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摘要 RNAi技术是研究基因功能的重要工具。其原理是对某个已知基因，设计诱导其沉默的dsRNA，通过合适手段导入细胞或机体使产生干涉效应的信号分子siRNA，导致基因表达水平下降或完全沉默。通过基因表型变化，鉴定该基因功能。从RNAi的研究背景和作用机制出发，对近年来利用RNAi技术研究植物基因功能的概况、诱导方法和载体作一综述。
关键词 基因沉默；RNAi技术；植物基因功能
1RANi的研究背景
1998年，Fire等[1]发现，过去利用正反义RNA阻断基因表达都是因体外制备的单链RNA中污染极少量双链RNA（dsRNA）所引起的，并发现在线虫中导入dsRNA，mRNA明显减少，推论存在某种机制特异地破坏降解内源mRNA，导致某个基因沉默，即转录后基因沉默（PTGS）。在此情况下，启动子是活跃的但不能正常积累mRNA。这种现象被称为RNA干涉（RNAi）。研究表明RNAi现象广泛存在大多数真核生物中，起到自行监控细胞中异常的mRNA、封闭该基因表达、抵御病毒感染及阻断转座子的作用。
RNAi技术是将人工合成或载体表达的小的双链RNA（siRNA）导入真核细胞，促使内源RNA降解，高效特异阻断体内特定基因的表达，诱使细胞表现出特定基因缺失表型，获得功能丧失或降低的突变体。RNAi技术具有高度的特异性和高效的干扰活力，是研究基因功能的强有力的工具而被广泛应用。
2RNAi的作用机制
对模式生物的研究发现[2]，生物体内外源或内源的dsRNA经酶切，可形成具有5’末端磷酸基、3’末端羟基和2个突出的单链核苷酸的信号分子siRNA，诱发RNAi机制。最近研究中还发现，在植物中除了转录后水平沉默（PTGS），RNAi也能在基因的转录水平（TGS）上发挥作用。
2.1酶的作用
参与RNAi发生的Dicer酶特异识别dsRNA，该酶依赖ATP，能将转基因和病毒感染等引入的dsRNA，逐步切割成含21-23个核苷酸siRNA，启动细胞内RNAi反应。RNAi过程的另一种重要的酶是RNA指导的RNA聚合酶（RdRP）。RdRP的作用，使进入细胞内的dsRNA数量呈指数级扩增，RNAi效应得以放大。故少量dsRNA可使大量靶mRNA大幅度下调。
2.2RNAi过程
dsRNA进入细胞后，在Dicer酶作用下被裂解成siRNA，双链解开为单链，并和某些蛋白质相结合形成RNA诱导的沉默复合体（RISC）。在ATP的作用下，活化解链siRNA指导活化的RISC分裂靶mRNA。另外，在RdRP作用下，以siRNA为模板合成mRNA互补链，结果mRNA变成dsRNA，在Dicer酶的作用下被切成siRNA，重复进行分裂靶mRNA。
3RNAi技术在植物基因功能方面的研究
RNAi被生物学家称为生物体在基因组水平上的免疫系统，也为植物基因功能的研究提供了新的思路和技术平台，即利用RNAi技术进行逆向基因分析。针对某个已知的基因，设计可诱导其沉默的双链RNA，通过合适的手段导入细胞或机体，使该基因表达水平下降或完全沉默。观察基因表型的变化，鉴定基因在基因组中的功能。这仅仅是使表达暂时降低或抑制，基因的信息仍是完整的。
最初在植物中研究RNAi的实验是使水稻中报告基因GUS沉默，来比较正义链、反义链及dsRNA诱导RNAi效率的高低。近年来利用RNAi技术在水稻、拟南芥、芸薹属、油菜、烟草及棉花上，已经进行了一些基因功能验证的相关研究[3]。其中研究最深入的是应用RNAi技术进行大规模拟南芥功能基因组的分析，以获得拟南芥全基因组高质量的基因序列标签（GST）[4]。
3.1植物体中的RNAi诱导方法
研究表明，在植物体中，信号分子siRNA可通过植物的维管系统运输。通过韧皮部进行长距离运输或通过胞间连丝进行细胞与细胞之间的转运。将目标基因特异性序列以正向和反方分别插入标记基因或内含子的5’端和3’端，再在一端连接一个启动子，用转基因技术将反式重复的外源基因导入生物体，诱导表达发夹结构的转录产物RNA（iphRNA），能产生稳定遗传的RNAi现象[5]，其诱导目的基因沉默效率高，适用性广，应用潜力大。dsRNA或iphRNA能通过以下几种方法呈递到植物体内。
