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摘要 [目的]建立以银杏幼茎节为外植体的无菌接种体系。[方法]以银杏树当年生幼茎节为外植体，研究不同种类、不同浓度消毒剂、不同处理时间对外植体的消毒效果，及不同生长调节剂条件对愈伤的诱导。 [结果]外植体最佳接种条件为用75%乙醇处理2 min后，10%次氯酸钠处理15 min，12%次氯酸钠处理10 min;0.8%新洁尔灭处理20 min;12%双氧水处理8～10 min，污染率和褐化率都相对较低。在0.3 mol/L NAA和0.3 mol/L 6-BA组合，0.3 mol/L NAA和0.5 mol/L 6-BA组合中，银杏幼莖节的愈伤诱导率较高，愈伤的生长情况较好。[结论]该研究建立了以银杏幼茎节为外植体的再生体系，为其愈伤诱导及其进一步的生理研究提供了基础。
关键词 幼茎节;无菌接种;愈伤诱导
中图分类号 S723.1 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2020）19-0116-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.030
Abstract [Objective]To establish the tissue culture regeneration system of young stem nodes of Ginkgo biloba. [Method]Taking young stem nodes of annual G.biloba tree as explants，disinfection effect of different kinds，concentrations of disinfectants，treatment time on external implants，and different hormone conditions on callus induction were studied. [Result]The optimal inoculation conditions for explants were： after 75% alcohol treatment for 2 min，10% sodium hypochlorite treatment for 15 min and 12% sodium hypochlorite treatment for 10 min;0.8% bromogera mine for 20 min;12% hydrogen peroxide for 8-10 min; resulted in relatively low pollution rate and browning rate. In the hormone combination of 0.3 mol/L NAA and 0.3 mol/L 6-BA，0.3 mol/L NAA and 0.5 mol/L 6-BA，the callus induction rate of young stem nodes of G.biloba was higher and the callus growth was better. [Conclusion]This study established tissue culture regeneration system of G.biloba，which provided basis for its callus induction and further physiological studies.
Key words Young stem node;Aseptic inoculation;Callus induction
基金项目 广安职业技术学院校级重点科研项目（GAZYKY-2019A03）;四川省教育厅重点科研项目（18ZA0228）。
作者简介 喻娜（1986—），女，四川隆昌人，讲师，硕士，从事植物组织培养研究和教学工作。
收稿日期 2020-03-04
