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摘要 采用乳化溶剂挥发的方法制备MeOCPT纳米粒子，结果表明：MeOCPT纳米粒子具有明显的圆形结构，且表面光滑，大小均匀，粒度分布在100～300 nm之间。MeOCPT的载药量和包封率分别为（3.10±1.19）%和（83.57±3.45）%，在体外可以持续缓慢释放，累积释放率接近60%，达到了预期的药物缓慢释放及降低毒性的结果。
关键词 甲氧基喜树碱；聚乳酸；纳米粒子；体外释放
中图分类号 TQ463 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）08-0173-01
Abstract The nanoparticles contained MeOCPT prepared with the method emulsion and solvent evaporation.The MeOCPT nanoparticles had a circular structure，with a smooth surface，uniform size，and its particle size distributed between 100 nm and 300 nm.The drug-loading rate and entrapment efficiency of MeOCPT nanoparticles were（3.10±1.19）% and（83.57±3.45）%.MeOCPT nanoparticles released slowly and lastingly in vitro whose cumulative release rate was nearly 60%，which could release the drugs slowly and reduce the toxicity of drugs.
Key words Methoxycamptothecin；polylactic acid；nanoparticles；in vitro drug release
10-甲氧基喜树碱（10-methoxycamptothecin，MeOCPT），是从喜树的果实中分离得到的喜树碱天然衍生物之一[1]，具有明显的抗肿瘤活性[2]，但是由于MeOCPT的毒性较大，且难溶于水和一般的有机溶剂，限制了其临床应用[3]。该研究制备了一种基于聚乳酸包裹MeOCPT的纳米粒子[4]，致使其有效发挥MeOCPT的抗癌活性，减少其毒副作用，增加生物利用度[5]。
1 材料与方法
1.1 供试仪器与药剂
10-甲氧基喜树碱（由实验室自主合成，纯度99%），聚乙烯醇（美国Sigma公司），聚乳酸（山东省医疗器械研究所），二甲基亚砜、乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯。高效液相色谱系统（Waters，USA）；Thermo C18色谱柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）；超声波细胞粉碎机（Scientz ⅡD，宁波新芝生物科技股份有限公司）；透射电子显微镜（H-7650，日本日立公司）；高速低温离心机（J-25，美国Beckman Coulter公司）。
1.2 MeOCPT纳米粒子的制备
准确称取PLA 250 mg和MeOCPT 5 mg完全溶解于25 mL氯仿中。将溶液倾注入40 mL 5% PVA/1%六偏磷酸钠混合溶液中，超声乳化1 min（超声功率72 W），得到泡沫均匀细腻的乳白色液体，将其倾注入50 mL 2%异丙醇溶液中，待氯仿挥发完全后，将获得溶液离心、水洗3次（离心转速1 500 r/min），弃去上清液，去离子水将沉淀溶解后冻干，得到MeOCPT纳米粒子。
1.3 HPLC法测定MeOCPT纳米粒子的包封率和载药量
1.3.1 HPLC色谱条件。高效液相色谱系统（Waters，USA）；Thermo C18色谱柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）；荧光检测器激发波长（Ex）380 nm，检测波长（Em）515 nm，进样体积20 μL；流动相A：乙腈/水（5/95，v/v）；流动相B：乙腈；洗脱梯度为0～12 min（B：20%～60%）、12～15 min（B：60%～90%）、15～19 min（B：20%～90%）、19～25min（B：20%）。
1.3.2 MeOCPT甲醇标准曲线的配制。精确称取MeOCPT 10 mg，用10 mL DMSO溶解，得到1 mg/mL MeOCPT溶液，用甲醇稀释为5、10、20、40、80、160 ng/mL标准溶液。
1.3.3 样品配制。称取5 mg MeOCPT纳米粒子溶解于DMSO，定容至10 mL，稀释100倍备用。
1.3.4 计算包封率与载药量。计算公式如下：
包封率（%）=（CVW3 /W1 W2）×100
载药量（%）=（CV/W1）×100
式中，C—样品溶液浓度（ng/mL），V—样品溶液体积（mL），W1—纳米粒子质量（mg），W2—投药量（mg），W3—纳米粒子总质量（mg）。
1.4 MeOCPT纳米粒子的体外释放特性研究
煮沸处理过的透析袋中加入1 mL MeOCPT纳米液，扎紧，投入25 mL PBS释放介质中，37 ℃体外培养，定时取样2 mL，并补充等体积释放介质。高效液相色谱仪检测各时间点药物质量浓度，再计算累计释放率。体外释放累计释放率计算公式如下：
2 结果与分析
2.1 透射电子显微镜观察纳米粒子
通过透射电子显微镜观察（图1），载MeOCPT纳米粒子表面光滑，呈圆球状结构，粒径在200 nm左右。与未装载药物的纳米粒子相比，其形态稳定，无明显的变化，无明显的MeOCPT残留。 2.2 MeOCPT纳米粒子粒度的测定
