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【摘 要】为探讨梓醇对多巴胺能神经元的保护作用，本研究采用梓醇预处理中脑原代细胞，再给予MPP+（10uM）诱导多巴胺能神经元损伤。通过酪氨酸羟化酶（TH）的免疫细胞化学染色、脂质过氧化产物和细胞内活性氧类物质的检测，观察了梓醇对MPP+诱导的多巴胺神经元的影响。结果显示：经梓醇预处理可以明显对多巴胺能神经元起到保护作用，并且抑制脂质过氧化产物和活性氧自由基的生成。本研究结果提示，梓醇很可能成为氧化应激导致的神经细胞损伤性疾病的代替性化学药品。
【关键词】梓醇；多巴胺；Parkinson病；氧化应激
【中图分类号】R473.74 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0004-02
帕金森病 （PD） 是一种以腹侧中脑多巴胺 （DA） 能神经元的退行变性为主要特征的老年性疾病。现有研究显示， 氧化应激（oxidative stress）-自由基学说在PD 的发病机制占有十分重要的地位[1] 。梓醇作为环烯醚萜类小分子化合物之一，动物体外实验已表明梓醇具有拮抗细胞内Ca2+、促进PC12细胞分化和抑制细胞凋亡的作用。本研究旨在观察梓醇对原代多巴胺能神经元损伤后的影响并探讨其可能存在的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
KM孕14天小鼠来自大连医科大学动物中心。1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）来自Sigma。抗酪氨酸羟化酶（TH）单克隆抗体来自Chemicon。MTT来自华美生物工程公司。二甲基亚砜（DMSO）来自东方科技公司。牛血清白蛋白来自BM公司。梓醇来自中国药品生物制品检定所。
1.2 方法
1.2.1 小鼠中脑纯神经元培养
无菌操作下取出胎龄14天的KM小鼠胚胎，分离出腹侧中脑，然后在DMEM/F12中轻柔的机械吹打以破碎组织。1500r离心机械分离后的细胞悬液10min，除去组织细胞碎片。弃上清液，计数重悬后的细胞并接种到多聚赖氨酸（20?g/ml）预包被的24孔培养板中，细胞接种密度为5×105/孔。细胞培养48小时后，加入10?M Mβ-阿拉伯糖呋喃糖苷（β-D- arabino furanoside）以抑制胶质细胞增殖。再过48小时，用新鲜的细胞培养液置换出旧的培养液[2]。最初接种的第7天，细胞用于实验。此时，纯神经元培养体系中神经元≥95%。
1.2.2 免疫细胞化学染色
加药处理后的细胞用以PBS为溶剂的4%的多聚甲醛室温下固定20分钟，PBS洗3次，用含1%的过氧化氢的PBS处理20分钟以消除内源性过氧化氢酶；PBS洗3次，然后用固定剂固定20分钟，勿洗；加入用抗体稀释液稀释的一抗（TH 1/300） 4℃过夜或37℃孵育2小时；然后用PBS震荡漂洗10min×3，加入生物素化的二抗（TH羊抗大鼠抗体1：200） 37℃孵育1小时，PBS震荡漂洗10min×3；加入ABC试剂孵育30分钟，PBS洗三次后用新鲜配置的0.05%的二氨基联苯胺（DAB）染色。适时终止反应 [3]，光学显微镜下观察。
1.2.3 MPP+对中脑神经细胞的损伤
中脑神经细胞培养到第七天，分别加入不同浓度的MPP+，细胞活力分析以四唑盐（MTT）方法为标准。
1.2.4 梓醇对MPP+诱导的中脑神经细胞损伤的作用
中脑神经细胞接种到24孔培养板培养到第七天，分别加入0.05-0.5mM不同浓度的梓醇预处理30分钟，然后加入MPP+共同培养48小时，培养结束后按MTT法检测细胞活力。
1.2.5 细胞内活性氧类物质的测定
细胞内活性氧类物质 （Reactive Oxygen Species， ROS）的含量使用2，7，-dichilorodi-hydrofuorescein （DCFH-DA）来测量的 [4]。将DCFH-DA溶解于无血清的DMEM/F12培养基中，终浓度为10uM。经药物处理后的培养的神经元细胞用PBS清洗2次，每孔加入100uL的DCFH-DA，37℃孵育30分钟，然后吸出液体，用PBS漂洗细胞三次，以充分除去未进入细胞内的DCFH-DA。在荧光分光光度仪下，以485nm为激发波长，530nm为放射波长测量荧光强度。以对照组的值作为基线，其他处理组与对照组的差值即为细胞内活性氧类物质的产量。
1.2.6 统计学分析
各组实验分别重复三次，数据表示为均值±标准差。采用Student’s-t 检验进行统计分析，p小于0.05认为有统计学意义。
2 实验结果
2.1 梓醇对MPP+造成的中脑神经元活力降低的影响
中脑神经细胞培养至第七天时加入10?M MPP+培养48小时后，细胞的存活率下降至对照组的48.6±3.23%，用梓醇预处理30分钟明显提高了细胞的存活能力并且显示了剂量依赖的关系，在0.5mM 的浓度下，细胞的存活率提高到了81±2.87%（图1）。形态学上，免疫细胞化学染色发现，MPP+处理组TH免疫阳性神经元突出受损变短，有中断现象。梓醇预处理组TH免疫阳性神经元突触受损有所改善（图2）。
