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【摘 要】 目的：建立黑冰片、黑冰片-10味散、十味黑冰片丸中重金属铅、镉、铜、汞及砷的含量测定方法。方法：样品经微波消解处理后，以电感耦合等离子体质谱仪测定砷、铅、镉、铜元素的含量，原子荧光光度计测定汞元素含量。结果：该检测方法的回收率在84.87%～98.86%之间，RSD<5 %，测得黑冰片和两种成药中重金属及有害元素总含量在17.65～77.82mg/kg之间。结论：参考《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》规定，黑冰片及其成药中四种重金属及砷均存在超标现象。该检测方法具有较好精密度、重复性，可为黑冰片及其成药的质量标准研究和临床用药安全提供科学依据。
【關键词】 黑冰片;黑冰片-10味散;十味黑冰片丸;微波消解;含量测定
【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2019）3-0017-04
Abstract：Objective To establishthe determination method of the contents of heavy metal （Pb， Cd， Cu， Hg） and harmful element （As） in Heibingpian， heibingpian-10 wei pulvis， shiwei heibingpian pills. Method The samples were treated by microwave digestion， then the contents of Pb， Cd， Cu， As were determined by inductively coupled plasma mass spectrometry， the content of Hg was determined by atomic fluorescence spectrophotometer. Result The recovery rate of the methods were between 84.87%～98.86%， RSD<5%， The heavy metal andarsenic of contents of heibingpian and its preparations ranged from 17.648 to 77.820mg/kg. Conclusion Based to 《The Professional Import and Export Stands for Medicinal Herbs and Preparations》， the contents of Pb， Cd， Cu， Hg， As in Heibingpian and its preparations are overweighted. Totally， the methods are precise， repeatable， and suitable for the quality control of heibingpian and its preparation.
Keywords：Heibingpian; Heibingpian-10 wei pulvis; Shiwei Heibingpian Pills; Microwave Digestion; Content Determination
黑冰片为猪科动物野猪Sus Scrofa Linnaeus 的干燥粪便，颜色乌黑发亮，质地松脆，气微，味辛涩苦，有健胃、消食、平息“希日”的功效，用于治疗消化不良，寒性胆病及其引起的胃脘肿痛、黄疸、瘟疫等病症，最早载于《四部医典》[1]，现被《中国民族药辞典》[2]收录。黑冰片在中医、蒙医和藏医中广泛使用，蒙医代表方黑冰片-10味散（含黑冰片22.8%），蒙名哈日—嘎布日-10，由黑冰片、木鳖子、金诃子、止泻子等配方而成，具有抑赫依、希拉、助消化的功效，主治消化不良、口苦、嗳气、胃胀痛等病症[3];藏医代表方有十味黑冰片丸（含黑冰片27.45%），藏药名为卡那久巴日布，由黑冰片、荜茇、波棱瓜子、熊胆等十味药组成，具有温胃消食、破积利胆的功效，用于龙病、食积不化、恶心、培根痞瘤、胆囊炎、胆结石、寒性胆病及黄疸等的治疗[4]。
目前黑冰片及其成药的各项质量控制标准正在探索之中，并建立了一些质量控制方法，如利用分光光度计测定黑冰片吸附柠檬黄的吸收度以评价其吸附性能[5]，并对黑冰片中铁、铅等无机元素进行测定[6-7]，采用高效液相色谱法测定十味黑冰片丸中重要活性成分没食子酸[8]、桂皮醛[9]等以控制其质量。但尚无对黑冰片及其成药中各种重金属和有害元素砷的含量进行研究。现代研究证明，铅、镉、铜、汞、砷五种元素的积蓄性中毒会引起人体内各系统功能失调[10]。作为临床常用药，黑冰片及其成药的重金属及有害元素含量测定的研究迫在眉睫。本试验采用微波消解法对采集到的黑冰片及其自制成药样品进行前处理，以电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法测定铅、镉、铜、砷元素的含量，原子荧光光度法测定汞元素含量。为相关药材饮片及其成药的制备工艺和安全性评价提供科学依据。
1 材料与仪器
