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摘要 [目的]探讨不同金银花（Lonicera japonica）品种间的遗传关系。[方法]利用RAPD分子标记技术对胶东地区31个金银花品种的遗传多样性及遗传关系进行研究。[结果]5个引物共扩增出650条带，每个引物可扩增出0～9个条带。聚类分析结果表明，31个金银花品种可以分为两大类，采自昆嵛山太白顶的金银花品种为一类，其余30个金银花品种为一类。从遗传距离来看，采自昆嵛山太白顶的品种与中医世家引进金银花品种大毛花遗传距离最远，为2.507；采自龙口兰高镇马蔺塂（Ⅱ）与中医世家引进金银花品种四季丰遗传距离最近，为0.020。[结论]不同金银花种源间具有较高的遗传多样性，不同金银花种源间的遗传关系与地理分布有一定的相关性。
关键词 金银花；聚类分析；遗传多样性；RAPD；胶东地区
中图分类号 S567.7+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）13-0145-02
RADP Analysis of Genetic Relationships Among Cultivars of Lonicera japonica in Jiaodong Region
WANG Yi-fei1 ， LIU Lin-de1*， GE Yi-he1 et al
（1.College of Life Sciences，Ludong University，Yantai，Shandong 264100）
Abstract [Objective]Genetic relationships among cultivars of Lonicera japonica were studied.[Method]Genetic diversity and genetic relationship of 31 varieties of L. japonica in Jiaodong Region were studied by using Random Amplified Polymorphic DNA （RAPD） molecular marker technology. [Result]5 primers were used to amplify 650 bands. Each primer could amplify 0-9 bands. The result of cluster analysis showed 31 kinds of L. japonica varieties could be divided into two categories， one was from Taibai Top of Kunyu mountain， the other was anther category. From the genetic distance， the variety from Taibai Top of Kunyu mountain and the Damao flower which was introduced by family of traditional Chinese Medicine had the farthest genetic distance， it was 2.507.The variety from the Malin Port of Longkou Langao town and the Sijifeng flower which was introduced by family of traditional Chinese Medicine had the nearest genetic distance， it was 0.020. [Conclusion]There was high genetic diversity among different cultivars of L. japonica，the genetic relationship among different cultivars of L. japonica had a certain correlation with geographical distribution.
Key words Lonicera japonica；Cluster analysis；Genetic diversity；RAPD；Jiaodong region
金银花（Lonicera japonica）为忍冬科忍冬属多年生半常绿藤本植物[1]。全世界忍冬属植物约200种，我国有98种[2]。金银花具有清热解毒、消炎退肿、保肝抗病毒、延缓衰老的功效，研究发现它还具有良好的抗癌、抗艾滋病的作用，属卫生部、国家药品监督管理局和国家工商局关于30个贵重药材的通知品种，被列为出口创汇的主要品种[2]。同时，由于金银花根系发达，耐旱、耐寒热、耐瘠薄、耐盐碱，因而又是水土保持和沙漠治理的良好树种[3]。
我国忍冬科植物在全国各省各地形区均有分布，尤以西南地区种类最多，可供药用的种类达47种，其中作为金银花药材原植物的有忍冬（Lonicera japonica Thunb.）、菰腺忍冬（Lonicera hypoglauca Miq.）、山银花（Lonicera hypoglauca）和毛花柱忍冬（Lonicera dasystyla Rehd.），以山东平邑和河南封丘为道地产区[4]。随着应用范围的扩大和需求量的增加，金银花野生资源逐渐减少，人工栽培已成为金银花药材的主要来源，山東、河南等省均有大面积的金银花栽培种植基地[5]。不同种金银花在株型、枝条、叶片形态及化学成分含量等方面均存在较大差异，种内遗传变异十分显著[5]。该研究利用RAPD分子标记技术对胶东地区31个金银花品种进行遗传多样性分析，旨在探讨不同金银花品种间的遗传关系，为该地区金银花品种间的关系提供分子系统学资料，为进一步选育金银花优良品种奠定理论基础[6]。 1 材料與方法
