论文部分内容阅读
摘要：以大头典竹叶片为材料，采用单因素分析法和正交设计直观分析法，对影响PCR扩增效果的Mg2 、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA含量这5个PCR反应体系主要成分以及退火温度和循环次数进行筛选。通过研究建立了适合大头典竹的ISSR-PCR反应体系：20 μL反应液中含2.5 mmol/L Mg2 ，0.25 mmol/L dNTPs，1.25 U TaqDNA聚合酶，0.6 μmol/L引物，10 ng模板DNA，2 μL 10×Buffer，10.55 μL ddH2O。相应反应程序为94 ℃预变性 5 min；94 ℃ 变性45 s，54.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。应用建立的优化反应体系成功地筛选出16条多态性较高的引物，表明该体系具有较高稳定性、重现性、适用性，可较好地应用于大头典竹不同地理种源间的遗传多样性研究。
关键词：大头典竹；ISSR；反应体系；优化
中图分类号： S795.901文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）10-0034-06
地球上的竹类植物共有88属1 400多种，主要分布在亚太区、美洲区、非洲区[1]。中国竹类主要分布于长江中下游，其中以福建、浙江、江西、湖南4省最多，占全国竹林面积的60.7%[2]。大头典竹[Dendrocalamopsis beecheyana var. pubescens （P. F. Li） Keng f.]属于竹亚科（Bambusoideae）绿竹属[Dendrocalamopsis （Chia et H. L. Fung） Keng f.]的丛生竹，别称新竹、荣竹，具有繁殖生长快、根系发达、适应性广等特点。目前，在我国关于大头典竹在分子生物方面的研究较少。[JP]
近年来，随着现代分子生物学的快速发展，分子标记技术被广泛应用于遗传多样性以及指纹图谱构建的研究[3-5]。目前应用最为广泛的分子标记技术主要有RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SRAP等[6]。其中SSR序列广泛分布在高等生物的染色体上，因此利用该简单重复序列标记（inter simple sequence repeat，ISSR）技术可以获得较多的分子标记。ISSR的引物长度较RAPD引物长，因此ISSR具有重现性的特点，可以获得较可靠的遗传多样性信息，有利于植物种间及种内的鉴别[7]。已有研究表明，竹亚科植物不同地理种源间的遗传变异较丰富[8]，为了进一步证实上述观点，本试验采用ISSR方法对大头典竹的群居差异进行研究，旨在建立 ISSR-PCR最佳反应体系，为其地理种源的遗传多样性分析和亲缘关系的鉴定奠定理论基础。
1材料与方法
1.1材料
供试的材料来源于福建省东山国有赤山林场的大头典竹地理种源试验样地。采摘洗净的竹叶3～5张，放入自封袋并冰袋保存，尽快转移至-80 ℃冰箱，以备DNA的提取。
[BT2 *5]1.2试剂与仪器
主要试剂：ISSR引物都参考哥伦比亚大学公布的100条引物，由上海生物工程技术服务有限公司合成。TaqDNA聚合酶、dNTPs Mixture、Mg2 、RNA降解酶、DNA ladder Marker、10×PCR Buffer、6×loading Buffer均购上海生物工程技术服务有限公司；琼脂糖、核酸染料均购自北京赛西盛公司。
主要仪器：JS-680全自动数码凝胶成像分析仪、T6新世界紫外分光光度计、Lab Cycler PCR仪、DYY-8C电泳仪、TGL-20M台式高速冷冻离心机等。
1.3DNA的提取与检测
大头典竹DNA的提取采用博日公司Biospin植物基因组DNA提取试剂盒提取的方法。将提取出的DNA用紫外分光光度计检测其浓度、纯度，再用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性及是否有降解现象。
[BT2 *5]1.4ISSR原初扩增程序和反应体系
