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摘要以麻蝇成虫为材料,利用溶解度的不同,分别用硫酸铵、氯化钠、乙醇、氢氧化钠从脱脂麻蝇粉中分离、纯化获得清蛋白、小分子肽、球蛋白、醇溶蛋白和碱溶性蛋白等几类蛋白。测定蛋白质含量,并用亲和层析法纯化凝集素,通过SDS—PAGE凝胶电泳测定各类蛋白的相对分子质量。结果表明:脱脂麻蝇粉蛋白质的主要成分是清蛋白、球蛋白和小分子肽;蛋白质得率为44.94%,回收率为85.6%,凝集素的相对分子质量为82.9KD,血凝活力效价为1/104。
关键词麻蝇全蛋白凝集素
中图分类号:Q96文献标识码:A
麻蝇是双翅目麻蝇科昆虫。据国内外对蝇蛆营养成分的分析显示,蝇蛆含粗蛋白59%～65%,超过粮食与农业组织(FAO)与世界卫生组织(WHO)提出的参考值(40%);其必需氨基酸与非必需氨基酸总量的比值(E/N)为0.78,超过FAO与WHO提出的参考值(0.6),还含有10%-16%的脂肪,8%-10%的甲壳素和多种维生素、微量元素等营养成分,是一种重要的饲料蛋白资源。VanderKnaap等人认为凝集素能够结合细菌细胞壁上的糖链结构,从而使细胞破壁,达到杀灭细菌细胞的作用。而且蝇蛆中的抗菌物质等活性蛋白质还有不同的重要药用价值。
目前,在昆虫蛋白质的提取制备方面,对蚕蛹、家蝇进行了一些研究,而麻蝇的全蛋白分析则很少,为此,本研究对麻蝇成虫蛋白质的提取制备方法和工艺参数等进行研究,并对麻蝇全蛋白分析及凝集素的纯化与鉴定,目的是为更进一步地规模化开发和利用蝇蛆打下基础,也对其它昆虫的蛋白质分析起到一定的借鉴作用。
1 实验材料与方法
1.1 实验材料
麻蝇的成虫(江西思达生物技术有限公司提供);兔血取自新西兰大白兔(南昌大学动物研究所提供)。试剂:标准蛋白Marker,琼脂糖凝胶-4B,牛血清白蛋白,丙烯酰胺、双丙烯酰胺、甘氨酸、硫酸铵等。仪器:索式提取器,紫外分光光度计,垂直板电泳仪,高速离心机等。
1.2 实验方法
1.2.1 麻蝇成虫的处理
(1)将成虫烘干,并粉碎成粉末状(过180目筛)。(2)索氏脂肪抽提法浸提麻蝇油脂:用滤纸将4g粉末分批包好,放入索式提取器内用石油醚抽提脂肪。4h后,脂肪已提取完全,并将抽提后的蝇粉烘干、冷却、称重、计算。抽脂后的麻蝇粉待用。(3)取1.2g抽脂后的麻蝇粉,加入20ml缓冲液搅拌均匀,在4℃下提取10h,用匀浆器匀浆后,再12000r/min离心15min,得上清液及剩余物,将剩余物重复上述操作。合并两上清液,得上清液26ml。取0.5ml上清液,用Bradford检测法测其蛋白质含量(所制作标准曲线见图1)。其余上清液和剩余物备用。
1.2.2 麻蝇成虫各蛋白组分的制备及其含量测定
(1)清蛋白和小分子肽(硫酸铵沉淀)。取25ml上清液,以盐析温度、pH值、硫酸铵浓度和时间为实验因素,采用L25(54)正交法进行实验(表1),以所得蛋白含量为指标,确定最佳工艺参数。
按表2加入硫酸铵至所需浓度,调pH值,在一定温度条件下盐析一定时间,离心,沉淀即为清蛋白,上清用旋转蒸发仪蒸发浓缩得小分子肽,测其蛋白含量。
(2)球蛋白。在经过蒸馏水提取后的剩余物中加入10%的氯化钠搅拌,静置,离心,取上清液,重提3次合并上清液。用旋转蒸发仪浓缩,测其蛋白含量。