1.1 材料
供试的金银花材料为采自昆嵛山、牙山、招虎山等胶东不同地区的27个品种，以及烟台中医世家引进的美国金银花、四季丰、巨丰1号、大毛花4个优良的金银花品种（表1）。
1.2 仪器和试剂
所用仪器有PTC-200基因扩增仪、微型离心机、凝胶成像系统、电泳仪、水平电泳槽和超微量紫外分光光度计。
试验用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒、琼脂糖、引物、RNA酶、TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffer、Mg2+、dNTPs均购自上海生工生物工程股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 基因组DNA的提取。
采集31个金银花品种的幼嫩枝叶，称取100 mg在液氮中充分研磨成粉末，利用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒提取金银花基因组DNA，对提取的基因组DNA用超微量分光光度计检测其浓度及纯度，-20 ℃保存备用。
1.3.2 PCR反应。
利用设计的引物进行PCR扩增。反应体系总体积为25 μL，包括10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/L的 Mg2+ 1.5 μL，2.5 mmol/L 的dNTPs 2 μL，10 ng/μL引物1 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶1 μL，20 ng/μL的DNA模板1 μL，ddH2O 16 μL。
扩增程序为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性1 min，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，40个循环；72 ℃延伸10 min。扩增结束后将反应产物于4 ℃保存。
1.3.3 电泳。
取10 μL PCR产物，加3 μL Loading Buffer，电泳。电泳结束后，将凝胶置于凝胶成像系统上观察拍照。
1.4 数据分析
将电泳图谱上清晰出现的条带做出统计，由此生成原始矩阵。利用SPSS软件计算任意2个品种间的遗传距离，并利用该软件的聚类分析方法建立不同种源间的遗传关系树状图。
2 结果与分析
2.1 RAPD-PCR扩增结果
对供试的31个金银花品种进行PCR扩增，对所用5个引物的扩增结果进行统计分析（表1）。5个引物共扩增出650条带，不同引物扩增DNA片段数0～9条不等，分子量范围为100～3 000 bp。650条DNA扩增带中，585条带具有多态性，多态条带比率为90%，这表明供试的31个金银花品种间RAPD条带多态性高，遗传多样性丰富。
2.2 聚类分析结果
根据RAPD数据，利用SPSS软件对31个金银花品种间的遗传距离和相似系数进行计算，并进行聚类分析，建立聚类分支树状图[7]。由图1可知，供试材料可分为两类，样品1（采自昆嵛山太白顶）为一类，其余30个样品为一类。而在剩余的30个金银花品种中，样品2（采自昆嵛山林场）、3（采自乳山东夼钟家）、4（采自文登新村）、7（采自栖霞牙山）、8（采自牟平磨石格庄）、14（采自招远上院村）、16（采自海阳东村）、18（采自海阳招虎山东）、24（采自临朐沂山居委会）、31（大毛花）为一类，剩余的部分为另一类。
根据31个金银花品种间的遗传距离可以看出，品种1（采自昆嵛山太白顶）与品种31（大毛花）之间遗传距离最远，为2507；品种25[采自龙口兰高镇马蔺塂（Ⅱ）]与品种29（四季丰）遗传距离最近为0.020，这与聚类分析结果相符。品种1（采自昆嵛山太白顶）与品种31（大毛花）亲缘关系最远，品种25[采自龙口兰高镇马蔺塂（Ⅱ）]与品种29（四季丰）亲缘关系最近。
3 讨论与结论
RAPD分子标记被广泛应用于作物品种或种子纯度鉴定，具有简便快速等优点，但也存在条带稳定性差、饰演重复性低等问题[5，8]。为了保证试验的准确性和可重复性，严格控制反应条件的一致性，每个引物多次重复，统计稳定出现、重复性高的条带并进行遗传分析，放弃重复性低的模糊条带[5，9]。在此基础上所获得的数据是可靠的，试验结果能真实反映胶东地区31个金银花品种的遗传特征。
从供试材料的聚类分析结果可以看出，样品1（采自昆嵛山太白顶）聚为一类，其余30个金银花品种聚为一类。聚类结果与形态学分类相符。此外，31个金银花品种遗传多样性丰富，表现出了不同的遗传特征，品种间遗传差异较大。而遗传多样性反映了物种的遗传背景、育种潜力和利用价值[10]。通过对扩增条带的分析，可以清楚地对供试31个金银花品种进行分类，说明运用RAPD技术对金银花进行分子水平的鉴定是可行的[11]，可以为供试31个金银花品种的进一步开发利用提供详细的分子生物学依据。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：化学工业出版社，2000：177.
