【摘 要】
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目的 观察经红细胞生成素(EPO)干预后,体外模拟急性肾损伤(AKI)微环境下培养骨髓间充质干细胞(MSC)的分裂增殖情况,并探讨产生这种变化的可能机制.方法 抽取C57BL/6小鼠的骨
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目的 观察经红细胞生成素(EPO)干预后,体外模拟急性肾损伤(AKI)微环境下培养骨髓间充质干细胞(MSC)的分裂增殖情况,并探讨产生这种变化的可能机制.方法 抽取C57BL/6小鼠的骨髓,经Percoll密度梯度离心联合贴壁培养法分离纯化出小鼠MSC(mMSC),以流式细胞仪鉴定.夹闭雄性C57BL/6小鼠双侧肾蒂30 min再开放30 min的方法制作AKI鼠模型,即刻取双侧肾脏皮质制作缺血再灌注(IR)肾脏匀浆上清.取扩增第3代的mMSC分组培养:A组:含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基;B组:含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基+IR肾脏匀浆上清,体外模拟AKI微环境干预mMSC;C组:含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基+IR肾脏匀浆上清+不同浓度EPO(1、5、10、50 U/ml).培养1、3、5、7 d.CCK-8法检测各组培养mMSC的增殖,TUNEL法检测mMSC凋亡,Western印迹法检测mMSC表面EPO受体(EPOR)及增殖凋亡相关信号通路蛋白的表达.结果 CCK-8法检测显示,经IR肾脏匀浆上清干预后,不同时间点mMSC的增殖效应显著减弱(P＜0.01),而TUNEL检测表明其胞核染色阳性细胞的百分比显著高于A组(P＜0.01);给予EPO干预后,mMSC的增殖能力增强,胞核染色阳性细胞百分比降低,具有浓度依赖效应.Western印迹结果显示,第3代mMSC表面存在EPOR表达,培养5 d后EPOR相对表达量为0.092±0.015.EPO以剂量和时间依赖性降低AKI微环境下凋亡相关蛋白caspase-3的表达,同时上调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达.用10 U/ml EPO干预5 d后,相对于B组,磷酸化蛋白酪氨酸激酶2及磷酸化信号转导和转录因子的表达均显著上调(均P＜0.01).结论 EPO能促进体外AKI微环境干预下培养mMSC的增殖,减轻其凋亡,该效应经EPOR介导,并与增殖凋亡相关信号通路蛋白有关.
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