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【摘要】 目的 了解用实时荧光定量PCR技术检测乙肝病毒DNA拷贝数时，溶血对乙型肝炎病毒DNA定量检测的影响。
方法 采集30例乙型肝炎患者血液，分离血清，置于-20℃冰箱保存备用，并同时配制出含不同浓度Hb血清管。采用实时荧光定量PCR方法，检测含不同Hb浓度及不含Hb血清的乙型肝炎病毒DNA拷贝数，用配对t检验进行统计处理。结果 当标本中Hb浓度小于32 g/L时，Hb对检测血清乙型肝炎病毒DNA拷贝数无显著影响（P＞0.05）。结论 当Hb浓度较低时，Hb对血清乙型肝炎病毒DNA定量检测无显著影响，因此较低浓度溶血标本可以进行乙型肝炎病毒DNA的定量检测。
【关键词】 乙型肝炎病毒；DNA定量；溶血；PCR
文章编号：1003-1383(2008)01-0053-02中图分类号：R 620.446.11文献标识码：A
血清中乙型肝炎病毒DNA水平是判断乙型肝炎病毒在体内是否复制，患者传染性高低及选择治疗方案的重要指标。目前临床一般采用实时荧光定量PCR技术对乙型肝炎病毒DNA拷贝数进行定量检测。实时荧光定量PCR技术融汇了PCR技术的高效扩增，探针技术的高特异性，光谱技术的高敏感性等优点，通过直接检测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的结果。但此技术可能与标本状态密切相关，如溶血、脂血等。有研究表明Hb及其代谢产物可能与Taq酶相互作用，进而抑制Taq酶的活性，使PCR扩增效率明显降低，导致定量测定结果偏低［1］。在临床检验标本中，溶血标本较为常见，究竟溶血到何种程度会对乙型肝炎病毒DNA定量结果产生影响？本文将探讨不同程度溶血对乙型肝炎病毒DNA定量检测的影响。
对象与方法
1.对象 我们收集了ALT＞40 U/L、HBsAg阳性、HBeAg阳性、HBcAb阳性的乙型肝炎患者30例,其中男性17例，女性13例，年龄在18～53岁之间。
2.试剂 深圳匹基公司提供的乙型肝炎病毒DNA检测试剂盒（批号：20070501）、乙型肝炎病毒DNA阳性标准品。
3.仪器 BECKMAN全自动血球计数仪（型号：Coulter Ac.Tdiffe）、Lightcycle荧光PCR扩增仪(罗氏公司)、高速低温离心机（Sigma公司）、干式恒温器（杭州蓝焰科技有限公司）、低温冰箱（SANYO公司）。
4. 方法
（1）模拟溶血标本的制备：抽取30例乙型肝炎患者血液后，2小时内离心分离血清，这种不含Hb的血清作为无Hb对照组，然后取每位患者600 μl血清及适量红细胞混合，置于-20℃冰箱保存备用。次日将含红细胞的血清管取出放于室温解冻，完全解冻后再将该管置于-20℃冷冻，如此反复冻融两次，使得RBC完全破裂，释放出Hb。在Coulter全自动血球计数仪测定每管红细胞裂解后的Hb浓度，再用每位患者的血清稀释，使得Hb终浓度为4 g/L、8 g/L、16 g/L、32 g/L，这些标本即为模拟溶血标本。
（2）乙型肝炎病毒DNA模板制备：取待测样本及阴、阳性对照（试剂盒备有）各100 μl,分别加入到0.5 ml的离心管中，再分别加入100 μl DNA提取液1，震荡混匀，13000 rpm离心10 min；吸弃上清液，再加入25 μl提取液2，震荡至沉淀完全散开，100℃干浴10 min；冷至室温后,13000 rpm离心10 min,保留上清液备用。