(3)醇溶蛋白、碱溶蛋白和难溶蛋白。在经过氯化钠提取后的剩余物中依次加无水乙醇,2%的NaOH,提取和测定方法同(2),分别提取醇溶蛋白、碱溶蛋白和难溶蛋白,并分别测定其含量。所得残渣烘干称重。
上述所得蛋白全部用葡聚糖凝胶G-10过滤后放入透析袋中,用聚乙二醇6000浓缩到适当浓度备用。
1.2.3 麻蝇凝集素的纯化
(1)凝集素的纯化方法。取约10g新鲜成虫加入昆虫缓冲溶液(BIS)和少量的苯硫脲充分研磨,于4℃离心,重复3次,除去上层漂浮的脂肪层,保留上清液。将上清液与Sepharose-4B混合3h后装柱,用BIS以1ml/min的流量洗脱杂蛋白,至280nm吸光度小于0.02时停止,用0.2mol/L的D-半乳糖解吸,流量为1ml/min,收集吸收峰,并将层析后的溶液装入透析袋中透析,脱盐后冻干,得淡黄色凝集素,备用。
(2)血凝活力(HA)的测定。在V形血凝板上,用PBS缓冲液0.5ml对己纯化的麻蝇凝集素0.5ml进行倍比稀释,每管分别加入2%血球悬液0.5ml,振荡1min,在室温静置1h,显微镜观察凝血现象,测定其效价。效价定义为:最后一个发生可见凝集反应的样品稀释倍数的倒数。
1.2.4 SDS-PAGE凝胶电泳鉴定麻蝇成虫各蛋白组分和凝集素。
电泳实验步骤:取适量上述所制取各蛋白组分和凝集素,参照《蛋白质技术手册》进行。其中分离胶浓度为15%,堆积胶浓度为5%,开始电压80V,进入分离胶后电压调至160V,至溴酚蓝距离凝胶底部1cm时停止,用R-250染色。电泳图谱见图2。
2 结果与分析
2.1 硫酸铵沉淀最佳工艺参数的筛选
由正交实验(表2)可知,硫酸铵浓度对麻蝇成虫盐析所得蛋白量影响最大,其它条件依次为pH值、温度、时间,因此因素主次关系为C>B>A>D。而且温度、pH值、硫酸铵浓度、时间的最大均值分别为均值1、均值1、均值3、均值4。因此,盐析的最优组合为A1B1C3D4,即麻蝇成虫蛋白提取工艺的参数以温度4℃、pH4、硫酸铵浓度70%、时间7h所提取的蛋白得率最高。
2.2 蝇蛆蛋白各组分含量的分析
根据蛋白质溶解度不同的性质,可将麻蝇成虫蛋白分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白和难溶蛋白。各蛋白组分的分布情况见表3。由表3可知,脱脂成虫粉中的蛋白质以清蛋白、小分子肽、和球蛋白为主。脱脂成虫粉中的蛋白含量为52.5%,而提取出的各类蛋白总量为44.94%,脂肪含量为12.75%,可见利用溶解度不同的方法从脱脂麻蝇成虫粉中提取蛋白的提取率可达到85.6%。
2.3 麻蝇成虫各蛋白组分和凝集素的分析
图2中从右到左分别为蛋白质标准量、凝集素、醇溶蛋白、碱溶蛋白、难溶蛋白、球蛋白、清蛋白和小分子肽的电泳图。由图2可以看出,本试验所得麻蝇成虫主要蛋白的分子量为84KD,还有少部分蛋白质的分子量为32-66.2KD。凝集素由三个亚基组成,分子量分别为34.9KD、29.4KD、18.6KD,血凝活力的效价为1/104。
3 讨论
本研究所得麻蝇成虫的脂肪含量为12.75%,脱脂粉的蛋白含量为52.5%,提取的蛋白含量为44.94%,利用溶解度不同和盐析的方法从脱脂麻蝇成虫粉中提取蛋白的提取率为85.6%,比王芙蓉的提取率低5.11个百分点,得率的差异可能与蝇蛆的品种有关,也可能是所用的方法不同。