1.1 材料 超纯水（电导率为18.25MΩ.cm）、过氧化氢溶液（成都金山化学试剂有限公司，分析纯级）、硝酸溶液（成都金山化学试剂有限公司，优级纯）。镉、铜、铅、汞、砷、铋、锗、铟标准溶液均购自山东省冶金科学研究院标准样品研究院。试验所用黑冰片饮片样品来源于西藏拉萨，成药则是按照文献处方制剂而成，处方中其它饮片均购于九洲大药房。
1.2 仪器 AL104电子天平（Mettler-Toledo），DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），WP-UPT-10超纯水机（四川沃特尔水处理设备有限公司），PF6-2非色散原子荧光光度计（北京普析通用仪器有限公司），MD6M微波消解仪（APL），ICP-Qc型电感耦合等离子体质谱仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）。 2 方法与结果
2.1 供试品的制备 将供试品置于恒温60 ℃的烘箱，烘2h[11]，精密称取供试品约0.5g，置于微波消解罐中，加硝酸-30% 过氧化氢（V/V 7∶3）的混酸溶液共10mL，密闭，置于微波消解仪中按表1消解程序进行消解。微波消解结束后，冷却取出，挥去浓烟，用超纯水将消解液转入50mL量瓶中，用超纯水洗涤消解罐3次，洗液并入量瓶中，用超纯水定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。同法制备空白溶液。
2.2 标准曲线及检出限 以1 %硝酸溶液稀释配制含Pb、As、Cd为 0.2、1、5、10、20、50ng/mL，含Cu为1、5、10、20、50、100ng/mL的系列浓度混合溶液[13]，以超纯水稀释配制Bi、In、Ge 浓度均为1μg/mL的混合內标液[14]，并使用ICP-MS测定标准曲线;以1 %硝酸溶液稀释配制含Hg为0.05、0.1、0.5、1、2、5ng/mL的系列浓度溶液，使用非色散原子荧光光度计测定。对试剂空白进行11次测定[15]，以待测元素响应值的3倍标准偏差除以标准曲线斜率，即可得该元素的方法检出限，结果详见表2。
2.3 精密度试验 取编号为“S1”的黑冰片样品微波消解后，分别连续测定6次，测定各元素RSD范围均在1.42 %～2.66 %之间。
2.4 重复性试验 取编号为“S1”的黑冰片样品微波消解后，平行6份，按“2.1”项下前处理方法进行消解，得到6份供试液，测定各元素RSD范围均在1.27 %～ 4.11 %之间。
2.5 稳定性试验 取编号为“S1”的黑冰片样品微波消解后，每隔4h测定一次共测6次。供试品溶液中各元素RSD范围均在0.96%～ 4.91%之间，表明消解方法所得的供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.6 加样回收试验 对已知含量的编号为“S1”的黑冰片样品作加样回收试验。按“2.1”项下方法进行前处理，得到6份供试液作回收率试验。由表3微波消解测定5种元素的回收率在84.87%～98.86%之间，RSD≤5 %， 表明方法准确可靠。
2.7 ICP-MS法含量测定 精密称取各个批次的黑冰片、黑冰片-10味散、十味黑冰片丸样品，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按表4工作参数，平行测定3次。测得As、Pb、Cd、Cu元素的含量，测定结果见表5～7。
2.8 Hg含量测定 精密称取各个批次的黑冰片、黑冰片-10味散、十味黑冰片丸样品，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，用非色散原子荧光光度计平行测3次，测得Hg元素含量，测定结果见表5～7。
3 分析与讨论
根据《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》[16]（WM/T22004）中规定砷（As）≤2.0mg/kg，铅（Pb）≤5.0mg/kg，镉（Cd）≤0.3mg/kg，汞（Hg）≤0.2mg/kg，铜（Cu）≤20.0mg/kg。对比黑冰片、黑冰片-10味散、十味黑冰片丸中重金属及有害元素砷的含量，黑冰片中砷、铅、汞、镉、铜均大幅超标，而成药则超标较少。药材黑冰片在经过正确的配伍、制剂后出现了重金属及有害元素含量降低的情况，且黑冰片中重金属及有害元素的总含量约为黑冰片-10味散总含量的四倍，这与黑冰片在该制剂中稀释倍数基本相符。由此判断黑冰片是制剂中引入重金属及有害元素砷的主要因素。有研究证明，黑冰片对大鼠长期使用并无毒性作用[17]，但作为野猪粪便经过高温碳化所得药材饮片，黑冰片不易采集，患者顺应性差，且具体药理作用尚未完全确定，所以使用其它药材替代黑冰片的必要性值得进一步研究。
本试验建立了黑冰片重金属及有害元素砷的含量测定方法，具有较好的精密度、重复性、稳定性，且回收率试验结果中RSD均小于5 %，测定结果准确可靠，满足检测要求，可作为黑冰片中重金属及有害元素测定的方法。同时对黑冰片-10味散、十味黑冰片丸中重金属的来源作了讨论，基于其中重金属和砷的含量过高，而且黑冰片资源相对匮乏、采集不便且难以控制内在质量，有必要对相关制剂中黑冰片替代必要性进行研究。
参考文献
[1]宇妥·元丹贡布. 四部医典[M]. 上海： 上海科学技术出版社， 1987.