银杏（Ginkgo biloba L.）是银杏科、银杏属落叶乔木，因古老而稀少被誉为“活化石”[1]，又因其集观赏、食用、药用、生态环保于一体而受到人们的关注[2]。银杏传统的育苗方法为实生繁殖、扦插繁殖、嫁接繁殖等。但这些方法的繁殖率低、周期长，远不能满足市场的需求。如果想短期内得到大面积优良的银杏苗，组织培养技术是一种可行有效的方式。传统育种方式弊端的显现促使银杏的组织培养方面研究取得了一定进展，从不同外植体包括胚、茎段、子叶、胚轴、小孢子、配子体等方面都有相关研究[3]。总的来看，银杏组培最易成功的外植体首属茎段，茎段主要通过幼苗或者胚诱导的组培苗采集，幼茎的组培通过腋芽或嫩梢繁殖。罗紫娟[4]曾对银杏胚和茎段进行过组织培养，获得再生植株。罗言云等[5]用银杏无菌苗带腋芽的茎段为外植体，由带腋芽的茎段分化芽，分化出的芽再在培养基上分化根，并形成试管苗。通过组培的方式可以保持银杏母本的优良性状，但分化率小，不定芽数较少，繁殖速度较慢。陈颖等[6]以银杏成熟胚培养出的一个月月龄无菌幼苗各部位茎段为外植体，研究其顶芽、带腋芽的中段、带子叶的下段腋芽萌发和不定芽的分化情况时发现由胚诱导的组培苗茎段发生丛生芽的潜力最大。
以幼茎为外植体的研究多以0.1%升汞搭配75%乙醇进行消毒处理，几乎没有系统性地研究不同消毒剂对幼茎消毒的影响[7-9]。用于外植体灭菌的消毒剂种类很多，在实际应用中，外植体的消毒效果受消毒剂种类、浓度和处理时间及使用方法等多种因素的影响[10]。外植体的消毒效果直接影响银杏茎节愈伤组织诱导、丛生芽诱导等，系统性地对银杏幼茎节消毒效果研究为银杏组织培养奠定了基础。在植物组织培养过程中，6-BA、NAA、IBA等植物生长调节剂配比对多种植物的不同外植体愈伤诱导效果较好[11-13]，胡选萍等[14]在研究银杏幼茎、茎尖为外植体时萘乙酸、6-苄基腺嘌呤都有利于愈伤的诱导。该研究选择不同配比植物调节剂6-BA、NAA来研究银杏幼茎节愈伤的诱导，以期为银杏组培快繁及再生等生理学研究提供依据。 1 材料与方法
1.1 材料 采集3月下旬—5月下旬生长状态基本一致、粗约2 mm的银杏母树当年生嫩枝茎节为外植体，切成小段，每段长约1.5 cm，中上段带腋芽。
1.2 灭菌方法
剪取生长状态基本一致的银杏当年生枝条幼茎，连带茎段的长度约0.5 cm，放入含洗衣粉的三角瓶中充分摇晃，静止浸泡15 min，后在流水下冲洗30 min。在超净工作台上将冲洗干净的幼茎节放入75%乙醇中充分摇晃2 min，无菌水冲洗3遍;然后根据预试验分别放入不同浓度的消毒剂中处理不同时间：10%次氯酸钠分别处理10、15、20 min，12%次氯酸钠分别处理9、12、15 min ，15%次氯酸钠分别处理8、10、12 min;新洁尔灭（0.5%、0.8%、1.0%）分别处理10、15、20 min;5%的双氧水分别处理10、13、15 min，10%的双氧水分别处理8、10、12 min，12%的双氧水分别处理5、8、10 min。无菌水冲洗3遍，使用无菌滤纸吸干水分，接种于MS培养基上，每瓶接种7个茎节，每组重复3瓶，即每组接种21个。
1.3 愈伤诱导
选取经预培养后无菌的外植体，放置在含有不同浓度（0.1、0.3、0.5 mol/L）的NAA和不同浓度（0.1、0.3、0.5 mol/L）的6-BA组合的MS培养基中，对外植体进行愈伤诱导，每瓶接种3个外植体，每组重复3瓶，即每组接种9个。
1.4 培养条件
以MS培养基为基础培养基，蔗糖30 g/L，琼脂8 g/L，pH调节为6左右，将灭菌好的幼茎节下端插入培养基中，暗培养1 d，然后置于光照强度1 000 lx、光照时间为12 h/d、温度为25 ℃、湿度为50%左右的条件下培养。
1.5 指标测定
外植体的消毒效果主要通过污染率和褐化率来体现，该研究接种5 d后统计幼茎节的污染率和褐化率，污染率=污染的外植体个数/接种的外植体个数×100%，褐化率=褐化的外植体个数/接种的外植体个数×100%，并观察幼茎节的生长情况。外植体的愈伤诱导情况主要由愈伤诱导率及愈伤的生长情况来体现，接种到愈伤培养基上30 d后统计愈伤诱导率，愈伤诱导率=产生愈伤的外植体个数/接种的外植体个数×100%，并观察愈伤生长情况。
1.6 数据处理 采用DPS 7.05进行Duncan’s新复极差法分析。
2 结果与分析