[2] 中国科学院植物志编辑委员会.中国植物志：第72卷[M].北京：科学出版社，1988：236-238.
[3] 李金璐，王硕，于婧，等.一种改良的植物DNA提取方法[J].植物学报，2013，48（1）：72-78.
[4] 周凤琴，张永清，张芳，等.山东金银花种质资源的调查研究[J].山东中医杂志，2006，25（4）：268-271.
[5] 杨飞，张敏，彭兴扬，等.金银花五个品系的RAPD分析及DNA指纹图谱的建立[J].武汉植物学研究，2007，25（3）：235-238.
[6] 向增旭，郭巧生.不同金银花种源间遗传关系的RAPD分析[J].植物资源与环境学报，2007，16（2）：57-59.
[7] 谭贤杰，吴子恺，程伟东，等.关联分析及其在植物遗传学研究中的应用[J].植物学报，2011，46（1）：108-118.
[8] LI Y，DING W L.RAPD profiling in detecting genetic diversity in partial Trollius accessions of China[J].Biochemical genetics，2010，48：34-43.
[9] SUN Z Y，GAO T，YAO H W，et al.Identification of Lonicera japonica and its related species using the DNA barcoding method[J].Planta medica，2011，77（3）：301-306.
[10] MURRAY M G，THOMPSON W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucleic acids research，1980，8（19）：4321-4325.
[11] WILLIAMS J G，KUBELIK A R，LIVAK K J，et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J].Nucleic acids research，1990，18（22）：6531-6535.
关键词 金银花；聚类分析；遗传多样性；RAPD；胶东地区
中图分类号 S567.7+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）13-0145-02
RADP Analysis of Genetic Relationships Among Cultivars of Lonicera japonica in Jiaodong Region
WANG Yi-fei1 ， LIU Lin-de1*， GE Yi-he1 et al
（1.College of Life Sciences，Ludong University，Yantai，Shandong 264100）
Abstract [Objective]Genetic relationships among cultivars of Lonicera japonica were studied.[Method]Genetic diversity and genetic relationship of 31 varieties of L. japonica in Jiaodong Region were studied by using Random Amplified Polymorphic DNA （RAPD） molecular marker technology. [Result]5 primers were used to amplify 650 bands. Each primer could amplify 0-9 bands. The result of cluster analysis showed 31 kinds of L. japonica varieties could be divided into two categories， one was from Taibai Top of Kunyu mountain， the other was anther category. From the genetic distance， the variety from Taibai Top of Kunyu mountain and the Damao flower which was introduced by family of traditional Chinese Medicine had the farthest genetic distance， it was 2.507.The variety from the Malin Port of Longkou Langao town and the Sijifeng flower which was introduced by family of traditional Chinese Medicine had the nearest genetic distance， it was 0.020. [Conclusion]There was high genetic diversity among different cultivars of L. japonica，the genetic relationship among different cultivars of L. japonica had a certain correlation with geographical distribution.