原初设定的扩增程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性 45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。原初扩增反应体系为2.5 mmol/L Mg2 ，0.25 mmol/L dNTPs，1 U TaqDNA聚合酶，0.6 μmol/L引物，50 ng 模板DNA，2 μL 10×Buffer，9.8 μL ddH2O。原初扩增程序和反应体系均参考李炎梅的方法[9]。
1.5试验设计
[JP 1]经过初步的引物筛选，引物UBC810能产生清晰度高、多态性好的条带，因此可以用于ISSR-PCR体系的筛选（图1）。分别采用单因素多水平梯度试验法和正交设计分析法（表1、
1.6扩增产物检测
取9 μL的PCR产物，加入1.5 μL 6×loading Buffer并混匀，上样到加有核酸染料的1.5%琼脂糖凝胶上，电泳1 h，电压设为5 V/cm。待电泳时间结束到紫外凝胶成像分析仪观察和拍照。
2结果与分析
2.1單因素多水平梯度试验结果分析
2.1.1Mg2 浓度对ISSR-PCR扩增的影响
Mg2 浓度变化直接影响反应液中Taq DNA聚合酶的活性，也间接影响引物与模板DNA的双联杂交体的解链和退火温度以及扩增产物[CM（25]的特异性[10]，因此选择合适的Mg2 浓度对ISSR-PCR反[CM）]
应至关重要。研究发现，Mg2 浓度为1.0 mmol/L时，无扩增条带出现；在Mg2 浓度为1.5 mmol/L时，扩增出的条带极少且模糊；Mg2 浓度为2.0～4.0 mmol/L时，扩增条带数一致，但Mg2 浓度在2.5 mmol/L时，扩增条带较多清晰（图2）。因 2.1.2dNTPs浓度对ISSR-PCR扩增的影响
dNTP是 ISSR-PCR反应的原料，其浓度的高低直接影响产物的产量和特异性[11]。研究发现，dNTPs浓度为0.25 mmol/L时，扩增的条带较为清晰明亮；当dNTPs浓度低于0.25 mmol/L时，扩增产物条带模糊；dNTPs浓度过低会影响底物与引物的酶促反应速度的下降，导致扩增条带产率低、效果差；当dNTPs浓度大于0.25 mmol/L时，PCR扩增条带较一致（图3）。因此，从降低成本考虑，dNTPs浓度选用0.25 mmol/L。[FL）]
在 ISSR-PCR反应中，TaqDNA聚合酶是影响扩增效果的关键因素之一。TaqDNA聚合酶用量过多会引起非特异性扩增，过低则会使得扩增产物减少[12]。另外TaqDNA聚合酶的活性还受Mg2 、dNTPs浓度的影响[13]。研究发现，当TaqDNA聚合酶含量为0.5～1.0 U时，扩增的条带较少，总体条带数较为模糊，但扩增条带随着TaqDNA聚合酶含量的增加依次增加；当TaqDNA聚合酶含量为1.25～2.00 U时，扩增条带数增加，条带清晰（图4）。因此，TaqDNA聚合酶含量选用 1.25 U。[FL）]
引物的浓度过高时容易引起引物二聚体的形成，从而导致扩增条带模糊或减少，还会产生新的非特异性位点；过低则会使PCR反应提前结束，使扩增条带减少甚至没有条带出现[14]。研究发现，当引物浓度为0.3、0.4 μmol/L时，扩增的条带数目减少且模糊；当引物浓度为0.5、0.6 μmol/L时，条带清晰，扩增条数比0.3、0.4 μmol/L时的条带数增多；当引物浓度大于 0.6 μmol/L 时，条带清晰度明显减弱（图5）。因此，本试验选用 0.6 μmol/L 引物浓度为ISSR-PCR反应体系的最佳浓度。[FL）]
[FL（2K2]2.1.5模板DNA用量对ISSR-PCR扩增的影响
一般情况下，模板DNA含量过低，会导致无扩增产物，过高则会引起非特异性产物的出现或扩增条带的模糊[15]。少数情况下，模板DNA含量对ISSR-PCR扩增影响不大[16]。研究发现，本试验设计的7个梯度水平的DNA含量均能扩增出清晰、明亮的条带且无明显差异（图6）。考虑到DNA用量越少越好，因此本试验选择10 ng模板DNA为ISSR-PCR反应体系的最佳用量。[FL）]
本试验的主要影响因素浓度，以单因素多水平梯度试验的数据为基础，设计成5个影响因素、4个水平、16个试验处理的正交设计，并建成关于大头典竹的ISSR-PCR标记的反应体系表。研究发现，处理4、处理7、处理8扩增条带最为清晰，条带数比较多，而处理3、处理11、处理16没有扩增条带。参照何正文等的方法[17]，根据PCR扩增条带的多少、条带的亮暗程度和清晰度进行评分。最好的评16分，最差的评1分，依次对16条扩增条带进行评分。16个处理的分数依次为6、11、1、16、13、7、14、15、12、8、1、12、5、10、
