论文部分内容阅读
摘要：甜菜碱是高等植物体内一种重要的渗透调节物，甜菜碱醛脱氢酶（Betaine aldehyde dehydrogenase， BADH）是甜菜碱合成的关键酶之一，本文基于Solexa技术对平榛花芽转录组测序结果的分析采用RACE-PCR技术克隆到一个平榛BADH基因，命名为ChBADH（HQ700873）。ChBADH cDNA 全长1 691 bp，具有一个1 512 bp的潜在编码区，编码503个氨基酸，预测其蛋白质相对分子量547 ku，理论等电点为544。ChBADH具有BADH家族保守的VSLELGGKSP功能活性位点和特征多肽序列，序列比较和生物信息学分析结果显示ChBADH在保守结构域和其他植物来源的BADH享有高度的一致性。以ACTIN为内参，对ChBADH基因在四个时期平榛的表达模式进行了初步的研究，荧光定量结果表明，ChBADH在寒冬时期被强烈的诱导表达，是非冷适应时期的35倍，推测该基因可能与榛子花芽越冬有紧密关系。
关键词：平榛；甜菜碱醛脱氢酶；qRT-PCR；寒冬
中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）05-0006-07
低温是影响植物分布，进而影响生长和产量的关键因素之一。 1970年Weiser指出低温会使植物的基因表达发生变化[1]，早在20世纪90年代研究者就发现植物存在冷适应现象[2]。迄今为止，植物抗寒的分子机制还没完全搞清楚，但研究者总结出了两条冷调节的途径：依赖ABA和非依赖ABA低温响应方式。通过分子生物学手段培育抗寒种质材料已经成为当代植物遗传改良的研究热点。
多年生木本植物越冬一般经过三个过程：冷适应（秋天）、耐冷时期（冬天）、脱除冷锻炼（春天），植物经过一定时间的非冻低温（2～6℃）驯化后具有较强的抗寒性[3]，该过程称为冷适应或者抗寒锻炼。植物在胁迫条件下体内会生成大量的渗透调节剂，起调节胞内渗透压、保护胞内酶活性的作用。甜菜碱是目前研究最深入的一种渗透调节物，它的结构、合成途径相对简单，遗传操作方便[4]。植物体内胆碱通过两步不可逆的氧化反应生成甜菜碱，甜菜碱醛脱氢酶（Betaine aldehyde dehydrogenase， BADH）是高等植物体内合成甜菜碱的关键酶[5]。自Weretilnyk等[6]首先从菠菜中克隆得到BADH基因，先后被转入烟草[7]、水稻[8]、小麦[9]、番茄[10]、胡萝卜[11]等植物中，并增强了这些植物的耐盐性。张宁等（2009）[12]将BADH基因转入马铃薯提高了植株的抗旱耐盐性。至今，人们已相继在辽宁碱蓬、大麦[13]、油菜[14]、结缕草[5]等多种植物中分离鉴定了这一基因，并得到了纯化蛋白[4]。虽然一些木本植物的BADH序列在NCBI已经注册登录，但只在麻疯树[15]和红树林等少数木本植物中有BADH基因的表达特性分析的报道。
平榛（Corylus heterophylla Fisch）为榛科（Betulaceae）榛属（Corylus）植物，是世界四大坚果（榛子、核桃、扁桃、腰果）之一，具有极高的营养价值和经济价值，在我国野生分布广泛。它的主要特性是抗寒性强，可抗冬季-48℃的极端低温，是我国重要的优良抗寒果树种质资源。世界上广泛栽培的欧洲榛（Corylus avellana L）和我国发展的平欧杂种榛（Corylus heterophylla Fisch×Corylus avellana L）的抗寒能力远不如平榛，早春和晚秋的霜冻会冻伤或者冻死花芽。本研究从平榛花芽转录组文库中检索到和BADH基因高度同源的Unigene，并采用RACE-PCR技术克隆得到平榛的BADH基因全长，对该基因越冬过程中的表达特性进行分析，旨在为进一步研究平榛BADH基因的功能、探讨平榛抗寒性的的分子机制提供理论依据和基础数据，并为今后进行遗传改良培育抗寒榛子新品种提供可操作基因。
1材料与方法
11试验材料