Key words Lonicera japonica；Cluster analysis；Genetic diversity；RAPD；Jiaodong region
金银花（Lonicera japonica）为忍冬科忍冬属多年生半常绿藤本植物[1]。全世界忍冬属植物约200种，我国有98种[2]。金银花具有清热解毒、消炎退肿、保肝抗病毒、延缓衰老的功效，研究发现它还具有良好的抗癌、抗艾滋病的作用，属卫生部、国家药品监督管理局和国家工商局关于30个贵重药材的通知品种，被列为出口创汇的主要品种[2]。同时，由于金银花根系发达，耐旱、耐寒热、耐瘠薄、耐盐碱，因而又是水土保持和沙漠治理的良好树种[3]。
我国忍冬科植物在全国各省各地形区均有分布，尤以西南地区种类最多，可供药用的种类达47种，其中作为金银花药材原植物的有忍冬（Lonicera japonica Thunb.）、菰腺忍冬（Lonicera hypoglauca Miq.）、山银花（Lonicera hypoglauca）和毛花柱忍冬（Lonicera dasystyla Rehd.），以山东平邑和河南封丘为道地产区[4]。随着应用范围的扩大和需求量的增加，金银花野生资源逐渐减少，人工栽培已成为金银花药材的主要来源，山東、河南等省均有大面积的金银花栽培种植基地[5]。不同种金银花在株型、枝条、叶片形态及化学成分含量等方面均存在较大差异，种内遗传变异十分显著[5]。该研究利用RAPD分子标记技术对胶东地区31个金银花品种进行遗传多样性分析，旨在探讨不同金银花品种间的遗传关系，为该地区金银花品种间的关系提供分子系统学资料，为进一步选育金银花优良品种奠定理论基础[6]。 1 材料與方法
1.1 材料
供试的金银花材料为采自昆嵛山、牙山、招虎山等胶东不同地区的27个品种，以及烟台中医世家引进的美国金银花、四季丰、巨丰1号、大毛花4个优良的金银花品种（表1）。
1.2 仪器和试剂
所用仪器有PTC-200基因扩增仪、微型离心机、凝胶成像系统、电泳仪、水平电泳槽和超微量紫外分光光度计。
试验用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒、琼脂糖、引物、RNA酶、TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffer、Mg2+、dNTPs均购自上海生工生物工程股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 基因组DNA的提取。
采集31个金银花品种的幼嫩枝叶，称取100 mg在液氮中充分研磨成粉末，利用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒提取金银花基因组DNA，对提取的基因组DNA用超微量分光光度计检测其浓度及纯度，-20 ℃保存备用。
1.3.2 PCR反应。
利用设计的引物进行PCR扩增。反应体系总体积为25 μL，包括10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/L的 Mg2+ 1.5 μL，2.5 mmol/L 的dNTPs 2 μL，10 ng/μL引物1 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶1 μL，20 ng/μL的DNA模板1 μL，ddH2O 16 μL。
扩增程序为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性1 min，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，40个循环；72 ℃延伸10 min。扩增结束后将反应产物于4 ℃保存。
1.3.3 电泳。
取10 μL PCR产物，加3 μL Loading Buffer，电泳。电泳结束后，将凝胶置于凝胶成像系统上观察拍照。
1.4 数据分析
将电泳图谱上清晰出现的条带做出统计，由此生成原始矩阵。利用SPSS软件计算任意2个品种间的遗传距离，并利用该软件的聚类分析方法建立不同种源间的遗传关系树状图。
2 结果与分析
2.1 RAPD-PCR扩增结果
对供试的31个金银花品种进行PCR扩增，对所用5个引物的扩增结果进行统计分析（表1）。5个引物共扩增出650条带，不同引物扩增DNA片段数0～9条不等，分子量范围为100～3 000 bp。650条DNA扩增带中，585条带具有多态性，多态条带比率为90%，这表明供试的31个金银花品种间RAPD条带多态性高，遗传多样性丰富。