[FL（2K2]根据评分结果求出每个因素同一水平下的試验值之和Ki以及每一因素同水平下的数据平均值ki并求出同一因素不同水平间平均值的极差R。极差R反应各影响因素对反应体系的影响，R越大则影响越显著[12]。各因素水平变化对ISSR-PCR反应体系影响从大到小排序为Taq酶含量>Mg2 浓度>引物浓度>dNTPs浓度>模板DNA含量（表3）。每一因素同水平下的数据平均值ki反应影响因素各水平对ISSR-PCR反应体系的影响情况，ki越大，水平对反应体系越有利[12]。因此，正交设计试验下，大头典竹的ISSR-PCR反[CM（25]应体系的最佳浓度为 2.0 mmol/L[KG*3]Mg2 ，0.35[KG*3]mmol/L
2.3扩增程序参数的调整
2.3.1退火温度的筛选
退火温度是影响PCR特异性反应的重要因素，退火温度不同，产生引物和模板DNA间的错配[18]。一般来说，每一个引物都有各自的理论退火温度。合理的退火温度一般55～70 ℃，退火温度一般在设定引物的理论退火温度±5 ℃范围内。在一定的温度范围内，退火温度越高，扩增的特异性也越高，退火温度越低，扩增产物的特异性也降低。如果退火温度过高，则引物与模板结合差，电泳条带差，甚至没有扩增。如果温度过低，则扩增特异性差，杂带较多，背景深[19]。本研究发现，当退火温度为50～54.5 ℃时，扩增的条带逐渐增多，条带逐渐清晰，当退火温度大于54.5 ℃时，扩增条带清晰度逐渐降低，条带数逐渐减少（图8）。因此选择最佳退火温度为第6泳道的54.5 ℃，与UBC810引物的理论退火温度52.2 ℃相差不超过5 ℃，符合文献报道[20]。
2.3.2循环次数的筛选
PCR的循环次数对PCR反应有重要的影响，循环次数太低，会引起扩增产物的减少。循环次数太高，又会产生非特异性产物[21]。本试验对循环次数设了3个梯度，分别为30、35、40次。研究发现，当循环次数为40次时，扩增条带最为清晰（图9），因此40次循环作为大头典竹ISSR-PCR反应最佳反应的循环次数。[FL）]
利用建立好的大头典竹的最佳反应体系，对100条引物进行扩增。研究发现在选用不同的引物时，绝大部分都能扩增出清晰、明亮的条带，只有少部分引物不能扩增出条带（图10）。研究结果说明，该反应体系稳定，并具有重复性。
3结论与讨论
ISSR分子标记技术具有稳定性高、重复性好、DNA用量少等其他分子标记技术无法比拟的优势[9]，同时，也受到 ISSR-PCR 反应体系中Mg2 、dNTPs、Taq酶、引物、模板DNA等因素的影响[17]。有关巨竹属植物的ISSR-PCR反应体系的优化的研究表明，模板DNA含量对ISSR-PCR扩增有较大的影响[18]。而在本试验中，模板DNA含量对大头典竹 ISSR-PCR 扩增反应没有太大影响，可能是因为不同竹亚科植物间的DNA含量对扩增反应的影响也是有差别的。 在ISSR-PCR反应的建立和优化中，通常采用单因素试验方法和正交试验方法[19-25]。本试验分别采用2种方法，对反应体系和扩增程序进行和优化，确定各影响因素浓度和循环次数，并在建立好的体系上对有效引物进行筛选。通过对2种试验方法的比较证实了单因素试验可以直接地反应出各[FL）]
[FL（2K2]影响因素的浓度或含量大小对反应体系的影响，试验操作要求比较简单。正交试验可以考虑到各因素的交互作用，确定各因素的主次关系，但操作比较复杂，试验时间过长，影响酶等主要成分的活性[9]。本试验结果表明，2个试验方法所得到结果差异比较明显，且正交试验方法，有部分产物未能扩增出来。因此选择较为常用的单因素试验方法来进行ISSR-PCR体系建立与优化。
综上，本试验建立了大头典竹最佳优化体系：20 μL的反应液中含2.5 mmol/L Mg2 ，0.25 mmol/L dNTPs，1.25 U TaqDNA聚合酶，0.6 μmol/L引物，10 ng模板DNA，2 μL 10×Buffer，10.55 μL ddH2O，该体系将为大头典竹不同地理种源的遗传多样性研究和亲缘关系评价提供技术基础。
参考文献：
[1]郑林. 酸竹属遗传多样性研究[D]. 福州：福建农林大学，2011.
