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摘要 目的：运用分子对接技术筛选金银花抗新型冠状病毒（SARS-CoV-2）潜在活性成分，为发现抗SARS-CoV-2先导化合物以及揭示金银花抗新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的物质基础提供参考。方法：在文献总结并结合中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库检索的基础上，建立涵蓋金银花中382个化合物的化学成分库，以SARS-CoV-2 3CL水解酶（3CL Protease，Mpro）以及SARS-CoV-2与血管紧张素转换酶2（ACE2）复合物为分子对接靶标，利用Discovery Studio软件进行分子对接，以打分值大小筛选抗SARS-CoV-2潜在活性成分。结果：金银花中三萜皂苷类成分与SARS-CoV-2 Mpro有较强的结合力，以SARS-CoV-2 Mpro晶体结构复合的原抑制剂N3为阳性对照，7个化合物为其潜在抑制剂;环烯醚萜类和神经酰胺类成分对SARS-CoV-S/ACE2复合物的阻断较好，保留打分值前3%的化合物，10个化合物可作为SARS-CoV-S/ACE2复合物的潜在阻断剂。结论：从金银花中发现16个潜在抗SARS-CoV-2活性成分。本研究为阐明金银花抗击COVID-19的药效物质基础提供参考，同时为发现新的抗SARS-CoV-2先导化合物指明方向。
关键词 金银花;新型冠状病毒肺炎;分子对接;新型冠状病毒Mpro;SARS-CoV-S/ACE2复合物;三萜皂苷;环烯醚萜;神经酰胺
Screening of the Active Components from Flos Lonicerae against SARS-CoV-2 by Molecular Docking
SUN Yu1，2，GUO Zhongyuan2，CHEN Liangmian2，GUAN Liangjun2，FANG Yunge1，2，GAO Huimin2，WANG Zhimin2，3
（1 Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China; 2 National Engineering Laboratory for Quality Control Technology of Chinese Materia Medica， Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 3 School of Pharmacy，Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China）
Abstract Objective：To screening potential active constituents against SARS-CoV-2 from Lonicera japonica Flos（LJF） by molecular docking technology and provide reference for discovery of lead compounds against SARS-CoV-2 and interpretation of its active substances for the treatment of COVID-19.Methods：The database of 382 chemical constituents from LJF was established based on the literature summary，combining TCMSP database retrieval.SARS-CoV-2 Mpro and SARS-CoV-2/angiotensin-converting enzyme 2（ACE2） were employed as molecular docking targets.Discovery Studio software was used for virtual calculation and the potential active components against SARS-CoV-2 were picked out on the basis of the ranking of docking score.Results：Triterpenoid saponins in LJF had strong affinity with SARS-CoV-2 Mpro and 7 compounds were potential inhibitors，taking SARS-CoV-2 Mpro crystal structure complex inhibitor N3 as the positive control.Iridoids and ceramides had a good blocking effect on SARS-CoV-S/ACE2 complex and 10 compounds were potential