2.1 次氯酸钠消毒效果分析 不同浓度次氯酸钠处理不同时间对外植体污染率和褐化率的影响存在差异（表1），第2组10%次氯酸钠处理15 min的污染率和褐化率都与第1组差异极显著（P<0.01），生长较好。12%的次氯酸钠处理12 min 时的污染率和褐化率都最低，褐化率与第1组和第9组时差异极显著（P<0.01），污染率与第1、4、6、7组时的差异显著（P<0.05），但整体相对来说比10%的次氯酸钠更容易褐化。15%次氯酸钠处理12 min时污染率也低，但褐化率相对高。选用次氯酸钠作为表面消毒剂时浓度在10%更利于外植体灭菌和生长。
2.2 新洁尔灭消毒效果分析
不同浓度新洁尔灭处理不同时间对外植体污染率和褐化率的影响存在差异（表2），整体来看低浓度的新洁尔灭有助于降低褐化率，但灭菌效果不理想，污染率最低是第6组，此条件下的褐化率也较低。选用新洁尔灭作消毒剂时用浓度0.8%处理20 min较合适。
2.3 双氧水消毒效果分析
不同浓度双氧水处理不同时间，第8、9组污染率最低，与其他几组差异显著（P<0.05），12%双氧水处理8、10 min污染率和褐化率相对较低，外植体生长较好。选用双氧水作银杏幼茎节消毒剂时用12%双氧水处理8～10 min为宜（表3）。
2.4 银杏幼茎愈伤诱导试验结果
对外植体进行愈伤诱导试验，选用不同浓度的NAA和6-BA组合（表4），发现低浓度和高浓度生长调节剂都不利于愈伤的诱导，第1组和第2组未诱导出愈伤，第9组的愈伤较疏松，呈黄色，生长较缓慢;第3～8组愈伤诱导率都比较高，愈伤生长状态都比较好，第6组、7组和8组愈伤诱导率较高，较紧密，颜色呈黄绿色;第4组、5组愈伤紧密，呈绿色，更有利于芽的诱导（图1）。从数据分析看，NAA对愈伤的诱导要比6-BA的影响大，从该试验可以看出，0.3 mol/L NAA比0.1、0.5 mol/L的NAA诱导愈伤效果好一些。综合2种生长调节剂的影响，0.3 mol/L NAA和0.3 mol/L 6-BA的组合、0.3 mol/L NAA和0.5 mol/L 6-BA组合下银杏幼茎节的愈伤诱导效果相对较好。
3 结论
采集3月下旬到5月下旬生长状态基本一致、粗约2 mm的银杏母树当年生嫩枝茎节为外植体，切成每段长约1.5 cm，通过预处理后采用75%乙醇处理2 min，再用10%次氯酸钠处理15 min，12%次氯酸钠处理10 min或0.8%新洁尔灭处理20 min或12%双氧水处理8～10 min，处理效果较好。3种消毒剂中次氯酸钠控制污染率的效果最好，双氧水控制褐化率的效果最好，可采用75%乙醇处理2 min，12%双氧水处理8～10 min。在诱导愈伤组织的过程中，NAA较6-BA对愈伤诱导的效果影响更大，其中浓度为0.3 mol/L的NAA诱导愈伤的效果更好，2种生长调节剂结合使用时，0.3 mol/L NAA和0.3 mol/L 6-BA组合，0.3 mol/L NAA和0.5 mol/L 6-BA组合下银杏幼茎节的愈伤诱导率较高，愈伤生长情况较好，更有利于芽再生。
参考文献
[1] 郭长禄. 银杏再生体系建立和LEAFY基因表达、转化的研究[D].杭州：浙江大学，2004.
[2] 汪素娟，康安，狄留庆，等.银杏叶提取物主要活性成分药动学研究进展[J]. 中草药，2013，44（5）：626-631.
[3] 陈颖，曹福亮.银杏组培快繁和体胚发生技术研究进展[J].林业科技开发，2006，20（6）：10-14.
[4] 罗紫娟.银杏茎段的组织培养[J].植物生理学通讯，1985（1）：35-36.
[5] 罗言云，贾勇炯.银杏茎段的组织培养及其植株再生[J].四川大学学报（自然科学版），2001，38（3）：412-416.
[6] 陈颖，曹福亮，徐彩平，等.不同部位银杏茎段培养及位置效应的研究[J].浙江林业科技，2010，30（1）：28-31.
[7] 张德华，张占甲，陈坤明，等.银杏组织培养研究Ⅰ.不同培养条件对银杏愈伤组织形成的影响[J].西北植物学报，1994，14（6）：29-32.
[8] 郝岗平，杜希华，史仁玖，等.银杏幼嫩茎段培养诱导愈伤组织及其细胞学研究[J].西北植物学报，2003，23（4）：648-652.
[9] 胡蕙露，杨景华，杨荻荣，等.银杏茎段试管培养条件筛选研究[J].林业科学，2002，38（3）：52-56.
[10] 吕瑞芳，张晓红.病原生物与免疫学基础[M].北京：人民卫生出版社，2015：18-19.