[2]肖永太. 大明竹属指纹图谱的研究[D]. 福州：福建农林大学，2011.
[3]朱岩芳，祝水金，李永平，等. ISSR分子标记技术在植物种质资源研究中的应用[J]. 种子，2010，29（2）：55-59.
[4]Farooq S，Azam F. Molecular markers in plant breeding-Ⅰ：Concepts and characterization[J]. Pakistan Journal of Biological Sciences，2002，5（10）：1135-1140.
[5]Landjeva S，Korzun V，Brner A. Molecular markers：actual and potential contributions to wheat genome characterization and breeding[J]. Euphytica，2007，156（3）：271-296.
[6]Weng M L，Liu B，Jin D M，et al. Identification of 27 porphyra lines （rhodophyta） by DNA fingerprinting and molecular markers[J]. Journal of Applied Phycology，2005，17（1）：91-97.
[7]Lai J A，Yang W C，Hsiao J Y. An assessment of genetic relationships in cultivated tea clones and native wild tea in Taiwan using RAPD and ISSR markers[J]. Botanical Bulletin of Academia Sinica，2001，42（2）：93-100.
[8]黄树军，陈礼光，肖永太，等. 大明竹屬遗传多样性ISSR分析及DNA指纹图谱研究[J]. 生态学报，2013，33（24）：7863-7871.
[9]李炎梅. 竹亚科各属命名种遗传多样性的ISSR分析及原理应用研究[D]. 福州：福建农林大学，2012.
[10]冯夏莲，何承忠，张志毅，等. 毛白杨ISSR反应体系的建立及优化[J]. 北京林业大学学报，2006，28（3）：61-65.
[11]钱志瑶，周道堂，黄秀平，等. 黔产宽叶缬草ISSR反应体系的建立与优化[J]. 生物技术通报，2015，31（7）：69-75.
[12]田艳伶，李志辉，杨模华，等. 钩栗ISSR-PCR反应体系的建立与优化[J]. 中南林业科技大学学报，2015，2（2）：32-37.
[13]武创，司龙亭，姜晶. 萝卜ISSR-PCR反应体系的正交设计优化[J]. 分子植物育种，2010，8（1）：186-190.
[14]汪结明，项艳，吴大强，等. 杨树ISSR反应体系的建立及正交设计优化[J]. 核农学报，2007，21（5）：470-473，513.
[15]徐奭，张耀川，李树成，等. 银杏ISSR-PCR扩增反应体系的建立与优化[J]. 生物技术通讯，2012，23（1）：80-85.
[16]吴鑫，雷天刚，何永睿，等. 柑桔SRAP和ISSR分子标记技术体系的建立与优化[J]. 分子植物育种，2008，6（1）：170-176.[HJ1.8mm]
[17]何正文，刘运生，陈立华，等. 正交设计直观分析法优化PCR条件[J]. 湖南医科大学学报，1998，4（4）：76-77.
[18]郭凌飞，邹明宏，曾辉，等. 澳洲坚果ISSR-PCR反应体系的建立与优化[J]. 林业科学，2008，44（5）：160-164.[HJ1.86mm]
[19]李炎梅，何天友，陈凌艳，等. 巨竹ISSR反应体系的建立与优化[J]. 亚热带农业研究，2012，8（1）：51-56.
[20]代红艳，张志宏，周传生，等. 山楂ISSR分析体系的建立和优化[J]. 果树学报，2007，24（3）：313-318.
[21]廖丽，郭巧生. 夏枯草ISSR分子标记技术的建立与体系优化[J]. 中草药，2009，7（7）：1131-1135.
[22]徐君，刘凤军，张国芹，等. 香稻不育系ISSR正交体系优化及验证[J]. 江苏农业科学，2015，43（4）：21-24.
[23]桂腾琴，伍伟，卢鹏，等. 正交设计优化荷花品种ISSR-PCR反应体系[J]. 江苏农业科学，2016，44（7）：71-73.