3.1.1微弹轰击法。将dsRNA或含内含子的发夹结构RNA（iphRNA）表达载体显微注射入植物体内。
3.1.2农杆菌介导法。将带有能转录成ihpRNA的反式重复的外源基因的T-DNA质粒，通过农杆菌介导整合到植物基因组上。
3.1.3病毒诱导基因沉默（VIGS）。目标序列整合入病毒基因序列，通过农杆菌介导转化ihpRNA表达。
3.2相关的干涉载体
Helliwell及其同事利用Invitrogen公司的Gateway重组克隆技术，构建高通量基因沉默的载体系列pHELLSGATE，
包括全部拟南芥基因组的ihpRNA转基因系[7]。澳大利亚的CSIRO公司也构建出多种适用于禾本科植物的RNAi载体——pHannibal和pKannibal质粒载体系列[7]。还有用于高通量植物功能基因组构建的载体系列，包括适合组成型表达、诱导型异常表达的GUS或GFP融合蛋白双元载体，和以烟草花叶病毒为基础构建的高通量VICS载体系列。新载体的开发加快了植物功能基因组的研究。
3.3RNAi为注释和认识同源基因及功能提供了快速、高效的鉴定方法
比较接近的物种，可通过比较基因组加快研究进度。利用传统基因敲除或反义RNA的方法使基因沉默来研究基因家族的功能，往往难以达到理想效果，但应用RNi技术能更好地研究同源基因。Frankish[4]使用RNAi的方法，证实通过合理设计双链RNA，可有效地同时沉默1个基因家族，为多倍体物种的功能基因组学研究指明了方向。
4RNAi技术在植物功能基因组研究中的应用展望及挑战
RNAi现象在植物体内能以孟德尔方式遗传，高度的特异性高效干扰活力，使得RNAi技术在植物学各个研究领域得到广泛应用。但RNAi技术应用于高通量的植物功能基因组学的研究也有一定的限制。首先，目的基因序列必须是已知，随着基因组和EST测序计划的增加，受序列方面的限制将会减少；其次，dsRNA限制了高通量方法的应用，目前只有少数植物能被成功转化，稳定表达ihpRNA。因此，必须改进植物基因干涉载体的转化方法，加快新载体的开发；第三，并非所有基因都可被沉默，表达水平低的基因RNAi现象不明显。对多因一效基因或同源性较高的基因家族，干涉会同时作用这些基因，沉默表型难以鉴定；另外，基因被沉默的表型与转基因时所引起的插入突变表型，有时难以区别。
RNAi作为后基因组时代基因功能验证和表达调控分析的新技术，有着不可估量的应用价值。可以预见，随着RNAi技术的不断完善，植物基因功能的研究和应用将取得更大成果。
5参考文献
[1] FIRE A，XU S，MONTGOMERY M，KOSTAS S，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature，1998，391：806-811.
[2] AGRAWA IN，DASARADHI PVN，MOHOMMED A，et al.RNA Interference：Biology，Mechanism and Applications[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews.2003，67：657-685.
[3] NANCY A E.RNA goesmobile[J].Plant Cell，2002（14）：1433-1436.
[4] FRANKISH H.Consortium uses RNAi to uncover[J].gene’s funtion.Lancet，2003，361：584.
[5] KLINK V P，WOLNAK S M.The efficacy of RNAi in the study of the plant cytocke leron.Plant Physiology，2003，131：1165-1168.
[6] CROWE M D，GROSSNIKLAUS U.A gateway cloning vector set for high-througput funtional analysis of genes in plant[J].Plant Physiology，2003，133：462-469.