（3）PCR扩增：从试剂盒中取出乙型肝炎病毒DNA扩增反应液、Taq酶及UNG，室温融化后按规定比例混合均匀，根据试剂盒说明书配置反应液，分装于Roche毛细扩增管中，每次实验均设2管阴性对照，1管强阳性对照，1管临界阳性对照， 4管乙型肝炎病毒阳性工作标准品，其拷贝数分别为〗5.0×104、5.0×105、5.0×106、5.0×107拷贝/ml，将上述对照及样本各加2 μl于加好反应液的Roche毛细管中，短暂离心后上机扩增。对检测结果高于5.0×107拷贝/ml的标本进行稀释后再扩增，使其结果落在试剂盒检测线形范围内。
（4）核酸扩增与荧光数据采集：扩增条件设置为37℃孵育3分钟； 94℃变性1分钟；再进入40个循环，每一个循环包括92℃变性5秒，60℃退火及延伸30秒,在60℃时单点收集荧光信号；仪器检测通道选择F1通道。
（5）分析条件设定：选择F1通道，点击Quantification进入定量分析窗口，设定Analysis方式为proportional,选定Noise bank项，阈值选定为刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点，且Ct值不出现任何数据为准。
（6）数据分析：四个阳性标准品Ct值均须小于38.0，标准曲线的拟合度须小于-0.980，阴阳对照品扩增须符合预期要求，得出的待测样品的拷贝数才为可信结果。
5.统计学处理 将测得的乙型肝炎病毒DNA拷贝数转换成常用对数，再利用SPSS软件包进行统计，各含Hb的血清组与无Hb的血清组间差异采用配对t检验进行差异性检验。
结果
Hb为4、8、16、及32 g/L的血清组中乙型肝炎病毒DNA拷贝数与无Hb的血清组分别进行配对t检验，P值均大于0.05，因此每一组含Hb的乙型肝炎病毒DNA拷贝数与不含Hb的血清组均无显著性差异。见表1。
讨论
实时荧光定量PCR技术检测乙肝病毒DNA已在临床广泛使用，但在临床应用中，影响的因素也较多，如实验室条件，操作人员的技术，临床标本的状态等。一些研究认为溶血标本对FQPCR技术检测乙肝病毒DNA有影响，但也有研究认为这种影响并不显著［2］。本文通过模拟不同程度溶血标本，认为溶血达到32 g/L对检测结果无显著影响（P＞0.05）。陈英剑等认为溶血至20 g/L时对检测结果无影响，这与本文研究结论基本一致［3］。
本文将乙型肝炎患者抽血后2小时内分离的血清作无Hb对照组，然后通过反复冻融使标本溶血，再用乙型肝炎患者自身血清稀释以获得不同Hb浓度溶血标本，在模拟不同程度溶血标本过程中，不添加任何外来物质，使检测结果受外在因素影响程度减少到最低。实验结果经统计处理后，发现溶血程度控制Hb的浓度在32 g/L以下时，对乙型肝炎病毒DNA的检测结果无显著影响（P＞0.05）。出现此结果的原因可能有两个方面，一是在HBVDNA模板的提取过程中，标本中的Hb经100℃煮沸10分钟后已经变性沉淀，再经离心后，待测样本上清液中可能不会有Hb的存在，仅剩Hb的衍生物［4］。而且随着提取方法的不断改进，提取液中对DNA聚合酶的干扰物质不断减少，去除Hb越来越彻底。另一方面FQPCR对乙肝病毒DNA定量检测只是一种半定量方法，并不是对扩增后终产量进行完全定量，它是根据样本可检测的起始扩增时间与标准品扩增曲线得出的半定量结果。本文收集的30例病人的血清中HBVDNA含量均大于107 拷贝/ml,样本中HBVDNA含量较高，血清中HBVDNA含量小于107 拷贝/ml时，检测结果是否有差异，尚需进一步研究。且本文只对溶血程度小于32 g/L时进行探讨，溶血大于32 g/L时对检测结果的影响，也需进一步验证再作结论。溶血程度达到32 g/L时已是肉眼非常清晰可见，临床溶血样本的溶血程度大多在32 g/L以下，因此我们认为一般的溶血样本可以接受。