3 讨论
氧化应激反应被认为在帕金森病中脑黑质纹状体部位的多巴胺能神经元变性坏死中其着重要的作用[5]。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-Methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine， MPTP） 可以导致帕金森病的发病已是不争的事实，利用MPTP制作的PD动物模型已经成为研究PD的公认模型。MPTP通过单胺氧化酶B （Monoamine oxidase B， MAO-B）氧化成1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+），MPP+通过多巴胺转运体进入到多巴胺能神经元，导致多巴胺能神经元凋亡，最终导致帕金森病的发生[6]。有报道证明氧化应激也是大多数神经退行性疾病（例如PD， AD等）发病的主要因素之一[7]。大量的研究己经证明，ROS可引起细胞内生物大分子DNA、脂类、蛋白等的氧化损伤，因而破坏细胞的完整性及正常的生理功能。
本研究进一步证实了MPP+可以诱导中脑多巴胺能神经元发生凋亡，并进一步证明了MPP+介导的神经细胞凋亡伴随ROS的生成，而梓醇可以有效地抑制活性氧的生成，从而对中脑的多巴胺能神经元起到了保护作用。
参考文献：
[1] 王岚 孙圣刚.帕金森病发病机制研究进展[1].临床内科杂志，2006，23（6）：365-367.
[2] 田学文，章翔，张剑宁. 雌激素对帕金森病大鼠中脑黑质多巴胺能神经元保护作用的研究[J]. 滨州医学院学报，2004， 3（11）：11-13 .
[3] 范东艳，王苹，汤勇等.神经营养因子对体外培养中脑多巴胺能神经元存活和分化的影响[J].中风与神经疾病杂志，2008（5）：26-28.
[4]周永列，吕亚萍，邱连女等.一氧化氮供体诱导HL-60细胞凋亡过程中活性氧自由基和抗氧化能力的变化.浙江检验医学[J]，2005（1）：26-28.
[5] 抗氧化剂对帕金森病的保护作用及机制的进展. 张冬齐，徐江平.医学综述2006，1（2）：113-115.
[6] 袁红，全青英等.帕金森病实验模型的研究进展2.武警医学，2005，11（11）：863-864.
[7] 周厚广，鲍远程，陆建明.还原型谷胱甘肽合抗震止痉胶囊对帕金森病细胞保护作用的实验研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2003 ，1 （11） ：652-656.
【关键词】梓醇；多巴胺；Parkinson病；氧化应激
【中图分类号】R473.74 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0004-02
帕金森病 （PD） 是一种以腹侧中脑多巴胺 （DA） 能神经元的退行变性为主要特征的老年性疾病。现有研究显示， 氧化应激（oxidative stress）-自由基学说在PD 的发病机制占有十分重要的地位[1] 。梓醇作为环烯醚萜类小分子化合物之一，动物体外实验已表明梓醇具有拮抗细胞内Ca2+、促进PC12细胞分化和抑制细胞凋亡的作用。本研究旨在观察梓醇对原代多巴胺能神经元损伤后的影响并探讨其可能存在的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
KM孕14天小鼠来自大连医科大学动物中心。1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）来自Sigma。抗酪氨酸羟化酶（TH）单克隆抗体来自Chemicon。MTT来自华美生物工程公司。二甲基亚砜（DMSO）来自东方科技公司。牛血清白蛋白来自BM公司。梓醇来自中国药品生物制品检定所。
1.2 方法
1.2.1 小鼠中脑纯神经元培养
无菌操作下取出胎龄14天的KM小鼠胚胎，分离出腹侧中脑，然后在DMEM/F12中轻柔的机械吹打以破碎组织。1500r离心机械分离后的细胞悬液10min，除去组织细胞碎片。弃上清液，计数重悬后的细胞并接种到多聚赖氨酸（20?g/ml）预包被的24孔培养板中，细胞接种密度为5×105/孔。细胞培养48小时后，加入10?M Mβ-阿拉伯糖呋喃糖苷（β-D- arabino furanoside）以抑制胶质细胞增殖。再过48小时，用新鲜的细胞培养液置换出旧的培养液[2]。最初接种的第7天，细胞用于实验。此时，纯神经元培养体系中神经元≥95%。
1.2.2 免疫细胞化学染色