[2]贾敏如，张艺. 中国民族药辞典[M]. 北京： 中华医学电子音像出版社， 2016.
[3]斯庆图娜拉，李咏梅，刘磊. 蒙药五味清浊散和十味黑冰片散抗幽门螺杆菌的实验研究[J].中国实验诊断学， 2016， 20（9）：1546-1547.
[4]仁青东主， 华青措， 斗周才让，等. 藏药复方治疗慢性萎缩性胃炎的疗效与机理探析[J]. 中华中医药学刊， 2016， 34（11）：2577-2579.
[5]常亮， 董珉翔， 刘静. 黑冰片质量控制的研究[J]. 中国民族医药杂志， 2016， 22（12）：21-22.
[6]王玉光. 用分光光度法测定蒙药黑冰片中的铁的含量[J]. 内蒙古财经学院学报（综合版）， 2009， 7（6）：86-88.
[7]徐秀廷， 阿力塔， 左明辉， 等. 蒙药炮制对黑冰片铅含量影响[J]. 光谱实验室， 2007（3）：351-353.
[8]阿召， 何强， 张雪菊. 十味黑冰片丸中没食子酸含量HPLC测定方法[J]. 西部中医药， 2013， 26（9）：42-44.
[9]冯尚红， 刘海红， 虎延龙. HPLC法测定十味黑冰片丸中桂皮醛的含量[J]. 北方药学， 2013， 10（5）：12-13.
[10]刘静， 李树先， 朱江， 等. 浅谈几种重金属元素对人体的危害及其预防措施[J]. 中国资源综合利用， 2018， 36（03）：182-184.
[11]国家药典委员会. 中华人民共和国药典（四部） [M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2015： 205.
[12]何雯菁， 杨曙明， 薛佳俐， 等. 集约化猪场污染物中铜、锌、铬、砷、铅的检测[J]. 农产品质量与安全， 2018（2）：66-70.
[13]姜涛， 施枝江， 陈林明，等. ICP-MS法测定不同产地莲子及莲子不同部位中5种重金属元素含量[J]. 亚太传统医药， 2018（10）：55-58.
[14]郑明， 金情政， 胡卫南， 等. ICP-MS法同时测定半夏糖浆中6种重金属元素的含量[J]. 中国药师， 2018， 21（9）：1672-1674.
[15]符传武， 李玲. 微波消解ICP-MS法测定壮药美巧杯中5种重金属的含量[J]. 中国民族民间医药， 2014 （21）：20-22.
[16]WM2-2001.药用植物及制剂进出口绿色行业标准[S].北京：中国标准出版社，2001.
[17]李瑞萍， 常亮， 白音夫. 蒙药黑冰片对大鼠长期毒性作用[J]. 中国民族医药杂志， 2011， 17（4）： 53.
（收稿日期：2018-11-27 编辑：程鹏飞）
【關键词】 黑冰片;黑冰片-10味散;十味黑冰片丸;微波消解;含量测定
【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2019）3-0017-04
Abstract：Objective To establishthe determination method of the contents of heavy metal （Pb， Cd， Cu， Hg） and harmful element （As） in Heibingpian， heibingpian-10 wei pulvis， shiwei heibingpian pills. Method The samples were treated by microwave digestion， then the contents of Pb， Cd， Cu， As were determined by inductively coupled plasma mass spectrometry， the content of Hg was determined by atomic fluorescence spectrophotometer. Result The recovery rate of the methods were between 84.87%～98.86%， RSD<5%， The heavy metal andarsenic of contents of heibingpian and its preparations ranged from 17.648 to 77.820mg/kg. Conclusion Based to 《The Professional Import and Export Stands for Medicinal Herbs and Preparations》， the contents of Pb， Cd， Cu， Hg， As in Heibingpian and its preparations are overweighted. Totally， the methods are precise， repeatable， and suitable for the quality control of heibingpian and its preparation.