但需注意的是，本文只是对深圳匹基公司试剂进行探讨，不同厂家，可能因使用不同的提取液及提取方法而出现不同的结论，有文献报道，使用PEG沉淀煮沸法和直接加热煮沸法提取HBVDNA所得的定量结果有差异，因此不同提取方法对检测结果有一定的影响［5］。一般而言厂家提供试剂时会给出较为清晰的影响试剂盒使用的各种因素，有能力的PCR实验室在试剂使用前，可进行此类评价实验，制订合适本实验室使用标本留取标准。随着卫生事业的发展，人们对检验质量的的要求越来越高，但检验质量不可避免的受较多因素影响，标本质量是重要的影响因素之一，如溶血、脂血、餐前、餐后等，对各项影响因素进行量化研究，如溶血、脂血达到何程度时则定为不合格样本，都应该有明确的指标。本文只对溶血程度小于32 g/L时进行探讨，溶血大于32 g/L时及血清中HBVDNA含量小于107 拷贝/ml拷贝时对检测结果的影响，需进一步验证再作结论。
参考文献
［1］黄 翔，王日军,周志明,等.溶血和脂血标本中乙肝病毒DNA提取方法的选择与评价［J］.华中医学杂志，2004，28（02）：123-124.
［2］李金明，王露楠. 样本处理对聚核酶链反应测定乙肝病毒核酸的的影响［J］.中华检验医学杂志，2000，23（6）：337-339.
［3］陈英剑，胡成进,齐法莲,等.溶血对荧光定量PCR检测HBV DNA结果的影响［J］.国外医学临床生物化学与检验学分册，2004，25（6）：563-564.
［4］陈晓东,陶志华,周 武.核酸提取方法在聚合酶反应测定乙肝病毒核酸中的评价［J］.中华检验杂志,2002,25(04)：212.
［5］程正江，付文荣,曾平凡.荧光定量聚合酶链反应直接检测血清中乙型肝炎病毒核酸方法的建立及评价［J］.中华检验医学杂志，2004，27（2）：102-103.
(收稿日期：2007-10-10 编辑：潘明志)
方法 采集30例乙型肝炎患者血液，分离血清，置于-20℃冰箱保存备用，并同时配制出含不同浓度Hb血清管。采用实时荧光定量PCR方法，检测含不同Hb浓度及不含Hb血清的乙型肝炎病毒DNA拷贝数，用配对t检验进行统计处理。结果 当标本中Hb浓度小于32 g/L时，Hb对检测血清乙型肝炎病毒DNA拷贝数无显著影响（P＞0.05）。结论 当Hb浓度较低时，Hb对血清乙型肝炎病毒DNA定量检测无显著影响，因此较低浓度溶血标本可以进行乙型肝炎病毒DNA的定量检测。
【关键词】 乙型肝炎病毒；DNA定量；溶血；PCR
文章编号：1003-1383(2008)01-0053-02中图分类号：R 620.446.11文献标识码：A
血清中乙型肝炎病毒DNA水平是判断乙型肝炎病毒在体内是否复制，患者传染性高低及选择治疗方案的重要指标。目前临床一般采用实时荧光定量PCR技术对乙型肝炎病毒DNA拷贝数进行定量检测。实时荧光定量PCR技术融汇了PCR技术的高效扩增，探针技术的高特异性，光谱技术的高敏感性等优点，通过直接检测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的结果。但此技术可能与标本状态密切相关，如溶血、脂血等。有研究表明Hb及其代谢产物可能与Taq酶相互作用，进而抑制Taq酶的活性，使PCR扩增效率明显降低，导致定量测定结果偏低［1］。在临床检验标本中，溶血标本较为常见，究竟溶血到何种程度会对乙型肝炎病毒DNA定量结果产生影响？本文将探讨不同程度溶血对乙型肝炎病毒DNA定量检测的影响。
对象与方法