平榛材料采于山东省果树研究所岱东苗圃，取一个克隆母株上萌发的基因型一致的根蘖苗。参照Naik等（2007）[16]方法（稍作修改），分别于2011年9月29日（处于非冷适应时期，NC， non-cold acclimation，日均温7℃以上）、2011年11月2日（处于冷适应时期，CA， cold acclimation，日均温7℃以下）、2011年12月29日（处于寒冬时期，MW， mid-winter，日均温0℃以下）、2012年4月24日（处于脱除冷适应时期，DA，deacclimation， 日均温回升至7℃以上）四个不同时间点摘取花芽，取材后立即投入液氮冻干，存于-80℃冰箱，用于研究自然条件下BADH基因的季节表达模式。
12试验方法
121BADH基因的克隆与序列分析平榛研究样品材料的总RNA提取采用CTAB法[17]，并用DNaseⅠ（TaKaRa）处理以去除基因组DNA的污染。应用Clontech公司的SMARTTM RACE试剂盒反转录得到第一链用于基因RACE扩增，从平榛花芽转录组文库中筛选得到一条类似BADH基因的序列，Unigene编号为42806，设计扩增3′方向的引物BADH-3R和5′方向的引物BADH-5R（表1），按照Race试剂盒SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit说明书进行cDNA末端快速扩增。扩增方法采用Touch down PCR程序，凝胶回收与预期片段大小一致的泳带，连接克隆载体并转化感受态细胞，通过蓝白斑筛选及质粒酶切鉴定阳性克隆后，在北京诺赛生物公司进行序列测定。为获得BADH基因全长，根据由Unigene序列和两段末端序列拼接而得到的cDNA全长序列，设计引物BADH-F和BADH-R（表1）进行PCR扩增全长序列，PCR产物克隆到PMD19-T载体上，测序结果在GenBank中进行Blast分析。利用在线软件ProtParam（http：//www.expasy.org）预测所编码蛋白的分子量、理论等电点及保守结构域等。采用 DNAMAN软件进行多序列比对及系统进化分析。 122相对荧光定量PCR表达分析分别提取不同处理材料的总RNA，用DNase I酶（RNase free）消化基因组DNA后，各取05 μg为模板，反转录合成cDNA 第一链作为实时荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，qRT-PCR）的模板。根据ChBADH cDNA全长序列，按照荧光定量PCR引物设计原则在BADH的3′非翻译区附近设计一对特异引物BADH QR-F和BADH QR-R（表1），获得的扩增片段为178 bp。以平榛Actin基因 （GenBank accession number HQ677569）为稳定内参，设计其特异引物Actin-F和Actin-R（表1），获得的扩增片段为101 bp，进行相对荧光定量分析。
反应在ABI 7500实时定量PCR仪上进行，方法参照文献[18]描述进行，每个试验设4次重复，利用ABI 7500 PCR仪Sequence Detection software软件（2-ΔΔCt法）和Origin 62软件进行数据分析。
2结果与分析
21平榛ChBADH cDNA全长的获得
通过分析采用Solexa 测序技术对寒冬时期平榛花芽转录本进行的高通量测序结果，发现 Unigene 42806与棉花BADH具有较高的同源性，设计末端扩增的特异引物，以平榛花芽的cDNA为模板，经RACE-PCR扩增和产物克隆、测序后，分别得到长度为702 bp的3′末端和648 bp的5′末端（图1，条带1和条带2）。5′RACE扩增片段、3′RACE扩增片段均与Unigene片段有一段完全重叠的区域，说明克隆到的是基因的5′端和3′端，最终拼接获得一条长度为1 691 bp的cDNA全长序列。Blast比对发现，该cDNA序列与BADH基因同源，命名为ChBADH，GenBank登录号为HQ700873。利用NCBI的ORF Finder进行分析发现，ChBADH包含一个长度为1 512 bp的开放读码框（ORF），5′非翻译区长48 bp，3′非翻译区长131 bp。其ORF编码一个含503个氨基酸的蛋白质，ProtParam预测蛋白的相对分子量为547 ku，理论等电点（pI）为544。基因的cDNA全长序列及编码的氨基酸序列如图2所示。