Keywords：Heibingpian; Heibingpian-10 wei pulvis; Shiwei Heibingpian Pills; Microwave Digestion; Content Determination
黑冰片为猪科动物野猪Sus Scrofa Linnaeus 的干燥粪便，颜色乌黑发亮，质地松脆，气微，味辛涩苦，有健胃、消食、平息“希日”的功效，用于治疗消化不良，寒性胆病及其引起的胃脘肿痛、黄疸、瘟疫等病症，最早载于《四部医典》[1]，现被《中国民族药辞典》[2]收录。黑冰片在中医、蒙医和藏医中广泛使用，蒙医代表方黑冰片-10味散（含黑冰片22.8%），蒙名哈日—嘎布日-10，由黑冰片、木鳖子、金诃子、止泻子等配方而成，具有抑赫依、希拉、助消化的功效，主治消化不良、口苦、嗳气、胃胀痛等病症[3];藏医代表方有十味黑冰片丸（含黑冰片27.45%），藏药名为卡那久巴日布，由黑冰片、荜茇、波棱瓜子、熊胆等十味药组成，具有温胃消食、破积利胆的功效，用于龙病、食积不化、恶心、培根痞瘤、胆囊炎、胆结石、寒性胆病及黄疸等的治疗[4]。
目前黑冰片及其成药的各项质量控制标准正在探索之中，并建立了一些质量控制方法，如利用分光光度计测定黑冰片吸附柠檬黄的吸收度以评价其吸附性能[5]，并对黑冰片中铁、铅等无机元素进行测定[6-7]，采用高效液相色谱法测定十味黑冰片丸中重要活性成分没食子酸[8]、桂皮醛[9]等以控制其质量。但尚无对黑冰片及其成药中各种重金属和有害元素砷的含量进行研究。现代研究证明，铅、镉、铜、汞、砷五种元素的积蓄性中毒会引起人体内各系统功能失调[10]。作为临床常用药，黑冰片及其成药的重金属及有害元素含量测定的研究迫在眉睫。本试验采用微波消解法对采集到的黑冰片及其自制成药样品进行前处理，以电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法测定铅、镉、铜、砷元素的含量，原子荧光光度法测定汞元素含量。为相关药材饮片及其成药的制备工艺和安全性评价提供科学依据。
1 材料与仪器
1.1 材料 超纯水（电导率为18.25MΩ.cm）、过氧化氢溶液（成都金山化学试剂有限公司，分析纯级）、硝酸溶液（成都金山化学试剂有限公司，优级纯）。镉、铜、铅、汞、砷、铋、锗、铟标准溶液均购自山东省冶金科学研究院标准样品研究院。试验所用黑冰片饮片样品来源于西藏拉萨，成药则是按照文献处方制剂而成，处方中其它饮片均购于九洲大药房。
1.2 仪器 AL104电子天平（Mettler-Toledo），DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），WP-UPT-10超纯水机（四川沃特尔水处理设备有限公司），PF6-2非色散原子荧光光度计（北京普析通用仪器有限公司），MD6M微波消解仪（APL），ICP-Qc型电感耦合等离子体质谱仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）。 2 方法与结果
2.1 供试品的制备 将供试品置于恒温60 ℃的烘箱，烘2h[11]，精密称取供试品约0.5g，置于微波消解罐中，加硝酸-30% 过氧化氢（V/V 7∶3）的混酸溶液共10mL，密闭，置于微波消解仪中按表1消解程序进行消解。微波消解结束后，冷却取出，挥去浓烟，用超纯水将消解液转入50mL量瓶中，用超纯水洗涤消解罐3次，洗液并入量瓶中，用超纯水定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。同法制备空白溶液。
2.2 标准曲线及检出限 以1 %硝酸溶液稀释配制含Pb、As、Cd为 0.2、1、5、10、20、50ng/mL，含Cu为1、5、10、20、50、100ng/mL的系列浓度混合溶液[13]，以超纯水稀释配制Bi、In、Ge 浓度均为1μg/mL的混合內标液[14]，并使用ICP-MS测定标准曲线;以1 %硝酸溶液稀释配制含Hg为0.05、0.1、0.5、1、2、5ng/mL的系列浓度溶液，使用非色散原子荧光光度计测定。对试剂空白进行11次测定[15]，以待测元素响应值的3倍标准偏差除以标准曲线斜率，即可得该元素的方法检出限，结果详见表2。