1.对象 我们收集了ALT＞40 U/L、HBsAg阳性、HBeAg阳性、HBcAb阳性的乙型肝炎患者30例,其中男性17例，女性13例，年龄在18～53岁之间。
2.试剂 深圳匹基公司提供的乙型肝炎病毒DNA检测试剂盒（批号：20070501）、乙型肝炎病毒DNA阳性标准品。
3.仪器 BECKMAN全自动血球计数仪（型号：Coulter Ac.Tdiffe）、Lightcycle荧光PCR扩增仪(罗氏公司)、高速低温离心机（Sigma公司）、干式恒温器（杭州蓝焰科技有限公司）、低温冰箱（SANYO公司）。
4. 方法
（1）模拟溶血标本的制备：抽取30例乙型肝炎患者血液后，2小时内离心分离血清，这种不含Hb的血清作为无Hb对照组，然后取每位患者600 μl血清及适量红细胞混合，置于-20℃冰箱保存备用。次日将含红细胞的血清管取出放于室温解冻，完全解冻后再将该管置于-20℃冷冻，如此反复冻融两次，使得RBC完全破裂，释放出Hb。在Coulter全自动血球计数仪测定每管红细胞裂解后的Hb浓度，再用每位患者的血清稀释，使得Hb终浓度为4 g/L、8 g/L、16 g/L、32 g/L，这些标本即为模拟溶血标本。
（2）乙型肝炎病毒DNA模板制备：取待测样本及阴、阳性对照（试剂盒备有）各100 μl,分别加入到0.5 ml的离心管中，再分别加入100 μl DNA提取液1，震荡混匀，13000 rpm离心10 min；吸弃上清液，再加入25 μl提取液2，震荡至沉淀完全散开，100℃干浴10 min；冷至室温后,13000 rpm离心10 min,保留上清液备用。
（3）PCR扩增：从试剂盒中取出乙型肝炎病毒DNA扩增反应液、Taq酶及UNG，室温融化后按规定比例混合均匀，根据试剂盒说明书配置反应液，分装于Roche毛细扩增管中，每次实验均设2管阴性对照，1管强阳性对照，1管临界阳性对照， 4管乙型肝炎病毒阳性工作标准品，其拷贝数分别为〗5.0×104、5.0×105、5.0×106、5.0×107拷贝/ml，将上述对照及样本各加2 μl于加好反应液的Roche毛细管中，短暂离心后上机扩增。对检测结果高于5.0×107拷贝/ml的标本进行稀释后再扩增，使其结果落在试剂盒检测线形范围内。
（4）核酸扩增与荧光数据采集：扩增条件设置为37℃孵育3分钟； 94℃变性1分钟；再进入40个循环，每一个循环包括92℃变性5秒，60℃退火及延伸30秒,在60℃时单点收集荧光信号；仪器检测通道选择F1通道。
（5）分析条件设定：选择F1通道，点击Quantification进入定量分析窗口，设定Analysis方式为proportional,选定Noise bank项，阈值选定为刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点，且Ct值不出现任何数据为准。
（6）数据分析：四个阳性标准品Ct值均须小于38.0，标准曲线的拟合度须小于-0.980，阴阳对照品扩增须符合预期要求，得出的待测样品的拷贝数才为可信结果。
5.统计学处理 将测得的乙型肝炎病毒DNA拷贝数转换成常用对数，再利用SPSS软件包进行统计，各含Hb的血清组与无Hb的血清组间差异采用配对t检验进行差异性检验。
结果
Hb为4、8、16、及32 g/L的血清组中乙型肝炎病毒DNA拷贝数与无Hb的血清组分别进行配对t检验，P值均大于0.05，因此每一组含Hb的乙型肝炎病毒DNA拷贝数与不含Hb的血清组均无显著性差异。见表1。
讨论