[7] WESLEY S V，HELLIWELL C A，Smith NAetal.Construct designfo efficient，effective and high-through put genesilencing in plants [J].Plant Journal，2001，27（6）：581-590.
关键词 基因沉默；RNAi技术；植物基因功能
1RANi的研究背景
1998年，Fire等[1]发现，过去利用正反义RNA阻断基因表达都是因体外制备的单链RNA中污染极少量双链RNA（dsRNA）所引起的，并发现在线虫中导入dsRNA，mRNA明显减少，推论存在某种机制特异地破坏降解内源mRNA，导致某个基因沉默，即转录后基因沉默（PTGS）。在此情况下，启动子是活跃的但不能正常积累mRNA。这种现象被称为RNA干涉（RNAi）。研究表明RNAi现象广泛存在大多数真核生物中，起到自行监控细胞中异常的mRNA、封闭该基因表达、抵御病毒感染及阻断转座子的作用。
RNAi技术是将人工合成或载体表达的小的双链RNA（siRNA）导入真核细胞，促使内源RNA降解，高效特异阻断体内特定基因的表达，诱使细胞表现出特定基因缺失表型，获得功能丧失或降低的突变体。RNAi技术具有高度的特异性和高效的干扰活力，是研究基因功能的强有力的工具而被广泛应用。
2RNAi的作用机制
对模式生物的研究发现[2]，生物体内外源或内源的dsRNA经酶切，可形成具有5’末端磷酸基、3’末端羟基和2个突出的单链核苷酸的信号分子siRNA，诱发RNAi机制。最近研究中还发现，在植物中除了转录后水平沉默（PTGS），RNAi也能在基因的转录水平（TGS）上发挥作用。
2.1酶的作用
参与RNAi发生的Dicer酶特异识别dsRNA，该酶依赖ATP，能将转基因和病毒感染等引入的dsRNA，逐步切割成含21-23个核苷酸siRNA，启动细胞内RNAi反应。RNAi过程的另一种重要的酶是RNA指导的RNA聚合酶（RdRP）。RdRP的作用，使进入细胞内的dsRNA数量呈指数级扩增，RNAi效应得以放大。故少量dsRNA可使大量靶mRNA大幅度下调。
2.2RNAi过程
dsRNA进入细胞后，在Dicer酶作用下被裂解成siRNA，双链解开为单链，并和某些蛋白质相结合形成RNA诱导的沉默复合体（RISC）。在ATP的作用下，活化解链siRNA指导活化的RISC分裂靶mRNA。另外，在RdRP作用下，以siRNA为模板合成mRNA互补链，结果mRNA变成dsRNA，在Dicer酶的作用下被切成siRNA，重复进行分裂靶mRNA。
3RNAi技术在植物基因功能方面的研究
RNAi被生物学家称为生物体在基因组水平上的免疫系统，也为植物基因功能的研究提供了新的思路和技术平台，即利用RNAi技术进行逆向基因分析。针对某个已知的基因，设计可诱导其沉默的双链RNA，通过合适的手段导入细胞或机体，使该基因表达水平下降或完全沉默。观察基因表型的变化，鉴定基因在基因组中的功能。这仅仅是使表达暂时降低或抑制，基因的信息仍是完整的。
最初在植物中研究RNAi的实验是使水稻中报告基因GUS沉默，来比较正义链、反义链及dsRNA诱导RNAi效率的高低。近年来利用RNAi技术在水稻、拟南芥、芸薹属、油菜、烟草及棉花上，已经进行了一些基因功能验证的相关研究[3]。其中研究最深入的是应用RNAi技术进行大规模拟南芥功能基因组的分析，以获得拟南芥全基因组高质量的基因序列标签（GST）[4]。
3.1植物体中的RNAi诱导方法
研究表明，在植物体中，信号分子siRNA可通过植物的维管系统运输。通过韧皮部进行长距离运输或通过胞间连丝进行细胞与细胞之间的转运。将目标基因特异性序列以正向和反方分别插入标记基因或内含子的5’端和3’端，再在一端连接一个启动子，用转基因技术将反式重复的外源基因导入生物体，诱导表达发夹结构的转录产物RNA（iphRNA），能产生稳定遗传的RNAi现象[5]，其诱导目的基因沉默效率高，适用性广，应用潜力大。dsRNA或iphRNA能通过以下几种方法呈递到植物体内。
3.1.1微弹轰击法。将dsRNA或含内含子的发夹结构RNA（iphRNA）表达载体显微注射入植物体内。
3.1.2农杆菌介导法。将带有能转录成ihpRNA的反式重复的外源基因的T-DNA质粒，通过农杆菌介导整合到植物基因组上。