以硫酸铵作为蛋白质盐析的中性盐,用L25(54)正交实验确定出盐析最佳参数为:温度4℃、pH4、硫酸铵浓度70%、时间7h,获得了较高的得率。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳确定麻蝇成虫主要蛋白的分子量为84KD,还有少部分蛋白质的分子量为32-66.2KD。凝集素由三个亚基组成,分子量分别为34.9KD,29.4KD,18.6KD,其血凝活力的效价为1/104。
关键词麻蝇全蛋白凝集素
中图分类号:Q96文献标识码:A
麻蝇是双翅目麻蝇科昆虫。据国内外对蝇蛆营养成分的分析显示,蝇蛆含粗蛋白59%～65%,超过粮食与农业组织(FAO)与世界卫生组织(WHO)提出的参考值(40%);其必需氨基酸与非必需氨基酸总量的比值(E/N)为0.78,超过FAO与WHO提出的参考值(0.6),还含有10%-16%的脂肪,8%-10%的甲壳素和多种维生素、微量元素等营养成分,是一种重要的饲料蛋白资源。VanderKnaap等人认为凝集素能够结合细菌细胞壁上的糖链结构,从而使细胞破壁,达到杀灭细菌细胞的作用。而且蝇蛆中的抗菌物质等活性蛋白质还有不同的重要药用价值。
目前,在昆虫蛋白质的提取制备方面,对蚕蛹、家蝇进行了一些研究,而麻蝇的全蛋白分析则很少,为此,本研究对麻蝇成虫蛋白质的提取制备方法和工艺参数等进行研究,并对麻蝇全蛋白分析及凝集素的纯化与鉴定,目的是为更进一步地规模化开发和利用蝇蛆打下基础,也对其它昆虫的蛋白质分析起到一定的借鉴作用。
1 实验材料与方法
1.1 实验材料
麻蝇的成虫(江西思达生物技术有限公司提供);兔血取自新西兰大白兔(南昌大学动物研究所提供)。试剂:标准蛋白Marker,琼脂糖凝胶-4B,牛血清白蛋白,丙烯酰胺、双丙烯酰胺、甘氨酸、硫酸铵等。仪器:索式提取器,紫外分光光度计,垂直板电泳仪,高速离心机等。
1.2 实验方法
1.2.1 麻蝇成虫的处理
(1)将成虫烘干,并粉碎成粉末状(过180目筛)。(2)索氏脂肪抽提法浸提麻蝇油脂:用滤纸将4g粉末分批包好,放入索式提取器内用石油醚抽提脂肪。4h后,脂肪已提取完全,并将抽提后的蝇粉烘干、冷却、称重、计算。抽脂后的麻蝇粉待用。(3)取1.2g抽脂后的麻蝇粉,加入20ml缓冲液搅拌均匀,在4℃下提取10h,用匀浆器匀浆后,再12000r/min离心15min,得上清液及剩余物,将剩余物重复上述操作。合并两上清液,得上清液26ml。取0.5ml上清液,用Bradford检测法测其蛋白质含量(所制作标准曲线见图1)。其余上清液和剩余物备用。
1.2.2 麻蝇成虫各蛋白组分的制备及其含量测定
(1)清蛋白和小分子肽(硫酸铵沉淀)。取25ml上清液,以盐析温度、pH值、硫酸铵浓度和时间为实验因素,采用L25(54)正交法进行实验(表1),以所得蛋白含量为指标,确定最佳工艺参数。
按表2加入硫酸铵至所需浓度,调pH值,在一定温度条件下盐析一定时间,离心,沉淀即为清蛋白,上清用旋转蒸发仪蒸发浓缩得小分子肽,测其蛋白含量。
(2)球蛋白。在经过蒸馏水提取后的剩余物中加入10%的氯化钠搅拌,静置,离心,取上清液,重提3次合并上清液。用旋转蒸发仪浓缩,测其蛋白含量。
(3)醇溶蛋白、碱溶蛋白和难溶蛋白。在经过氯化钠提取后的剩余物中依次加无水乙醇,2%的NaOH,提取和测定方法同(2),分别提取醇溶蛋白、碱溶蛋白和难溶蛋白,并分别测定其含量。所得残渣烘干称重。
上述所得蛋白全部用葡聚糖凝胶G-10过滤后放入透析袋中,用聚乙二醇6000浓缩到适当浓度备用。
1.2.3 麻蝇凝集素的纯化