2.3 精密度试验 取编号为“S1”的黑冰片样品微波消解后，分别连续测定6次，测定各元素RSD范围均在1.42 %～2.66 %之间。
2.4 重复性试验 取编号为“S1”的黑冰片样品微波消解后，平行6份，按“2.1”项下前处理方法进行消解，得到6份供试液，测定各元素RSD范围均在1.27 %～ 4.11 %之间。
2.5 稳定性试验 取编号为“S1”的黑冰片样品微波消解后，每隔4h测定一次共测6次。供试品溶液中各元素RSD范围均在0.96%～ 4.91%之间，表明消解方法所得的供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.6 加样回收试验 对已知含量的编号为“S1”的黑冰片样品作加样回收试验。按“2.1”项下方法进行前处理，得到6份供试液作回收率试验。由表3微波消解测定5种元素的回收率在84.87%～98.86%之间，RSD≤5 %， 表明方法准确可靠。
2.7 ICP-MS法含量测定 精密称取各个批次的黑冰片、黑冰片-10味散、十味黑冰片丸样品，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按表4工作参数，平行测定3次。测得As、Pb、Cd、Cu元素的含量，测定结果见表5～7。
2.8 Hg含量测定 精密称取各个批次的黑冰片、黑冰片-10味散、十味黑冰片丸样品，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，用非色散原子荧光光度计平行测3次，测得Hg元素含量，测定结果见表5～7。
3 分析与讨论
根据《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》[16]（WM/T22004）中规定砷（As）≤2.0mg/kg，铅（Pb）≤5.0mg/kg，镉（Cd）≤0.3mg/kg，汞（Hg）≤0.2mg/kg，铜（Cu）≤20.0mg/kg。对比黑冰片、黑冰片-10味散、十味黑冰片丸中重金属及有害元素砷的含量，黑冰片中砷、铅、汞、镉、铜均大幅超标，而成药则超标较少。药材黑冰片在经过正确的配伍、制剂后出现了重金属及有害元素含量降低的情况，且黑冰片中重金属及有害元素的总含量约为黑冰片-10味散总含量的四倍，这与黑冰片在该制剂中稀释倍数基本相符。由此判断黑冰片是制剂中引入重金属及有害元素砷的主要因素。有研究证明，黑冰片对大鼠长期使用并无毒性作用[17]，但作为野猪粪便经过高温碳化所得药材饮片，黑冰片不易采集，患者顺应性差，且具体药理作用尚未完全确定，所以使用其它药材替代黑冰片的必要性值得进一步研究。
本试验建立了黑冰片重金属及有害元素砷的含量测定方法，具有较好的精密度、重复性、稳定性，且回收率试验结果中RSD均小于5 %，测定结果准确可靠，满足检测要求，可作为黑冰片中重金属及有害元素测定的方法。同时对黑冰片-10味散、十味黑冰片丸中重金属的来源作了讨论，基于其中重金属和砷的含量过高，而且黑冰片资源相对匮乏、采集不便且难以控制内在质量，有必要对相关制剂中黑冰片替代必要性进行研究。
参考文献
[1]宇妥·元丹贡布. 四部医典[M]. 上海： 上海科学技术出版社， 1987.
[2]贾敏如，张艺. 中国民族药辞典[M]. 北京： 中华医学电子音像出版社， 2016.
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[9]冯尚红， 刘海红， 虎延龙. HPLC法测定十味黑冰片丸中桂皮醛的含量[J]. 北方药学， 2013， 10（5）：12-13.
[10]刘静， 李树先， 朱江， 等. 浅谈几种重金属元素对人体的危害及其预防措施[J]. 中国资源综合利用， 2018， 36（03）：182-184.
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[13]姜涛， 施枝江， 陈林明，等. ICP-MS法测定不同产地莲子及莲子不同部位中5种重金属元素含量[J]. 亚太传统医药， 2018（10）：55-58.
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（收稿日期：2018-11-27 编辑：程鹏飞）