关键词：平榛；甜菜碱醛脱氢酶；qRT-PCR；寒冬
中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）05-0006-07
低温是影响植物分布，进而影响生长和产量的关键因素之一。 1970年Weiser指出低温会使植物的基因表达发生变化[1]，早在20世纪90年代研究者就发现植物存在冷适应现象[2]。迄今为止，植物抗寒的分子机制还没完全搞清楚，但研究者总结出了两条冷调节的途径：依赖ABA和非依赖ABA低温响应方式。通过分子生物学手段培育抗寒种质材料已经成为当代植物遗传改良的研究热点。
多年生木本植物越冬一般经过三个过程：冷适应（秋天）、耐冷时期（冬天）、脱除冷锻炼（春天），植物经过一定时间的非冻低温（2～6℃）驯化后具有较强的抗寒性[3]，该过程称为冷适应或者抗寒锻炼。植物在胁迫条件下体内会生成大量的渗透调节剂，起调节胞内渗透压、保护胞内酶活性的作用。甜菜碱是目前研究最深入的一种渗透调节物，它的结构、合成途径相对简单，遗传操作方便[4]。植物体内胆碱通过两步不可逆的氧化反应生成甜菜碱，甜菜碱醛脱氢酶（Betaine aldehyde dehydrogenase， BADH）是高等植物体内合成甜菜碱的关键酶[5]。自Weretilnyk等[6]首先从菠菜中克隆得到BADH基因，先后被转入烟草[7]、水稻[8]、小麦[9]、番茄[10]、胡萝卜[11]等植物中，并增强了这些植物的耐盐性。张宁等（2009）[12]将BADH基因转入马铃薯提高了植株的抗旱耐盐性。至今，人们已相继在辽宁碱蓬、大麦[13]、油菜[14]、结缕草[5]等多种植物中分离鉴定了这一基因，并得到了纯化蛋白[4]。虽然一些木本植物的BADH序列在NCBI已经注册登录，但只在麻疯树[15]和红树林等少数木本植物中有BADH基因的表达特性分析的报道。
平榛（Corylus heterophylla Fisch）为榛科（Betulaceae）榛属（Corylus）植物，是世界四大坚果（榛子、核桃、扁桃、腰果）之一，具有极高的营养价值和经济价值，在我国野生分布广泛。它的主要特性是抗寒性强，可抗冬季-48℃的极端低温，是我国重要的优良抗寒果树种质资源。世界上广泛栽培的欧洲榛（Corylus avellana L）和我国发展的平欧杂种榛（Corylus heterophylla Fisch×Corylus avellana L）的抗寒能力远不如平榛，早春和晚秋的霜冻会冻伤或者冻死花芽。本研究从平榛花芽转录组文库中检索到和BADH基因高度同源的Unigene，并采用RACE-PCR技术克隆得到平榛的BADH基因全长，对该基因越冬过程中的表达特性进行分析，旨在为进一步研究平榛BADH基因的功能、探讨平榛抗寒性的的分子机制提供理论依据和基础数据，并为今后进行遗传改良培育抗寒榛子新品种提供可操作基因。
1材料与方法
11试验材料
平榛材料采于山东省果树研究所岱东苗圃，取一个克隆母株上萌发的基因型一致的根蘖苗。参照Naik等（2007）[16]方法（稍作修改），分别于2011年9月29日（处于非冷适应时期，NC， non-cold acclimation，日均温7℃以上）、2011年11月2日（处于冷适应时期，CA， cold acclimation，日均温7℃以下）、2011年12月29日（处于寒冬时期，MW， mid-winter，日均温0℃以下）、2012年4月24日（处于脱除冷适应时期，DA，deacclimation， 日均温回升至7℃以上）四个不同时间点摘取花芽，取材后立即投入液氮冻干，存于-80℃冰箱，用于研究自然条件下BADH基因的季节表达模式。