实时荧光定量PCR技术检测乙肝病毒DNA已在临床广泛使用，但在临床应用中，影响的因素也较多，如实验室条件，操作人员的技术，临床标本的状态等。一些研究认为溶血标本对FQPCR技术检测乙肝病毒DNA有影响，但也有研究认为这种影响并不显著［2］。本文通过模拟不同程度溶血标本，认为溶血达到32 g/L对检测结果无显著影响（P＞0.05）。陈英剑等认为溶血至20 g/L时对检测结果无影响，这与本文研究结论基本一致［3］。
本文将乙型肝炎患者抽血后2小时内分离的血清作无Hb对照组，然后通过反复冻融使标本溶血，再用乙型肝炎患者自身血清稀释以获得不同Hb浓度溶血标本，在模拟不同程度溶血标本过程中，不添加任何外来物质，使检测结果受外在因素影响程度减少到最低。实验结果经统计处理后，发现溶血程度控制Hb的浓度在32 g/L以下时，对乙型肝炎病毒DNA的检测结果无显著影响（P＞0.05）。出现此结果的原因可能有两个方面，一是在HBVDNA模板的提取过程中，标本中的Hb经100℃煮沸10分钟后已经变性沉淀，再经离心后，待测样本上清液中可能不会有Hb的存在，仅剩Hb的衍生物［4］。而且随着提取方法的不断改进，提取液中对DNA聚合酶的干扰物质不断减少，去除Hb越来越彻底。另一方面FQPCR对乙肝病毒DNA定量检测只是一种半定量方法，并不是对扩增后终产量进行完全定量，它是根据样本可检测的起始扩增时间与标准品扩增曲线得出的半定量结果。本文收集的30例病人的血清中HBVDNA含量均大于107 拷贝/ml,样本中HBVDNA含量较高，血清中HBVDNA含量小于107 拷贝/ml时，检测结果是否有差异，尚需进一步研究。且本文只对溶血程度小于32 g/L时进行探讨，溶血大于32 g/L时对检测结果的影响，也需进一步验证再作结论。溶血程度达到32 g/L时已是肉眼非常清晰可见，临床溶血样本的溶血程度大多在32 g/L以下，因此我们认为一般的溶血样本可以接受。但需注意的是，本文只是对深圳匹基公司试剂进行探讨，不同厂家，可能因使用不同的提取液及提取方法而出现不同的结论，有文献报道，使用PEG沉淀煮沸法和直接加热煮沸法提取HBVDNA所得的定量结果有差异，因此不同提取方法对检测结果有一定的影响［5］。一般而言厂家提供试剂时会给出较为清晰的影响试剂盒使用的各种因素，有能力的PCR实验室在试剂使用前，可进行此类评价实验，制订合适本实验室使用标本留取标准。随着卫生事业的发展，人们对检验质量的的要求越来越高，但检验质量不可避免的受较多因素影响，标本质量是重要的影响因素之一，如溶血、脂血、餐前、餐后等，对各项影响因素进行量化研究，如溶血、脂血达到何程度时则定为不合格样本，都应该有明确的指标。本文只对溶血程度小于32 g/L时进行探讨，溶血大于32 g/L时及血清中HBVDNA含量小于107 拷贝/ml拷贝时对检测结果的影响，需进一步验证再作结论。
参考文献
［1］黄 翔，王日军,周志明,等.溶血和脂血标本中乙肝病毒DNA提取方法的选择与评价［J］.华中医学杂志，2004，28（02）：123-124.
［2］李金明，王露楠. 样本处理对聚核酶链反应测定乙肝病毒核酸的的影响［J］.中华检验医学杂志，2000，23（6）：337-339.
［3］陈英剑，胡成进,齐法莲,等.溶血对荧光定量PCR检测HBV DNA结果的影响［J］.国外医学临床生物化学与检验学分册，2004，25（6）：563-564.
［4］陈晓东,陶志华,周 武.核酸提取方法在聚合酶反应测定乙肝病毒核酸中的评价［J］.中华检验杂志,2002,25(04)：212.
［5］程正江，付文荣,曾平凡.荧光定量聚合酶链反应直接检测血清中乙型肝炎病毒核酸方法的建立及评价［J］.中华检验医学杂志，2004，27（2）：102-103.
(收稿日期：2007-10-10 编辑：潘明志)