(1)凝集素的纯化方法。取约10g新鲜成虫加入昆虫缓冲溶液(BIS)和少量的苯硫脲充分研磨,于4℃离心,重复3次,除去上层漂浮的脂肪层,保留上清液。将上清液与Sepharose-4B混合3h后装柱,用BIS以1ml/min的流量洗脱杂蛋白,至280nm吸光度小于0.02时停止,用0.2mol/L的D-半乳糖解吸,流量为1ml/min,收集吸收峰,并将层析后的溶液装入透析袋中透析,脱盐后冻干,得淡黄色凝集素,备用。
(2)血凝活力(HA)的测定。在V形血凝板上,用PBS缓冲液0.5ml对己纯化的麻蝇凝集素0.5ml进行倍比稀释,每管分别加入2%血球悬液0.5ml,振荡1min,在室温静置1h,显微镜观察凝血现象,测定其效价。效价定义为:最后一个发生可见凝集反应的样品稀释倍数的倒数。
1.2.4 SDS-PAGE凝胶电泳鉴定麻蝇成虫各蛋白组分和凝集素。
电泳实验步骤:取适量上述所制取各蛋白组分和凝集素,参照《蛋白质技术手册》进行。其中分离胶浓度为15%,堆积胶浓度为5%,开始电压80V,进入分离胶后电压调至160V,至溴酚蓝距离凝胶底部1cm时停止,用R-250染色。电泳图谱见图2。
2 结果与分析
2.1 硫酸铵沉淀最佳工艺参数的筛选
由正交实验(表2)可知,硫酸铵浓度对麻蝇成虫盐析所得蛋白量影响最大,其它条件依次为pH值、温度、时间,因此因素主次关系为C>B>A>D。而且温度、pH值、硫酸铵浓度、时间的最大均值分别为均值1、均值1、均值3、均值4。因此,盐析的最优组合为A1B1C3D4,即麻蝇成虫蛋白提取工艺的参数以温度4℃、pH4、硫酸铵浓度70%、时间7h所提取的蛋白得率最高。
2.2 蝇蛆蛋白各组分含量的分析
根据蛋白质溶解度不同的性质,可将麻蝇成虫蛋白分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白和难溶蛋白。各蛋白组分的分布情况见表3。由表3可知,脱脂成虫粉中的蛋白质以清蛋白、小分子肽、和球蛋白为主。脱脂成虫粉中的蛋白含量为52.5%,而提取出的各类蛋白总量为44.94%,脂肪含量为12.75%,可见利用溶解度不同的方法从脱脂麻蝇成虫粉中提取蛋白的提取率可达到85.6%。
2.3 麻蝇成虫各蛋白组分和凝集素的分析
图2中从右到左分别为蛋白质标准量、凝集素、醇溶蛋白、碱溶蛋白、难溶蛋白、球蛋白、清蛋白和小分子肽的电泳图。由图2可以看出,本试验所得麻蝇成虫主要蛋白的分子量为84KD,还有少部分蛋白质的分子量为32-66.2KD。凝集素由三个亚基组成,分子量分别为34.9KD、29.4KD、18.6KD,血凝活力的效价为1/104。
3 讨论
本研究所得麻蝇成虫的脂肪含量为12.75%,脱脂粉的蛋白含量为52.5%,提取的蛋白含量为44.94%,利用溶解度不同和盐析的方法从脱脂麻蝇成虫粉中提取蛋白的提取率为85.6%,比王芙蓉的提取率低5.11个百分点,得率的差异可能与蝇蛆的品种有关,也可能是所用的方法不同。
以硫酸铵作为蛋白质盐析的中性盐,用L25(54)正交实验确定出盐析最佳参数为:温度4℃、pH4、硫酸铵浓度70%、时间7h,获得了较高的得率。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳确定麻蝇成虫主要蛋白的分子量为84KD,还有少部分蛋白质的分子量为32-66.2KD。凝集素由三个亚基组成,分子量分别为34.9KD,29.4KD,18.6KD,其血凝活力的效价为1/104。