[11] 陈华蕊，陈业渊，何书强，等.维多利亚菠萝组培快繁技术研究[J].中国南方果树，2016，45（6）：90-92.
[12] 王猛，李晓旭，张筝，等.马蹄金（Dichondra repens Forst.）组织培养和快速繁殖[J].分子植物育种，2020，18（10）：3331-3340.
[13] 余慧，丁彥芬，卓启苗，等.欧洲卫矛叶片愈伤组织诱导及培养[J].东北林业大学学报，2019，47（5）：19-24.
[14] 胡选萍，张晓娟，任鹏斌，等.不同激素对银杏愈伤组织黄酮积累的影响[J].中成药，2015，37（12）：2787-2790.
关键词 幼茎节;无菌接种;愈伤诱导
中图分类号 S723.1 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2020）19-0116-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.030
Abstract [Objective]To establish the tissue culture regeneration system of young stem nodes of Ginkgo biloba. [Method]Taking young stem nodes of annual G.biloba tree as explants，disinfection effect of different kinds，concentrations of disinfectants，treatment time on external implants，and different hormone conditions on callus induction were studied. [Result]The optimal inoculation conditions for explants were： after 75% alcohol treatment for 2 min，10% sodium hypochlorite treatment for 15 min and 12% sodium hypochlorite treatment for 10 min;0.8% bromogera mine for 20 min;12% hydrogen peroxide for 8-10 min; resulted in relatively low pollution rate and browning rate. In the hormone combination of 0.3 mol/L NAA and 0.3 mol/L 6-BA，0.3 mol/L NAA and 0.5 mol/L 6-BA，the callus induction rate of young stem nodes of G.biloba was higher and the callus growth was better. [Conclusion]This study established tissue culture regeneration system of G.biloba，which provided basis for its callus induction and further physiological studies.
Key words Young stem node;Aseptic inoculation;Callus induction
基金项目 广安职业技术学院校级重点科研项目（GAZYKY-2019A03）;四川省教育厅重点科研项目（18ZA0228）。
作者简介 喻娜（1986—），女，四川隆昌人，讲师，硕士，从事植物组织培养研究和教学工作。
收稿日期 2020-03-04