[24]曹嵩晓，李娟玲，刘国民，等. 利用单因子和正交设计双重实验方法优化广藿香ISSR-PCR实验体系[J]. 热带生物学报，2011，2（1）：35-41.
[25]雷雪峰，易津，侯丽丽. 利用正交设计建立与优化北美驼绒藜ISSR-PCR反应体系[J]. 植物研究，2008，28（6）：693-697.
关键词：大头典竹；ISSR；反应体系；优化
中图分类号： S795.901文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）10-0034-06
地球上的竹类植物共有88属1 400多种，主要分布在亚太区、美洲区、非洲区[1]。中国竹类主要分布于长江中下游，其中以福建、浙江、江西、湖南4省最多，占全国竹林面积的60.7%[2]。大头典竹[Dendrocalamopsis beecheyana var. pubescens （P. F. Li） Keng f.]属于竹亚科（Bambusoideae）绿竹属[Dendrocalamopsis （Chia et H. L. Fung） Keng f.]的丛生竹，别称新竹、荣竹，具有繁殖生长快、根系发达、适应性广等特点。目前，在我国关于大头典竹在分子生物方面的研究较少。[JP]
近年来，随着现代分子生物学的快速发展，分子标记技术被广泛应用于遗传多样性以及指纹图谱构建的研究[3-5]。目前应用最为广泛的分子标记技术主要有RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SRAP等[6]。其中SSR序列广泛分布在高等生物的染色体上，因此利用该简单重复序列标记（inter simple sequence repeat，ISSR）技术可以获得较多的分子标记。ISSR的引物长度较RAPD引物长，因此ISSR具有重现性的特点，可以获得较可靠的遗传多样性信息，有利于植物种间及种内的鉴别[7]。已有研究表明，竹亚科植物不同地理种源间的遗传变异较丰富[8]，为了进一步证实上述观点，本试验采用ISSR方法对大头典竹的群居差异进行研究，旨在建立 ISSR-PCR最佳反应体系，为其地理种源的遗传多样性分析和亲缘关系的鉴定奠定理论基础。
1材料与方法
1.1材料
供试的材料来源于福建省东山国有赤山林场的大头典竹地理种源试验样地。采摘洗净的竹叶3～5张，放入自封袋并冰袋保存，尽快转移至-80 ℃冰箱，以备DNA的提取。
[BT2 *5]1.2试剂与仪器
主要试剂：ISSR引物都参考哥伦比亚大学公布的100条引物，由上海生物工程技术服务有限公司合成。TaqDNA聚合酶、dNTPs Mixture、Mg2 、RNA降解酶、DNA ladder Marker、10×PCR Buffer、6×loading Buffer均购上海生物工程技术服务有限公司；琼脂糖、核酸染料均购自北京赛西盛公司。
主要仪器：JS-680全自动数码凝胶成像分析仪、T6新世界紫外分光光度计、Lab Cycler PCR仪、DYY-8C电泳仪、TGL-20M台式高速冷冻离心机等。
1.3DNA的提取与检测
大头典竹DNA的提取采用博日公司Biospin植物基因组DNA提取试剂盒提取的方法。将提取出的DNA用紫外分光光度计检测其浓度、纯度，再用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性及是否有降解现象。
[BT2 *5]1.4ISSR原初扩增程序和反应体系
原初设定的扩增程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性 45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。原初扩增反应体系为2.5 mmol/L Mg2 ，0.25 mmol/L dNTPs，1 U TaqDNA聚合酶，0.6 μmol/L引物，50 ng 模板DNA，2 μL 10×Buffer，9.8 μL ddH2O。原初扩增程序和反应体系均参考李炎梅的方法[9]。
1.5试验设计