blockers.Conclusion：A total of 16 Potential active compounds against SARS-CoV-2 were found from LJF.The present study provides reference for clarifying effective substances of LJF against COVID-19，and discovering lead compounds against SARS-CoV-2 from LJF. Keywords Flos Lonicerae; COVID-19; Molecular docking; SARS-CoV-2 Mpro; SARS-CoV-S/ACE2 complex; Triterpenoid saponin; Iridoid; Ceramide
中图分类号：R285;R254.3;R256.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.17.002
新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）疫情成为世界性突发公共卫生事件，并呈持续蔓延态势，多国出现了不同程度的新型冠状病毒（SARS Coronavirus 2，SARS-CoV-2）毒株变异情况，是当前亟待解决的重大医学难题。COVID-19属于中医“疫病”范畴[1]，中医药在疫病防治方面具有积极作用，比如近年来发生的严重急性呼吸综合征（Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS），甲型H1N1流感（Influenza A，H1N1）以及H7N9型禽流感（Avian Influenza，H7N9）等多次疫情，特别是在本次新冠疫情防治中，展现了令人振奋的临床效果。然而，仍有一些不和谐的声音质疑中医药的疗效，为此，现就COVID-19诊疗方案中的重要药味——金银花，采用分子对接的方法来揭示中医药抗击COVID-19的科学性。
金银花是清热解毒药的代表品种之一，为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或初开的花，具有清热解毒、凉散风热功效，主治痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热[2]。在国家及26个省市公布推荐用于防治COVID-19的中成药和临床调剂方中，金银花有着较高的使用频率，如痰热清注射液、热毒宁注射液、金花清感颗粒和连花清瘟胶囊等。自疫情发生以来，采用网络药理学和分子对接技术研究金银花复方及其中成药制剂抗COVID-19的研究有很多[3-6]，为快速发现和开发新的治疗方法和药物提供了有效信息。但是在多数研究中，组方药味（包括金银花）所含化学成分的搜集来源于中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）公共数据库，该数据库收载的金银花化学成分主要为以绿原酸为代表的酚酸类、黄酮类和挥发性成分，对于许多新发现的化合物，比如结构新颖的环烯醚萜类和三萜皂苷类成分，未及时更新和补录。为了充分认识金银花在COVID-19防治中的作用，阐明其发挥药效的物质基础，本研究在自建金银花化学成分库的基础上，选用文献研究相对成熟的SARS-CoV-2 Mpro和SARS-CoV-S/血管紧张素转换酶2（Angiotensin Converting Enzyme 2，ACE2）复合物为筛选靶标，从抑制病毒复制和阻断病毒与宿主细胞ACE2结合2个方面，进行金银花全成分的分子对接研究，以获得抗SARS-CoV-2的潜在活性成分，为揭示金银花发挥防治作用的科学内涵提供参考。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本研究使用数据库包括TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）和蛋白质结构数据库（Protein Data Bank，PDB，https：//www.rcsb.org）;分析软件包括绘制化合物结构的ChemBio Draw Ultra 2014和用于分子对接的Discovery Studio 2019（DS 2019）。
1.2 金银花化学成分库建立 金银花主要化学成分包括有机酸、黄酮、环烯醚萜、三萜皂苷及挥发油等，具有抑菌、抗病毒、抗炎、抗氧化等药理作用[7]。在本课题组长期研究金银花的基础上，结合最新文献报道，整理了金银花中各类别化学成分382个，涵盖TCMSP数据库中215个化合物，增补167个化合物。TCMSP数据库中下载化合物2D结构保存为*mol2格式，新增补的成分利用ChemBio Draw 2014軟件构建2D结构保存为*cdx格式，利用DS 2019软件转换为*dsv格式。见表1，图1。
1.3 靶点蛋白的选择 分子对接用的蛋白晶体结构通过PDB获得，SARS-CoV-2 Mpro晶体结构PDB编号为6LU7，分辨率为2.16 。见图2A。SARS-CoV-S/ACE2复合蛋白晶体结构PDB编号为2AJF，分辨率为2.90 。见图2B。