银杏（Ginkgo biloba L.）是银杏科、银杏属落叶乔木，因古老而稀少被誉为“活化石”[1]，又因其集观赏、食用、药用、生态环保于一体而受到人们的关注[2]。银杏传统的育苗方法为实生繁殖、扦插繁殖、嫁接繁殖等。但这些方法的繁殖率低、周期长，远不能满足市场的需求。如果想短期内得到大面积优良的银杏苗，组织培养技术是一种可行有效的方式。传统育种方式弊端的显现促使银杏的组织培养方面研究取得了一定进展，从不同外植体包括胚、茎段、子叶、胚轴、小孢子、配子体等方面都有相关研究[3]。总的来看，银杏组培最易成功的外植体首属茎段，茎段主要通过幼苗或者胚诱导的组培苗采集，幼茎的组培通过腋芽或嫩梢繁殖。罗紫娟[4]曾对银杏胚和茎段进行过组织培养，获得再生植株。罗言云等[5]用银杏无菌苗带腋芽的茎段为外植体，由带腋芽的茎段分化芽，分化出的芽再在培养基上分化根，并形成试管苗。通过组培的方式可以保持银杏母本的优良性状，但分化率小，不定芽数较少，繁殖速度较慢。陈颖等[6]以银杏成熟胚培养出的一个月月龄无菌幼苗各部位茎段为外植体，研究其顶芽、带腋芽的中段、带子叶的下段腋芽萌发和不定芽的分化情况时发现由胚诱导的组培苗茎段发生丛生芽的潜力最大。
以幼茎为外植体的研究多以0.1%升汞搭配75%乙醇进行消毒处理，几乎没有系统性地研究不同消毒剂对幼茎消毒的影响[7-9]。用于外植体灭菌的消毒剂种类很多，在实际应用中，外植体的消毒效果受消毒剂种类、浓度和处理时间及使用方法等多种因素的影响[10]。外植体的消毒效果直接影响银杏茎节愈伤组织诱导、丛生芽诱导等，系统性地对银杏幼茎节消毒效果研究为银杏组织培养奠定了基础。在植物组织培养过程中，6-BA、NAA、IBA等植物生长调节剂配比对多种植物的不同外植体愈伤诱导效果较好[11-13]，胡选萍等[14]在研究银杏幼茎、茎尖为外植体时萘乙酸、6-苄基腺嘌呤都有利于愈伤的诱导。该研究选择不同配比植物调节剂6-BA、NAA来研究银杏幼茎节愈伤的诱导，以期为银杏组培快繁及再生等生理学研究提供依据。 1 材料与方法
1.1 材料 采集3月下旬—5月下旬生长状态基本一致、粗约2 mm的银杏母树当年生嫩枝茎节为外植体，切成小段，每段长约1.5 cm，中上段带腋芽。
1.2 灭菌方法
剪取生长状态基本一致的银杏当年生枝条幼茎，连带茎段的长度约0.5 cm，放入含洗衣粉的三角瓶中充分摇晃，静止浸泡15 min，后在流水下冲洗30 min。在超净工作台上将冲洗干净的幼茎节放入75%乙醇中充分摇晃2 min，无菌水冲洗3遍;然后根据预试验分别放入不同浓度的消毒剂中处理不同时间：10%次氯酸钠分别处理10、15、20 min，12%次氯酸钠分别处理9、12、15 min ，15%次氯酸钠分别处理8、10、12 min;新洁尔灭（0.5%、0.8%、1.0%）分别处理10、15、20 min;5%的双氧水分别处理10、13、15 min，10%的双氧水分别处理8、10、12 min，12%的双氧水分别处理5、8、10 min。无菌水冲洗3遍，使用无菌滤纸吸干水分，接种于MS培养基上，每瓶接种7个茎节，每组重复3瓶，即每组接种21个。
1.3 愈伤诱导
选取经预培养后无菌的外植体，放置在含有不同浓度（0.1、0.3、0.5 mol/L）的NAA和不同浓度（0.1、0.3、0.5 mol/L）的6-BA组合的MS培养基中，对外植体进行愈伤诱导，每瓶接种3个外植体，每组重复3瓶，即每组接种9个。
1.4 培养条件
以MS培养基为基础培养基，蔗糖30 g/L，琼脂8 g/L，pH调节为6左右，将灭菌好的幼茎节下端插入培养基中，暗培养1 d，然后置于光照强度1 000 lx、光照时间为12 h/d、温度为25 ℃、湿度为50%左右的条件下培养。
1.5 指标测定
外植体的消毒效果主要通过污染率和褐化率来体现，该研究接种5 d后统计幼茎节的污染率和褐化率，污染率=污染的外植体个数/接种的外植体个数×100%，褐化率=褐化的外植体个数/接种的外植体个数×100%，并观察幼茎节的生长情况。外植体的愈伤诱导情况主要由愈伤诱导率及愈伤的生长情况来体现，接种到愈伤培养基上30 d后统计愈伤诱导率，愈伤诱导率=产生愈伤的外植体个数/接种的外植体个数×100%，并观察愈伤生长情况。
1.6 数据处理 采用DPS 7.05进行Duncan’s新复极差法分析。
2 结果与分析
2.1 次氯酸钠消毒效果分析 不同浓度次氯酸钠处理不同时间对外植体污染率和褐化率的影响存在差异（表1），第2组10%次氯酸钠处理15 min的污染率和褐化率都与第1组差异极显著（P<0.01），生长较好。12%的次氯酸钠处理12 min 时的污染率和褐化率都最低，褐化率与第1组和第9组时差异极显著（P<0.01），污染率与第1、4、6、7组时的差异显著（P<0.05），但整体相对来说比10%的次氯酸钠更容易褐化。15%次氯酸钠处理12 min时污染率也低，但褐化率相对高。选用次氯酸钠作为表面消毒剂时浓度在10%更利于外植体灭菌和生长。