加药处理后的细胞用以PBS为溶剂的4%的多聚甲醛室温下固定20分钟，PBS洗3次，用含1%的过氧化氢的PBS处理20分钟以消除内源性过氧化氢酶；PBS洗3次，然后用固定剂固定20分钟，勿洗；加入用抗体稀释液稀释的一抗（TH 1/300） 4℃过夜或37℃孵育2小时；然后用PBS震荡漂洗10min×3，加入生物素化的二抗（TH羊抗大鼠抗体1：200） 37℃孵育1小时，PBS震荡漂洗10min×3；加入ABC试剂孵育30分钟，PBS洗三次后用新鲜配置的0.05%的二氨基联苯胺（DAB）染色。适时终止反应 [3]，光学显微镜下观察。
1.2.3 MPP+对中脑神经细胞的损伤
中脑神经细胞培养到第七天，分别加入不同浓度的MPP+，细胞活力分析以四唑盐（MTT）方法为标准。
1.2.4 梓醇对MPP+诱导的中脑神经细胞损伤的作用
中脑神经细胞接种到24孔培养板培养到第七天，分别加入0.05-0.5mM不同浓度的梓醇预处理30分钟，然后加入MPP+共同培养48小时，培养结束后按MTT法检测细胞活力。
1.2.5 细胞内活性氧类物质的测定
细胞内活性氧类物质 （Reactive Oxygen Species， ROS）的含量使用2，7，-dichilorodi-hydrofuorescein （DCFH-DA）来测量的 [4]。将DCFH-DA溶解于无血清的DMEM/F12培养基中，终浓度为10uM。经药物处理后的培养的神经元细胞用PBS清洗2次，每孔加入100uL的DCFH-DA，37℃孵育30分钟，然后吸出液体，用PBS漂洗细胞三次，以充分除去未进入细胞内的DCFH-DA。在荧光分光光度仪下，以485nm为激发波长，530nm为放射波长测量荧光强度。以对照组的值作为基线，其他处理组与对照组的差值即为细胞内活性氧类物质的产量。
1.2.6 统计学分析
各组实验分别重复三次，数据表示为均值±标准差。采用Student’s-t 检验进行统计分析，p小于0.05认为有统计学意义。
2 实验结果
2.1 梓醇对MPP+造成的中脑神经元活力降低的影响
中脑神经细胞培养至第七天时加入10?M MPP+培养48小时后，细胞的存活率下降至对照组的48.6±3.23%，用梓醇预处理30分钟明显提高了细胞的存活能力并且显示了剂量依赖的关系，在0.5mM 的浓度下，细胞的存活率提高到了81±2.87%（图1）。形态学上，免疫细胞化学染色发现，MPP+处理组TH免疫阳性神经元突出受损变短，有中断现象。梓醇预处理组TH免疫阳性神经元突触受损有所改善（图2）。
3 讨论
氧化应激反应被认为在帕金森病中脑黑质纹状体部位的多巴胺能神经元变性坏死中其着重要的作用[5]。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-Methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine， MPTP） 可以导致帕金森病的发病已是不争的事实，利用MPTP制作的PD动物模型已经成为研究PD的公认模型。MPTP通过单胺氧化酶B （Monoamine oxidase B， MAO-B）氧化成1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+），MPP+通过多巴胺转运体进入到多巴胺能神经元，导致多巴胺能神经元凋亡，最终导致帕金森病的发生[6]。有报道证明氧化应激也是大多数神经退行性疾病（例如PD， AD等）发病的主要因素之一[7]。大量的研究己经证明，ROS可引起细胞内生物大分子DNA、脂类、蛋白等的氧化损伤，因而破坏细胞的完整性及正常的生理功能。
本研究进一步证实了MPP+可以诱导中脑多巴胺能神经元发生凋亡，并进一步证明了MPP+介导的神经细胞凋亡伴随ROS的生成，而梓醇可以有效地抑制活性氧的生成，从而对中脑的多巴胺能神经元起到了保护作用。
参考文献：
[1] 王岚 孙圣刚.帕金森病发病机制研究进展[1].临床内科杂志，2006，23（6）：365-367.
[2] 田学文，章翔，张剑宁. 雌激素对帕金森病大鼠中脑黑质多巴胺能神经元保护作用的研究[J]. 滨州医学院学报，2004， 3（11）：11-13 .
[3] 范东艳，王苹，汤勇等.神经营养因子对体外培养中脑多巴胺能神经元存活和分化的影响[J].中风与神经疾病杂志，2008（5）：26-28.
[4]周永列，吕亚萍，邱连女等.一氧化氮供体诱导HL-60细胞凋亡过程中活性氧自由基和抗氧化能力的变化.浙江检验医学[J]，2005（1）：26-28.
[5] 抗氧化剂对帕金森病的保护作用及机制的进展. 张冬齐，徐江平.医学综述2006，1（2）：113-115.
[6] 袁红，全青英等.帕金森病实验模型的研究进展2.武警医学，2005，11（11）：863-864.
[7] 周厚广，鲍远程，陆建明.还原型谷胱甘肽合抗震止痉胶囊对帕金森病细胞保护作用的实验研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2003 ，1 （11） ：652-656.