1.4 分子对接 通过DS 2019的Receptor-Ligand interactions模块定义晶体结构的活性口袋半径及坐标位置。SARS-CoV-2 Mpro由306个氨基酸组成，形成二聚体后产生水解酶活性，其145位的半胱氨酸（CYS）和41位的组氨酸（HIS）是形成催化二聚体的关键位点。根据靶标蛋白6LU7中复合物N3定义活性口袋，活性口袋半径为13.893 ，坐标位置为-10.786、12.536、68.919。见图3A。以SARS-CoV-S/ACE2作为靶标，靶标蛋白2AJF中A链的氨基酸ASP38、GLN42、GLN325和GLU329，E链的氨基酸TYR436和TYR491作为关键氨基酸，以关键氨基酸定义活性口袋，活性口袋半径为17.552 ，坐标位置为9.409、-7.134、70.739。见图3B。金银花化学成分加入立场以及立体化处理，采用DS 2019软件Libdock模块分别与6LU7和2AJF进行分子对接，选取BEST对接模式，每个配体保留最优的构象，其他参数默认设置。计算完毕后，将对接结果按照打分值排序，对于Mpro，以其晶体结构复合物抑制剂N3为阳性对照，保留打分值大于N3的化合物作为潜在抑制剂;对于SARS-CoV-S/ACE2复合物，保留打分值排序前3%的化合物，作为潜在的阻断剂。 2 结果
金银花中三萜皂苷类成分对SARS-CoV-2 Mpro具有较强的亲合力，环烯醚萜类和神经酰胺类成分对SARS-CoV-S/ACE2复合物的阻断较好，共筛选出16个潜在活性化合物。各类型的化合物参与对接和筛选出的潜在结合成分见图4。筛选出的化合物结构式见图5。
2.1 SARS-CoV-2 Mpro潜在抑制剂 金银花化学成分库中，382个化合物参与分子对接，与Mpro结合的有359个，以Mpro抑制剂N3为阳性对照，打分值高于N3的化学成分有7个，潜在活性成分与靶点对接作用情况见表2。三萜皂苷类成分1、2和黄酮类成分4对Mpro结合能力强，打分值最高。化合物1糖链上的羟基与MET165、THR190、GLN192、TYR54、ARG188形成H键，与ALA191、PRO168残基形成烷基-π键，附近也存在一些较弱的C、H键，如GLN189、GLU166。MET165不仅作为H键提供质子，还与配体产生硫-X（Sulfur-X）作用。SER144与皂苷母核上的基团形成H键作用，CYS145、HIS163与配体产生烷基-π键作用。在打分值高的化合物中，能与关键氨基酸CYS145或HIS41形成H键的有4个，提示这4个化合物可能有抑制Mpro二聚体形成的作用，其中化合物4为含有咖啡酰基的黄酮双糖苷，具有较强的抗炎活性[8]，HIS41不仅可以与黄酮糖苷上的羟基形成H键，还可与咖啡酰基上的苯环发生T形π-π键作用，这可能是化合物4与Mpro结合力强的原因。化合物9是含有2个糖的苯并呋喃木脂素，CYS145不仅可以和糖上的酚羟基形成H键，和苯环形成硫-π键，还可与呋喃环形成烷基-π键，多键相互作用可能是化合物9成为潜在Mpro抑制剂的原因。N3和代表性成分与Mpro的相互作用见图6。
2.2 潜在SARS-CoV-S/ACE2复合物结合阻断剂 金银花化学成分库中382个化合物参与分子对接，与SARS-CoV-S/ACE2复合物结合的有331个，保留打分值排序前3%的10个成分作为潜在活性成分，潜在活性成分与靶点对接作用见表3。
保留打分值排序前3%的化合物，环烯醚萜类和神经酰胺类化合物与SARS-CoV-S/ACE2复合物有较好亲和力，化合物5和7（神经酰胺类）以及化合物11（环烯醚萜类）的打分值最高。作为潜在的SARS-CoV-S/ACE2复合物阻断剂，化合物11与SER44、ASN394、HIS401发生H键作用，与HIS401残基产生烷基-π键作用，PHE390、热点残基GLU37的正电荷、ARG393的阴离子对配体也存在影响;化合物11还可与ASP350形成电荷吸引力，与ARG393形成盐桥作用。化合物7、10和14均能与热点残基HIS34产生烷基-π键作用，而化合物14不仅能与热点残基GLU37产生电荷吸引力，还可与关键氨基酸TYR491发生H键作用。ACE2中LYS353残基在与病毒S蛋白结合过程中起非常关键的作用，是核心位点[9]，既可以与化合物8形成烷基-π键，还能与化合物16形成H键。代表性活性成分与SARS-CoV-S/ACE2蛋白质的相互作用见图7。
3 讨论
现代研究表明金银花具有多种抗病毒作用，其单味药材的口服液能较好改善COVID-19普通型患者的肺部功能，并能显著缩短住院天数及病毒核酸转阴时长，具有广阔的COVID-19治疗前景[10]。鉴于中药多成分、多靶点的作用特点，以及开展SARS-CoV-2活性成分筛选工作的难度和时效性，分子对接技术已成为揭示中医药抗击COVID-19作用科学性的重要手段，并可快速挖掘具有潜在抗SARS-CoV-2的类药小分子。SARS-CoV-2 Mpro和ACE2是当前抗SARS-CoV-2药物筛选的关键靶标，因此，本研究在自建金银花化学成分库的基础上，采用分子对接技术，从抑制Mpro和阻断S-蛋白和宿主ACE2结合2个环节，筛选出金银花中16个潜在抗SARS-CoV-2的活性化合物，其中Mpro潜在抑制剂7个，主要为三萜皂苷类;潜在SARS-CoV-S/ACE2复合物结合阻断剂10个，多为环烯醚萜和神经酰胺类成分，其中神经酰胺类成分Lonijaposide A1（5）既能够抑制Mpro，又可阻断S-蛋白和宿主ACE2结合。金银花中三萜皂苷类成分抗病毒作用鲜有研究，后续可针对该类成分开展药理活性验证，以发现新的先导化合物。