采用静态光散射法测定了空白纳米粒子和载MeOCPT纳米粒子的粒度分别为（216.8±14.9）nm和（227.1±41.9）nm。与空白纳米粒子相比，载MeOCPT纳米粒子的粒径大小变化不明显，但两者粒度的分布范围均在100～300 nm之间，适用于静脉注射。
2.3 HPLC法测定MeOCPT纳米粒子的包封率和载药量
在给定色谱条件下，MeOCPT峰型良好，其保留时间为10.52 min。以MeOCPT系列标准溶液的浓度为横坐标（X），每个浓度对应的荧光检测峰面积为纵坐标（Y）绘制检测标准曲线，得到的线性方程为Y=1 160.7X 1.501 5（r2=0.999 5），根据标准曲线计算出MeOCPT浓度，最终通过公式求得包封率和载药量分别为（83.57±3.45）%、（3.10±1.19）%。
2.4 MeOCPT纳米粒子全外释放特性
根据MeoCPT体外释放曲线可以看出（图2），MeOCPT纳米粒子与游离的MeOCPT累计释放率均在60%左右，纳米粒子的累计释放率明显偏低。这一试验结果充分表明这种载MeOCPT纳米粒子具有明显的降低毒性和持续释放的特性。
3 结论
该研究成功地制备MeOCPT纳米粒子缓释制剂，并且达到了预期的药物缓慢释放及降低毒性的结果。
4 参考文献
[1] LIU Zhen-fengWANG Guo-lin，DONG Meng-jie，et al.Simple automated radiosynthesis of 10-[11C]methoxy-20（S）-camptothecin and biodistri-bution in normal mice[J].Appl Radiat Isot，2012，70（10）：2516-2524.
[2] JOSEPH F P，LEONARD B S.The camptothecins[J].New drug classes，2003（361）：2235-2242.
[3] 蔡俊超，冯大为，殷孟光，等.dl-10-羟基喜树碱及dl-10-甲氧基喜树碱的全合成[J].化学学报，1981，39（2）：171-176.
[4] MORAWSKA-CHOCH？譫L A，DOMALIK-PYZIK P.Gentamicin release from biodegradable poly-l-lactide based composites for novel intramed-ullary nails[J].Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2014（45）：15-20.
[5] JEEVITHA D，MALATHY B R，BASKAR S K.Toxic effects of Aflatoxin B1 on embryonic development of zebrafish（Danio rerio）：Potential activity of Piceatannol encapsulated Chitosan/poly（lactic acid）nanoparticles[J].Anticancer Agents Med Chem，2014，15（2）：248-257.
关键词 甲氧基喜树碱；聚乳酸；纳米粒子；体外释放
中图分类号 TQ463 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）08-0173-01
Abstract The nanoparticles contained MeOCPT prepared with the method emulsion and solvent evaporation.The MeOCPT nanoparticles had a circular structure，with a smooth surface，uniform size，and its particle size distributed between 100 nm and 300 nm.The drug-loading rate and entrapment efficiency of MeOCPT nanoparticles were（3.10±1.19）% and（83.57±3.45）%.MeOCPT nanoparticles released slowly and lastingly in vitro whose cumulative release rate was nearly 60%，which could release the drugs slowly and reduce the toxicity of drugs.
Key words Methoxycamptothecin；polylactic acid；nanoparticles；in vitro drug release
10-甲氧基喜树碱（10-methoxycamptothecin，MeOCPT），是从喜树的果实中分离得到的喜树碱天然衍生物之一[1]，具有明显的抗肿瘤活性[2]，但是由于MeOCPT的毒性较大，且难溶于水和一般的有机溶剂，限制了其临床应用[3]。该研究制备了一种基于聚乳酸包裹MeOCPT的纳米粒子[4]，致使其有效发挥MeOCPT的抗癌活性，减少其毒副作用，增加生物利用度[5]。
1 材料与方法
1.1 供试仪器与药剂
10-甲氧基喜树碱（由实验室自主合成，纯度99%），聚乙烯醇（美国Sigma公司），聚乳酸（山东省医疗器械研究所），二甲基亚砜、乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯。高效液相色谱系统（Waters，USA）；Thermo C18色谱柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）；超声波细胞粉碎机（Scientz ⅡD，宁波新芝生物科技股份有限公司）；透射电子显微镜（H-7650，日本日立公司）；高速低温离心机（J-25，美国Beckman Coulter公司）。
