【摘 要】
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目的 研究条件复制型腺病毒(CRAd)联合单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统对人视网膜母细胞瘤(RB)细胞系Y79细胞的杀伤作用.方法 实验研究.将携带HSVtk
【机 构】
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上海交通大学医学院附属新华医院眼科,上海交通大学附属上海市第一人民医院中心实验室
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目的 研究条件复制型腺病毒(CRAd)联合单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统对人视网膜母细胞瘤(RB)细胞系Y79细胞的杀伤作用.方法 实验研究.将携带HSVtk的由人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控腺病毒复制必需基因E1A的CRAd,即Ad-hTERT-E1A-CMV-HSVtk感染Y79细胞和原代培养的人视网膜色素上皮(hRPE)细胞.通过测量Y79和hRPE细胞感染病毒后0 h、24 h、48 h和72 h时的病毒滴度,观察CRAd在Y79细胞中的选择性复制情况.CRAd联合HSVtk/GCV自杀基因系统对Y79细胞的杀伤实验分为5组:分别为细胞未经GCV和腺病毒处理的阴性对照组,感染野生型腺病毒dl309的阳性对照组,单独应用GCV组,单独应用CRAd组及CRAd联合GCV处理组.以1、10、50和100感染复数(MOI)的CRAd或dl309感染Y79细胞.病毒感染48 h后,培养液换成含10 μg/ml的GCV或不含GCV的新鲜培养液.细胞继续培养3 d后分别以生物发光成像(BLI)和CCK-8方法检测各组Y79细胞的生物发光强度和细胞存活率.采用单因素方差分析对各组细胞的生物发光强度和存活率进行比较.结果 在Y79细胞感染CRAd后的72 h内,病毒量呈指数级增加,较感染前增加了 100多倍.CRAd在hRPE细胞中无明显复制.BLI和CCK-8检测均发现,在低剂量(MOI≤10)时,CRAd及其联合HSVtk/GCV自杀基因系统对Y79细胞无明显的杀伤效应.在高剂量(MOI≥50)时,CRAd对Y79细胞有一定的杀伤作用,其联合HSVtk/GCV后,杀伤作用更明显.在50和100 MOI时,CRAd可分别导致大约20%和30%的细胞死亡,其联合GCV后,可分别导致50%和80%的细胞死亡.结论 CRAd可在Y79细胞中选择性大量复制,其联合HSVtk/GCV自杀基因系统对Y79细胞有明显的杀伤作用.
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