【摘 要】
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目的 为了证实BCG_3174是BCG基因组中存在的潜在抑制凋亡功能基因,拟构建BCG_ 3174敲除菌株并进行鉴定. 方法 以BCG中国株的基因组DNA为模板,PCR扩增BCG_3174基因,扩增产物用
【机 构】
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湖北大学生命科学学院,湖北武汉430062;华中科技大学同济医学院基础医学院病原生物学系
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目的 为了证实BCG_3174是BCG基因组中存在的潜在抑制凋亡功能基因,拟构建BCG_ 3174敲除菌株并进行鉴定. 方法 以BCG中国株的基因组DNA为模板,PCR扩增BCG_3174基因,扩增产物用Van91 Ⅰ酶切并回收产物.载体p0004S转化E.coli DH5α培养,用Van911酶切载体p0004S.将酶切BCG_3174基因片段的左、右臂以及酶切载体p0004S的3.6 kb和1.6 kb两个片段连接,转化入DH5α中培养,筛选阳性克隆并测序鉴定,构建重组质粒p0004S-△BCG_3174.将载体phAE159转化E.coli HB101培养,提取phAE159后以PacⅠ酶切,同时以PacⅠ酶切重组质粒p0004S-△BCG_3174,以T4连接酶连接.加入E.coli HB101感受态细胞并培养,提取质粒后用PacⅠ酶切鉴定,阳性克隆命名为phAE159-△BCG_3174,电击转化耻垢分枝杆菌mc2155感受态细胞.取BCG菌液与噬菌体裂解液混合共培养,提取敲除菌株的基因组DNA,鉴定正确的菌株命名为△BCG_3174. 结果 凝胶成像显示扩增产物与预期目标大小一致,左臂大小为887 bp,右臂大小为931 bp.阳性克隆测序确证左、右臂正确连入p0004S且序列无突变,p0004S-△BCG_3174序列与预期一致.Pac Ⅰ酶切phAE159载体产生约42 kb和4 kb两条片段,酶切p0004S-△BCG_3174质粒产生7.1 kb片段,该片段亚克隆入Pac Ⅰ酶切的phAE159载体后产生重组质粒phAE159-△BCG_3174,酶切鉴定证实phAE159-△BCG_3174构建正确.BCG_3174基因敲除的BCG基因组PCR扩增产物大小约为5.6 kb,与预期大小相符,BCG_3174基因敲除BCG菌株△BCG_3174构建成功. 结论 成功制备BCG_3174基因敲除的BCG菌株△BCG_3174,为BCG_3174基因的功能研究奠定了基础.
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