2.2 新洁尔灭消毒效果分析
不同浓度新洁尔灭处理不同时间对外植体污染率和褐化率的影响存在差异（表2），整体来看低浓度的新洁尔灭有助于降低褐化率，但灭菌效果不理想，污染率最低是第6组，此条件下的褐化率也较低。选用新洁尔灭作消毒剂时用浓度0.8%处理20 min较合适。
2.3 双氧水消毒效果分析
不同浓度双氧水处理不同时间，第8、9组污染率最低，与其他几组差异显著（P<0.05），12%双氧水处理8、10 min污染率和褐化率相对较低，外植体生长较好。选用双氧水作银杏幼茎节消毒剂时用12%双氧水处理8～10 min为宜（表3）。
2.4 银杏幼茎愈伤诱导试验结果
对外植体进行愈伤诱导试验，选用不同浓度的NAA和6-BA组合（表4），发现低浓度和高浓度生长调节剂都不利于愈伤的诱导，第1组和第2组未诱导出愈伤，第9组的愈伤较疏松，呈黄色，生长较缓慢;第3～8组愈伤诱导率都比较高，愈伤生长状态都比较好，第6组、7组和8组愈伤诱导率较高，较紧密，颜色呈黄绿色;第4组、5组愈伤紧密，呈绿色，更有利于芽的诱导（图1）。从数据分析看，NAA对愈伤的诱导要比6-BA的影响大，从该试验可以看出，0.3 mol/L NAA比0.1、0.5 mol/L的NAA诱导愈伤效果好一些。综合2种生长调节剂的影响，0.3 mol/L NAA和0.3 mol/L 6-BA的组合、0.3 mol/L NAA和0.5 mol/L 6-BA组合下银杏幼茎节的愈伤诱导效果相对较好。
3 结论
采集3月下旬到5月下旬生长状态基本一致、粗约2 mm的银杏母树当年生嫩枝茎节为外植体，切成每段长约1.5 cm，通过预处理后采用75%乙醇处理2 min，再用10%次氯酸钠处理15 min，12%次氯酸钠处理10 min或0.8%新洁尔灭处理20 min或12%双氧水处理8～10 min，处理效果较好。3种消毒剂中次氯酸钠控制污染率的效果最好，双氧水控制褐化率的效果最好，可采用75%乙醇处理2 min，12%双氧水处理8～10 min。在诱导愈伤组织的过程中，NAA较6-BA对愈伤诱导的效果影响更大，其中浓度为0.3 mol/L的NAA诱导愈伤的效果更好，2种生长调节剂结合使用时，0.3 mol/L NAA和0.3 mol/L 6-BA组合，0.3 mol/L NAA和0.5 mol/L 6-BA组合下银杏幼茎节的愈伤诱导率较高，愈伤生长情况较好，更有利于芽再生。
参考文献
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[4] 罗紫娟.银杏茎段的组织培养[J].植物生理学通讯，1985（1）：35-36.
[5] 罗言云，贾勇炯.银杏茎段的组织培养及其植株再生[J].四川大学学报（自然科学版），2001，38（3）：412-416.
[6] 陈颖，曹福亮，徐彩平，等.不同部位银杏茎段培养及位置效应的研究[J].浙江林业科技，2010，30（1）：28-31.
[7] 张德华，张占甲，陈坤明，等.银杏组织培养研究Ⅰ.不同培养条件对银杏愈伤组织形成的影响[J].西北植物学报，1994，14（6）：29-32.
[8] 郝岗平，杜希华，史仁玖，等.银杏幼嫩茎段培养诱导愈伤组织及其细胞学研究[J].西北植物学报，2003，23（4）：648-652.
[9] 胡蕙露，杨景华，杨荻荣，等.银杏茎段试管培养条件筛选研究[J].林业科学，2002，38（3）：52-56.
[10] 吕瑞芳，张晓红.病原生物与免疫学基础[M].北京：人民卫生出版社，2015：18-19.
[11] 陈华蕊，陈业渊，何书强，等.维多利亚菠萝组培快繁技术研究[J].中国南方果树，2016，45（6）：90-92.
[12] 王猛，李晓旭，张筝，等.马蹄金（Dichondra repens Forst.）组织培养和快速繁殖[J].分子植物育种，2020，18（10）：3331-3340.
[13] 余慧，丁彥芬，卓启苗，等.欧洲卫矛叶片愈伤组织诱导及培养[J].东北林业大学学报，2019，47（5）：19-24.
[14] 胡选萍，张晓娟，任鹏斌，等.不同激素对银杏愈伤组织黄酮积累的影响[J].中成药，2015，37（12）：2787-2790.