[JP 1]经过初步的引物筛选，引物UBC810能产生清晰度高、多态性好的条带，因此可以用于ISSR-PCR体系的筛选（图1）。分别采用单因素多水平梯度试验法和正交设计分析法（表1、
1.6扩增产物检测
取9 μL的PCR产物，加入1.5 μL 6×loading Buffer并混匀，上样到加有核酸染料的1.5%琼脂糖凝胶上，电泳1 h，电压设为5 V/cm。待电泳时间结束到紫外凝胶成像分析仪观察和拍照。
2结果与分析
2.1單因素多水平梯度试验结果分析
2.1.1Mg2 浓度对ISSR-PCR扩增的影响
Mg2 浓度变化直接影响反应液中Taq DNA聚合酶的活性，也间接影响引物与模板DNA的双联杂交体的解链和退火温度以及扩增产物[CM（25]的特异性[10]，因此选择合适的Mg2 浓度对ISSR-PCR反[CM）]
应至关重要。研究发现，Mg2 浓度为1.0 mmol/L时，无扩增条带出现；在Mg2 浓度为1.5 mmol/L时，扩增出的条带极少且模糊；Mg2 浓度为2.0～4.0 mmol/L时，扩增条带数一致，但Mg2 浓度在2.5 mmol/L时，扩增条带较多清晰（图2）。因 2.1.2dNTPs浓度对ISSR-PCR扩增的影响
dNTP是 ISSR-PCR反应的原料，其浓度的高低直接影响产物的产量和特异性[11]。研究发现，dNTPs浓度为0.25 mmol/L时，扩增的条带较为清晰明亮；当dNTPs浓度低于0.25 mmol/L时，扩增产物条带模糊；dNTPs浓度过低会影响底物与引物的酶促反应速度的下降，导致扩增条带产率低、效果差；当dNTPs浓度大于0.25 mmol/L时，PCR扩增条带较一致（图3）。因此，从降低成本考虑，dNTPs浓度选用0.25 mmol/L。[FL）]
在 ISSR-PCR反应中，TaqDNA聚合酶是影响扩增效果的关键因素之一。TaqDNA聚合酶用量过多会引起非特异性扩增，过低则会使得扩增产物减少[12]。另外TaqDNA聚合酶的活性还受Mg2 、dNTPs浓度的影响[13]。研究发现，当TaqDNA聚合酶含量为0.5～1.0 U时，扩增的条带较少，总体条带数较为模糊，但扩增条带随着TaqDNA聚合酶含量的增加依次增加；当TaqDNA聚合酶含量为1.25～2.00 U时，扩增条带数增加，条带清晰（图4）。因此，TaqDNA聚合酶含量选用 1.25 U。[FL）]
引物的浓度过高时容易引起引物二聚体的形成，从而导致扩增条带模糊或减少，还会产生新的非特异性位点；过低则会使PCR反应提前结束，使扩增条带减少甚至没有条带出现[14]。研究发现，当引物浓度为0.3、0.4 μmol/L时，扩增的条带数目减少且模糊；当引物浓度为0.5、0.6 μmol/L时，条带清晰，扩增条数比0.3、0.4 μmol/L时的条带数增多；当引物浓度大于 0.6 μmol/L 时，条带清晰度明显减弱（图5）。因此，本试验选用 0.6 μmol/L 引物浓度为ISSR-PCR反应体系的最佳浓度。[FL）]
[FL（2K2]2.1.5模板DNA用量对ISSR-PCR扩增的影响
一般情况下，模板DNA含量过低，会导致无扩增产物，过高则会引起非特异性产物的出现或扩增条带的模糊[15]。少数情况下，模板DNA含量对ISSR-PCR扩增影响不大[16]。研究发现，本试验设计的7个梯度水平的DNA含量均能扩增出清晰、明亮的条带且无明显差异（图6）。考虑到DNA用量越少越好，因此本试验选择10 ng模板DNA为ISSR-PCR反应体系的最佳用量。[FL）]
本试验的主要影响因素浓度，以单因素多水平梯度试验的数据为基础，设计成5个影响因素、4个水平、16个试验处理的正交设计，并建成关于大头典竹的ISSR-PCR标记的反应体系表。研究发现，处理4、处理7、处理8扩增条带最为清晰，条带数比较多，而处理3、处理11、处理16没有扩增条带。参照何正文等的方法[17]，根据PCR扩增条带的多少、条带的亮暗程度和清晰度进行评分。最好的评16分，最差的评1分，依次对16条扩增条带进行评分。16个处理的分数依次为6、11、1、16、13、7、14、15、12、8、1、12、5、10、