以SARS-CoV-2 Mpro为靶标，通过结合模式分析，活性成分与N3发生作用的关键氨基酸重合，预测的活性成分与N3有相似的生物活性，形成相互作用主要是CYS145、HIS41和GLU166残基等。从化合物类别来看，主要是三萜皂苷类与靶点的亲和力相对较强，特别是其中糖上羟基容易和Mpro的氨基酸杂原子形成H键。此外，皂苷与蛋白质能以H键、疏水相互作用、范德华力等方式进行结合，从而更好地发挥生物活性[11]，这可能是三萜皂苷类成分与Mpro结合力相对较强的原因。以SARS-CoV-S/ACE2復合物为靶标，筛选出的潜在阻断剂主要是环烯醚萜类和神经酰胺类成分。通过结合模式分析，潜在活性成分多与SARS-CoV-S/ACE2复合物蛋白的热点残基发生作用。环烯醚萜类Lonijaposide W（11）和Lonijaposide R（12）与ARG393残基间盐桥作用，从而阻断SARS-CoV-S/ACE2复合物，这与之前研究认为冠状病毒S-蛋白与宿主细胞受体的特异性识别和结合主要通过氨基酸分子间电性、极性差异形成的盐桥结果一致[12-13]。神经酰胺类化合物Lonijaposide A3-A4（7-8）、Lonijaposide A1（5）与SARS-CoV-S/ACE2复合物靶点蛋白亲和力较好，而化合物5既是潜在的Mpro抑制剂，又是SARS-CoV-S/ACE2复合物阻断剂。
除了上述靶点，文献报道金银花三萜皂苷和环烯醚萜部位具有抑菌作用，尤其是对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌敏感[14-15]，可以辅助治疗COVID-19患者后期感染问题。在临床上，有大量COVID-19患者会出现呼吸系统症状外的肝受损现象[16]，金银花总皂苷能降低血清中丙二醛含量和天冬氨酸转氨酶活力，提高超氧化物歧化酶活力从而起到保肝作用[17]。此外，需要说明的是，COVID-19危重型患者病情加重与“细胞因子风暴”密切相关，多项研究从炎症-氧化应激-细胞因子风暴角度阐明了中医药治疗COVID-19与抗炎、抗氧化作用有关[18]。金银花可能通过酚酸或黄酮类成分发挥抗炎、免疫调节、抗氧化等其他药理作用，实现多成分、多途径、多靶点防治COVID-19的作用，比如金银花醇提物可显著抑制NO释放，降低IL-1β、TNF-α、IL-6等炎症介质的释放[19];有机酸类成分绿原酸、隐绿原酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸等对LPS刺激的巨噬细胞炎症介质均具有不同程度的抑制作用[20];黄酮类成分如金丝桃苷、忍冬苷和木犀草素可通过抑制核因子κB信号通路显著发挥抗氧化和抗炎作用[21];金银花汤剂中MIR-2911可通过饮用被人体有效吸收，并在体内有效抑制SARS-CoV-2复制，加速COVID-19患者康复[22]。 参考文献
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（2021-01-26收稿 責任编辑：王明）
关键词 金银花;新型冠状病毒肺炎;分子对接;新型冠状病毒Mpro;SARS-CoV-S/ACE2复合物;三萜皂苷;环烯醚萜;神经酰胺
Screening of the Active Components from Flos Lonicerae against SARS-CoV-2 by Molecular Docking
SUN Yu1，2，GUO Zhongyuan2，CHEN Liangmian2，GUAN Liangjun2，FANG Yunge1，2，GAO Huimin2，WANG Zhimin2，3
（1 Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China; 2 National Engineering Laboratory for Quality Control Technology of Chinese Materia Medica， Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 3 School of Pharmacy，Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China）
