具要重新灭菌后晾放备用，避免交叉污染。（3）接种方法。A.无菌试管苗切割：在超净工作台上，打开母瓶材料瓶口时应拿成斜角，以免灰尘落入瓶中;用镊子取出瓶中的材料放入接种盘中，右手拿切割刀，左手拿镊子，将取出的材料进行切割，切割成1～3芽，备用。B.用无菌干燥的棉花球擦拭球型玻璃瓶壁上的水珠或水汽，使瓶壁透亮;然后将长势一致的花叶金线无菌试管苗接种至工艺玻璃瓶中的培养基上，接种数为3个芽，芽以斜插或直插方式植入培养基2/3深处，并进行造型布局，接种后及时盖好瓶盖。
3.3.4接种后处理关闭接种器具杀菌器、清洁超净工作台和接种室，最后关闭超净工作台及电源 。
3.4工艺品培养
将接有无菌试管苗的工艺玻璃瓶放置在温度（25±2）℃、光照强度1500～2000 lx、光照时间为10 h·d-1的条件下进行培养，培养时间为21～28 d，之后转入室温、散射光条件下继续培养即可。
参考文献：
[1]羅晓青，吴明开，查兰松.珍稀药用植物金线莲研究现状与发展趋势[J].贵州农业科学，2011，39（3）：71-74.
[2]赵云青，黄颖桢，陈菁瑛，等.金线莲白绢病病原菌分离及分子鉴定[J].福建农业学报，2013，28（4）：357-360.
[3]施满容，龚林光，陆志平，等.闽东野生金线莲有效成分含量的比较[J].福建农业学报，2016，31（9）：950-956.
[4]魏翠华，谢宇，秦建彬，等.不同肥料处理对金线莲产量和品质的影响[J].福建农业学报，2015，30（8）：793-796.
[5]叶秀仙，陈艺荃，钟淮钦，等.花叶金线莲茎段诱导植株再生培养技术研究[J].福建农业学报，2018，33（3）：258-262.
（责任编辑：陈文静）