[FL（2K2]根据评分结果求出每个因素同一水平下的試验值之和Ki以及每一因素同水平下的数据平均值ki并求出同一因素不同水平间平均值的极差R。极差R反应各影响因素对反应体系的影响，R越大则影响越显著[12]。各因素水平变化对ISSR-PCR反应体系影响从大到小排序为Taq酶含量>Mg2 浓度>引物浓度>dNTPs浓度>模板DNA含量（表3）。每一因素同水平下的数据平均值ki反应影响因素各水平对ISSR-PCR反应体系的影响情况，ki越大，水平对反应体系越有利[12]。因此，正交设计试验下，大头典竹的ISSR-PCR反[CM（25]应体系的最佳浓度为 2.0 mmol/L[KG*3]Mg2 ，0.35[KG*3]mmol/L
2.3扩增程序参数的调整
2.3.1退火温度的筛选
退火温度是影响PCR特异性反应的重要因素，退火温度不同，产生引物和模板DNA间的错配[18]。一般来说，每一个引物都有各自的理论退火温度。合理的退火温度一般55～70 ℃，退火温度一般在设定引物的理论退火温度±5 ℃范围内。在一定的温度范围内，退火温度越高，扩增的特异性也越高，退火温度越低，扩增产物的特异性也降低。如果退火温度过高，则引物与模板结合差，电泳条带差，甚至没有扩增。如果温度过低，则扩增特异性差，杂带较多，背景深[19]。本研究发现，当退火温度为50～54.5 ℃时，扩增的条带逐渐增多，条带逐渐清晰，当退火温度大于54.5 ℃时，扩增条带清晰度逐渐降低，条带数逐渐减少（图8）。因此选择最佳退火温度为第6泳道的54.5 ℃，与UBC810引物的理论退火温度52.2 ℃相差不超过5 ℃，符合文献报道[20]。
2.3.2循环次数的筛选
PCR的循环次数对PCR反应有重要的影响，循环次数太低，会引起扩增产物的减少。循环次数太高，又会产生非特异性产物[21]。本试验对循环次数设了3个梯度，分别为30、35、40次。研究发现，当循环次数为40次时，扩增条带最为清晰（图9），因此40次循环作为大头典竹ISSR-PCR反应最佳反应的循环次数。[FL）]
利用建立好的大头典竹的最佳反应体系，对100条引物进行扩增。研究发现在选用不同的引物时，绝大部分都能扩增出清晰、明亮的条带，只有少部分引物不能扩增出条带（图10）。研究结果说明，该反应体系稳定，并具有重复性。
3结论与讨论
ISSR分子标记技术具有稳定性高、重复性好、DNA用量少等其他分子标记技术无法比拟的优势[9]，同时，也受到 ISSR-PCR 反应体系中Mg2 、dNTPs、Taq酶、引物、模板DNA等因素的影响[17]。有关巨竹属植物的ISSR-PCR反应体系的优化的研究表明，模板DNA含量对ISSR-PCR扩增有较大的影响[18]。而在本试验中，模板DNA含量对大头典竹 ISSR-PCR 扩增反应没有太大影响，可能是因为不同竹亚科植物间的DNA含量对扩增反应的影响也是有差别的。 在ISSR-PCR反应的建立和优化中，通常采用单因素试验方法和正交试验方法[19-25]。本试验分别采用2种方法，对反应体系和扩增程序进行和优化，确定各影响因素浓度和循环次数，并在建立好的体系上对有效引物进行筛选。通过对2种试验方法的比较证实了单因素试验可以直接地反应出各[FL）]
[FL（2K2]影响因素的浓度或含量大小对反应体系的影响，试验操作要求比较简单。正交试验可以考虑到各因素的交互作用，确定各因素的主次关系，但操作比较复杂，试验时间过长，影响酶等主要成分的活性[9]。本试验结果表明，2个试验方法所得到结果差异比较明显，且正交试验方法，有部分产物未能扩增出来。因此选择较为常用的单因素试验方法来进行ISSR-PCR体系建立与优化。
综上，本试验建立了大头典竹最佳优化体系：20 μL的反应液中含2.5 mmol/L Mg2 ，0.25 mmol/L dNTPs，1.25 U TaqDNA聚合酶，0.6 μmol/L引物，10 ng模板DNA，2 μL 10×Buffer，10.55 μL ddH2O，该体系将为大头典竹不同地理种源的遗传多样性研究和亲缘关系评价提供技术基础。
参考文献：
[1]郑林. 酸竹属遗传多样性研究[D]. 福州：福建农林大学，2011.