2.2 聚类分析结果
根据RAPD数据，利用SPSS软件对31个金银花品种间的遗传距离和相似系数进行计算，并进行聚类分析，建立聚类分支树状图[7]。由图1可知，供试材料可分为两类，样品1（采自昆嵛山太白顶）为一类，其余30个样品为一类。而在剩余的30个金银花品种中，样品2（采自昆嵛山林场）、3（采自乳山东夼钟家）、4（采自文登新村）、7（采自栖霞牙山）、8（采自牟平磨石格庄）、14（采自招远上院村）、16（采自海阳东村）、18（采自海阳招虎山东）、24（采自临朐沂山居委会）、31（大毛花）为一类，剩余的部分为另一类。
根据31个金银花品种间的遗传距离可以看出，品种1（采自昆嵛山太白顶）与品种31（大毛花）之间遗传距离最远，为2507；品种25[采自龙口兰高镇马蔺塂（Ⅱ）]与品种29（四季丰）遗传距离最近为0.020，这与聚类分析结果相符。品种1（采自昆嵛山太白顶）与品种31（大毛花）亲缘关系最远，品种25[采自龙口兰高镇马蔺塂（Ⅱ）]与品种29（四季丰）亲缘关系最近。
3 讨论与结论
RAPD分子标记被广泛应用于作物品种或种子纯度鉴定，具有简便快速等优点，但也存在条带稳定性差、饰演重复性低等问题[5，8]。为了保证试验的准确性和可重复性，严格控制反应条件的一致性，每个引物多次重复，统计稳定出现、重复性高的条带并进行遗传分析，放弃重复性低的模糊条带[5，9]。在此基础上所获得的数据是可靠的，试验结果能真实反映胶东地区31个金银花品种的遗传特征。
从供试材料的聚类分析结果可以看出，样品1（采自昆嵛山太白顶）聚为一类，其余30个金银花品种聚为一类。聚类结果与形态学分类相符。此外，31个金银花品种遗传多样性丰富，表现出了不同的遗传特征，品种间遗传差异较大。而遗传多样性反映了物种的遗传背景、育种潜力和利用价值[10]。通过对扩增条带的分析，可以清楚地对供试31个金银花品种进行分类，说明运用RAPD技术对金银花进行分子水平的鉴定是可行的[11]，可以为供试31个金银花品种的进一步开发利用提供详细的分子生物学依据。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：化学工业出版社，2000：177.
[2] 中国科学院植物志编辑委员会.中国植物志：第72卷[M].北京：科学出版社，1988：236-238.
[3] 李金璐，王硕，于婧，等.一种改良的植物DNA提取方法[J].植物学报，2013，48（1）：72-78.
[4] 周凤琴，张永清，张芳，等.山东金银花种质资源的调查研究[J].山东中医杂志，2006，25（4）：268-271.
[5] 杨飞，张敏，彭兴扬，等.金银花五个品系的RAPD分析及DNA指纹图谱的建立[J].武汉植物学研究，2007，25（3）：235-238.
[6] 向增旭，郭巧生.不同金银花种源间遗传关系的RAPD分析[J].植物资源与环境学报，2007，16（2）：57-59.
[7] 谭贤杰，吴子恺，程伟东，等.关联分析及其在植物遗传学研究中的应用[J].植物学报，2011，46（1）：108-118.
[8] LI Y，DING W L.RAPD profiling in detecting genetic diversity in partial Trollius accessions of China[J].Biochemical genetics，2010，48：34-43.
[9] SUN Z Y，GAO T，YAO H W，et al.Identification of Lonicera japonica and its related species using the DNA barcoding method[J].Planta medica，2011，77（3）：301-306.
[10] MURRAY M G，THOMPSON W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucleic acids research，1980，8（19）：4321-4325.
[11] WILLIAMS J G，KUBELIK A R，LIVAK K J，et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J].Nucleic acids research，1990，18（22）：6531-6535.