1.2 MeOCPT纳米粒子的制备
准确称取PLA 250 mg和MeOCPT 5 mg完全溶解于25 mL氯仿中。将溶液倾注入40 mL 5% PVA/1%六偏磷酸钠混合溶液中，超声乳化1 min（超声功率72 W），得到泡沫均匀细腻的乳白色液体，将其倾注入50 mL 2%异丙醇溶液中，待氯仿挥发完全后，将获得溶液离心、水洗3次（离心转速1 500 r/min），弃去上清液，去离子水将沉淀溶解后冻干，得到MeOCPT纳米粒子。
1.3 HPLC法测定MeOCPT纳米粒子的包封率和载药量
1.3.1 HPLC色谱条件。高效液相色谱系统（Waters，USA）；Thermo C18色谱柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）；荧光检测器激发波长（Ex）380 nm，检测波长（Em）515 nm，进样体积20 μL；流动相A：乙腈/水（5/95，v/v）；流动相B：乙腈；洗脱梯度为0～12 min（B：20%～60%）、12～15 min（B：60%～90%）、15～19 min（B：20%～90%）、19～25min（B：20%）。
1.3.2 MeOCPT甲醇标准曲线的配制。精确称取MeOCPT 10 mg，用10 mL DMSO溶解，得到1 mg/mL MeOCPT溶液，用甲醇稀释为5、10、20、40、80、160 ng/mL标准溶液。
1.3.3 样品配制。称取5 mg MeOCPT纳米粒子溶解于DMSO，定容至10 mL，稀释100倍备用。
1.3.4 计算包封率与载药量。计算公式如下：
包封率（%）=（CVW3 /W1 W2）×100
载药量（%）=（CV/W1）×100
式中，C—样品溶液浓度（ng/mL），V—样品溶液体积（mL），W1—纳米粒子质量（mg），W2—投药量（mg），W3—纳米粒子总质量（mg）。
1.4 MeOCPT纳米粒子的体外释放特性研究
煮沸处理过的透析袋中加入1 mL MeOCPT纳米液，扎紧，投入25 mL PBS释放介质中，37 ℃体外培养，定时取样2 mL，并补充等体积释放介质。高效液相色谱仪检测各时间点药物质量浓度，再计算累计释放率。体外释放累计释放率计算公式如下：
2 结果与分析
2.1 透射电子显微镜观察纳米粒子
通过透射电子显微镜观察（图1），载MeOCPT纳米粒子表面光滑，呈圆球状结构，粒径在200 nm左右。与未装载药物的纳米粒子相比，其形态稳定，无明显的变化，无明显的MeOCPT残留。 2.2 MeOCPT纳米粒子粒度的测定
采用静态光散射法测定了空白纳米粒子和载MeOCPT纳米粒子的粒度分别为（216.8±14.9）nm和（227.1±41.9）nm。与空白纳米粒子相比，载MeOCPT纳米粒子的粒径大小变化不明显，但两者粒度的分布范围均在100～300 nm之间，适用于静脉注射。
2.3 HPLC法测定MeOCPT纳米粒子的包封率和载药量
在给定色谱条件下，MeOCPT峰型良好，其保留时间为10.52 min。以MeOCPT系列标准溶液的浓度为横坐标（X），每个浓度对应的荧光检测峰面积为纵坐标（Y）绘制检测标准曲线，得到的线性方程为Y=1 160.7X 1.501 5（r2=0.999 5），根据标准曲线计算出MeOCPT浓度，最终通过公式求得包封率和载药量分别为（83.57±3.45）%、（3.10±1.19）%。
2.4 MeOCPT纳米粒子全外释放特性
根据MeoCPT体外释放曲线可以看出（图2），MeOCPT纳米粒子与游离的MeOCPT累计释放率均在60%左右，纳米粒子的累计释放率明显偏低。这一试验结果充分表明这种载MeOCPT纳米粒子具有明显的降低毒性和持续释放的特性。
3 结论
该研究成功地制备MeOCPT纳米粒子缓释制剂，并且达到了预期的药物缓慢释放及降低毒性的结果。
4 参考文献
[1] LIU Zhen-fengWANG Guo-lin，DONG Meng-jie，et al.Simple automated radiosynthesis of 10-[11C]methoxy-20（S）-camptothecin and biodistri-bution in normal mice[J].Appl Radiat Isot，2012，70（10）：2516-2524.
[2] JOSEPH F P，LEONARD B S.The camptothecins[J].New drug classes，2003（361）：2235-2242.
[3] 蔡俊超，冯大为，殷孟光，等.dl-10-羟基喜树碱及dl-10-甲氧基喜树碱的全合成[J].化学学报，1981，39（2）：171-176.
[4] MORAWSKA-CHOCH？譫L A，DOMALIK-PYZIK P.Gentamicin release from biodegradable poly-l-lactide based composites for novel intramed-ullary nails[J].Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2014（45）：15-20.
[5] JEEVITHA D，MALATHY B R，BASKAR S K.Toxic effects of Aflatoxin B1 on embryonic development of zebrafish（Danio rerio）：Potential activity of Piceatannol encapsulated Chitosan/poly（lactic acid）nanoparticles[J].Anticancer Agents Med Chem，2014，15（2）：248-257.