[2]肖永太. 大明竹属指纹图谱的研究[D]. 福州：福建农林大学，2011.
[3]朱岩芳，祝水金，李永平，等. ISSR分子标记技术在植物种质资源研究中的应用[J]. 种子，2010，29（2）：55-59.
[4]Farooq S，Azam F. Molecular markers in plant breeding-Ⅰ：Concepts and characterization[J]. Pakistan Journal of Biological Sciences，2002，5（10）：1135-1140.
[5]Landjeva S，Korzun V，Brner A. Molecular markers：actual and potential contributions to wheat genome characterization and breeding[J]. Euphytica，2007，156（3）：271-296.
[6]Weng M L，Liu B，Jin D M，et al. Identification of 27 porphyra lines （rhodophyta） by DNA fingerprinting and molecular markers[J]. Journal of Applied Phycology，2005，17（1）：91-97.
[7]Lai J A，Yang W C，Hsiao J Y. An assessment of genetic relationships in cultivated tea clones and native wild tea in Taiwan using RAPD and ISSR markers[J]. Botanical Bulletin of Academia Sinica，2001，42（2）：93-100.
[8]黄树军，陈礼光，肖永太，等. 大明竹屬遗传多样性ISSR分析及DNA指纹图谱研究[J]. 生态学报，2013，33（24）：7863-7871.
[9]李炎梅. 竹亚科各属命名种遗传多样性的ISSR分析及原理应用研究[D]. 福州：福建农林大学，2012.
[10]冯夏莲，何承忠，张志毅，等. 毛白杨ISSR反应体系的建立及优化[J]. 北京林业大学学报，2006，28（3）：61-65.
[11]钱志瑶，周道堂，黄秀平，等. 黔产宽叶缬草ISSR反应体系的建立与优化[J]. 生物技术通报，2015，31（7）：69-75.
[12]田艳伶，李志辉，杨模华，等. 钩栗ISSR-PCR反应体系的建立与优化[J]. 中南林业科技大学学报，2015，2（2）：32-37.
[13]武创，司龙亭，姜晶. 萝卜ISSR-PCR反应体系的正交设计优化[J]. 分子植物育种，2010，8（1）：186-190.
[14]汪结明，项艳，吴大强，等. 杨树ISSR反应体系的建立及正交设计优化[J]. 核农学报，2007，21（5）：470-473，513.
[15]徐奭，张耀川，李树成，等. 银杏ISSR-PCR扩增反应体系的建立与优化[J]. 生物技术通讯，2012，23（1）：80-85.
[16]吴鑫，雷天刚，何永睿，等. 柑桔SRAP和ISSR分子标记技术体系的建立与优化[J]. 分子植物育种，2008，6（1）：170-176.[HJ1.8mm]
[17]何正文，刘运生，陈立华，等. 正交设计直观分析法优化PCR条件[J]. 湖南医科大学学报，1998，4（4）：76-77.
[18]郭凌飞，邹明宏，曾辉，等. 澳洲坚果ISSR-PCR反应体系的建立与优化[J]. 林业科学，2008，44（5）：160-164.[HJ1.86mm]
[19]李炎梅，何天友，陈凌艳，等. 巨竹ISSR反应体系的建立与优化[J]. 亚热带农业研究，2012，8（1）：51-56.
[20]代红艳，张志宏，周传生，等. 山楂ISSR分析体系的建立和优化[J]. 果树学报，2007，24（3）：313-318.
[21]廖丽，郭巧生. 夏枯草ISSR分子标记技术的建立与体系优化[J]. 中草药，2009，7（7）：1131-1135.
[22]徐君，刘凤军，张国芹，等. 香稻不育系ISSR正交体系优化及验证[J]. 江苏农业科学，2015，43（4）：21-24.
[23]桂腾琴，伍伟，卢鹏，等. 正交设计优化荷花品种ISSR-PCR反应体系[J]. 江苏农业科学，2016，44（7）：71-73.
[24]曹嵩晓，李娟玲，刘国民，等. 利用单因子和正交设计双重实验方法优化广藿香ISSR-PCR实验体系[J]. 热带生物学报，2011，2（1）：35-41.
[25]雷雪峰，易津，侯丽丽. 利用正交设计建立与优化北美驼绒藜ISSR-PCR反应体系[J]. 植物研究，2008，28（6）：693-697.