12试验方法
121BADH基因的克隆与序列分析平榛研究样品材料的总RNA提取采用CTAB法[17]，并用DNaseⅠ（TaKaRa）处理以去除基因组DNA的污染。应用Clontech公司的SMARTTM RACE试剂盒反转录得到第一链用于基因RACE扩增，从平榛花芽转录组文库中筛选得到一条类似BADH基因的序列，Unigene编号为42806，设计扩增3′方向的引物BADH-3R和5′方向的引物BADH-5R（表1），按照Race试剂盒SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit说明书进行cDNA末端快速扩增。扩增方法采用Touch down PCR程序，凝胶回收与预期片段大小一致的泳带，连接克隆载体并转化感受态细胞，通过蓝白斑筛选及质粒酶切鉴定阳性克隆后，在北京诺赛生物公司进行序列测定。为获得BADH基因全长，根据由Unigene序列和两段末端序列拼接而得到的cDNA全长序列，设计引物BADH-F和BADH-R（表1）进行PCR扩增全长序列，PCR产物克隆到PMD19-T载体上，测序结果在GenBank中进行Blast分析。利用在线软件ProtParam（http：//www.expasy.org）预测所编码蛋白的分子量、理论等电点及保守结构域等。采用 DNAMAN软件进行多序列比对及系统进化分析。 122相对荧光定量PCR表达分析分别提取不同处理材料的总RNA，用DNase I酶（RNase free）消化基因组DNA后，各取05 μg为模板，反转录合成cDNA 第一链作为实时荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，qRT-PCR）的模板。根据ChBADH cDNA全长序列，按照荧光定量PCR引物设计原则在BADH的3′非翻译区附近设计一对特异引物BADH QR-F和BADH QR-R（表1），获得的扩增片段为178 bp。以平榛Actin基因 （GenBank accession number HQ677569）为稳定内参，设计其特异引物Actin-F和Actin-R（表1），获得的扩增片段为101 bp，进行相对荧光定量分析。
反应在ABI 7500实时定量PCR仪上进行，方法参照文献[18]描述进行，每个试验设4次重复，利用ABI 7500 PCR仪Sequence Detection software软件（2-ΔΔCt法）和Origin 62软件进行数据分析。
2结果与分析
21平榛ChBADH cDNA全长的获得
通过分析采用Solexa 测序技术对寒冬时期平榛花芽转录本进行的高通量测序结果，发现 Unigene 42806与棉花BADH具有较高的同源性，设计末端扩增的特异引物，以平榛花芽的cDNA为模板，经RACE-PCR扩增和产物克隆、测序后，分别得到长度为702 bp的3′末端和648 bp的5′末端（图1，条带1和条带2）。5′RACE扩增片段、3′RACE扩增片段均与Unigene片段有一段完全重叠的区域，说明克隆到的是基因的5′端和3′端，最终拼接获得一条长度为1 691 bp的cDNA全长序列。Blast比对发现，该cDNA序列与BADH基因同源，命名为ChBADH，GenBank登录号为HQ700873。利用NCBI的ORF Finder进行分析发现，ChBADH包含一个长度为1 512 bp的开放读码框（ORF），5′非翻译区长48 bp，3′非翻译区长131 bp。其ORF编码一个含503个氨基酸的蛋白质，ProtParam预测蛋白的相对分子量为547 ku，理论等电点（pI）为544。基因的cDNA全长序列及编码的氨基酸序列如图2所示。