3.1.3病毒诱导基因沉默（VIGS）。目标序列整合入病毒基因序列，通过农杆菌介导转化ihpRNA表达。
3.2相关的干涉载体
Helliwell及其同事利用Invitrogen公司的Gateway重组克隆技术，构建高通量基因沉默的载体系列pHELLSGATE，
包括全部拟南芥基因组的ihpRNA转基因系[7]。澳大利亚的CSIRO公司也构建出多种适用于禾本科植物的RNAi载体——pHannibal和pKannibal质粒载体系列[7]。还有用于高通量植物功能基因组构建的载体系列，包括适合组成型表达、诱导型异常表达的GUS或GFP融合蛋白双元载体，和以烟草花叶病毒为基础构建的高通量VICS载体系列。新载体的开发加快了植物功能基因组的研究。
3.3RNAi为注释和认识同源基因及功能提供了快速、高效的鉴定方法
比较接近的物种，可通过比较基因组加快研究进度。利用传统基因敲除或反义RNA的方法使基因沉默来研究基因家族的功能，往往难以达到理想效果，但应用RNi技术能更好地研究同源基因。Frankish[4]使用RNAi的方法，证实通过合理设计双链RNA，可有效地同时沉默1个基因家族，为多倍体物种的功能基因组学研究指明了方向。
4RNAi技术在植物功能基因组研究中的应用展望及挑战
RNAi现象在植物体内能以孟德尔方式遗传，高度的特异性高效干扰活力，使得RNAi技术在植物学各个研究领域得到广泛应用。但RNAi技术应用于高通量的植物功能基因组学的研究也有一定的限制。首先，目的基因序列必须是已知，随着基因组和EST测序计划的增加，受序列方面的限制将会减少；其次，dsRNA限制了高通量方法的应用，目前只有少数植物能被成功转化，稳定表达ihpRNA。因此，必须改进植物基因干涉载体的转化方法，加快新载体的开发；第三，并非所有基因都可被沉默，表达水平低的基因RNAi现象不明显。对多因一效基因或同源性较高的基因家族，干涉会同时作用这些基因，沉默表型难以鉴定；另外，基因被沉默的表型与转基因时所引起的插入突变表型，有时难以区别。
RNAi作为后基因组时代基因功能验证和表达调控分析的新技术，有着不可估量的应用价值。可以预见，随着RNAi技术的不断完善，植物基因功能的研究和应用将取得更大成果。
5参考文献
[1] FIRE A，XU S，MONTGOMERY M，KOSTAS S，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature，1998，391：806-811.
[2] AGRAWA IN，DASARADHI PVN，MOHOMMED A，et al.RNA Interference：Biology，Mechanism and Applications[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews.2003，67：657-685.
[3] NANCY A E.RNA goesmobile[J].Plant Cell，2002（14）：1433-1436.
[4] FRANKISH H.Consortium uses RNAi to uncover[J].gene’s funtion.Lancet，2003，361：584.
[5] KLINK V P，WOLNAK S M.The efficacy of RNAi in the study of the plant cytocke leron.Plant Physiology，2003，131：1165-1168.
[6] CROWE M D，GROSSNIKLAUS U.A gateway cloning vector set for high-througput funtional analysis of genes in plant[J].Plant Physiology，2003，133：462-469.
[7] WESLEY S V，HELLIWELL C A，Smith NAetal.Construct designfo efficient，effective and high-through put genesilencing in plants [J].Plant Journal，2001，27（6）：581-590.