【摘 要】
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本研究旨在构建绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)的囊膜基因(env)原核表达载体,制备多克隆抗体并对其特异性进行鉴定.以笔者所在实验室构建的pEGFP-C1/JSRV-env质粒为模板,PCR扩增env基因全长1 848 bp,构建原核表达质粒并命名为pET-32a/JSRV-env,进行双酶切鉴定和测序分析后,转化到E.coli Transetta(DE3),经IPTG诱导及亲和层析法对其纯化.将纯化蛋白常规免疫成年新西兰大白兔制备多克隆抗体,通过Western-blot方法鉴定多克隆抗体的特异性,免疫组化方法
【机 构】
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内蒙古农业大学兽医学院,内蒙古呼和浩特 010018;农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室,内蒙古呼和浩特 010018;内蒙古自治区基础兽医学重点实验室,内蒙古呼和浩特 010018
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本研究旨在构建绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)的囊膜基因(env)原核表达载体,制备多克隆抗体并对其特异性进行鉴定.以笔者所在实验室构建的pEGFP-C1/JSRV-env质粒为模板,PCR扩增env基因全长1 848 bp,构建原核表达质粒并命名为pET-32a/JSRV-env,进行双酶切鉴定和测序分析后,转化到E.coli Transetta(DE3),经IPTG诱导及亲和层析法对其纯化.将纯化蛋白常规免疫成年新西兰大白兔制备多克隆抗体,通过Western-blot方法鉴定多克隆抗体的特异性,免疫组化方法评价其临床检测效果.双酶切鉴定及测序结果表明,已成功构建pET-32a/JSRV-env重组质粒且包含编码YXXM基序的基因序列,成功表达及纯化该蛋白,其大小约89ku.以制备的多克隆抗体为一抗,经Western-blot检测自然感染绵羊肺腺瘤病(OPA)的病肺组织,在89 ku处出现单一特异性条带.免疫组化结果显示,OPA病肺肿瘤细胞可见棕黄色的阳性信号.结果表明,成功构建JSRV-env原核表达质粒,制备的多克隆抗体特异性较好,可用于生产实践中OPA的检测,且制备简便、成本低廉.同时也为进一步探讨JSRV Env的功能提供了实验基础.
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