Abstract Objective：To screening potential active constituents against SARS-CoV-2 from Lonicera japonica Flos（LJF） by molecular docking technology and provide reference for discovery of lead compounds against SARS-CoV-2 and interpretation of its active substances for the treatment of COVID-19.Methods：The database of 382 chemical constituents from LJF was established based on the literature summary，combining TCMSP database retrieval.SARS-CoV-2 Mpro and SARS-CoV-2/angiotensin-converting enzyme 2（ACE2） were employed as molecular docking targets.Discovery Studio software was used for virtual calculation and the potential active components against SARS-CoV-2 were picked out on the basis of the ranking of docking score.Results：Triterpenoid saponins in LJF had strong affinity with SARS-CoV-2 Mpro and 7 compounds were potential inhibitors，taking SARS-CoV-2 Mpro crystal structure complex inhibitor N3 as the positive control.Iridoids and ceramides had a good blocking effect on SARS-CoV-S/ACE2 complex and 10 compounds were potential blockers.Conclusion：A total of 16 Potential active compounds against SARS-CoV-2 were found from LJF.The present study provides reference for clarifying effective substances of LJF against COVID-19，and discovering lead compounds against SARS-CoV-2 from LJF. Keywords Flos Lonicerae; COVID-19; Molecular docking; SARS-CoV-2 Mpro; SARS-CoV-S/ACE2 complex; Triterpenoid saponin; Iridoid; Ceramide
中图分类号：R285;R254.3;R256.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.17.002
新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）疫情成为世界性突发公共卫生事件，并呈持续蔓延态势，多国出现了不同程度的新型冠状病毒（SARS Coronavirus 2，SARS-CoV-2）毒株变异情况，是当前亟待解决的重大医学难题。COVID-19属于中医“疫病”范畴[1]，中医药在疫病防治方面具有积极作用，比如近年来发生的严重急性呼吸综合征（Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS），甲型H1N1流感（Influenza A，H1N1）以及H7N9型禽流感（Avian Influenza，H7N9）等多次疫情，特别是在本次新冠疫情防治中，展现了令人振奋的临床效果。然而，仍有一些不和谐的声音质疑中医药的疗效，为此，现就COVID-19诊疗方案中的重要药味——金银花，采用分子对接的方法来揭示中医药抗击COVID-19的科学性。
金银花是清热解毒药的代表品种之一，为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或初开的花，具有清热解毒、凉散风热功效，主治痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热[2]。在国家及26个省市公布推荐用于防治COVID-19的中成药和临床调剂方中，金银花有着较高的使用频率，如痰热清注射液、热毒宁注射液、金花清感颗粒和连花清瘟胶囊等。自疫情发生以来，采用网络药理学和分子对接技术研究金银花复方及其中成药制剂抗COVID-19的研究有很多[3-6]，为快速发现和开发新的治疗方法和药物提供了有效信息。但是在多数研究中，组方药味（包括金银花）所含化学成分的搜集来源于中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）公共数据库，该数据库收载的金银花化学成分主要为以绿原酸为代表的酚酸类、黄酮类和挥发性成分，对于许多新发现的化合物，比如结构新颖的环烯醚萜类和三萜皂苷类成分，未及时更新和补录。为了充分认识金银花在COVID-19防治中的作用，阐明其发挥药效的物质基础，本研究在自建金银花化学成分库的基础上，选用文献研究相对成熟的SARS-CoV-2 Mpro和SARS-CoV-S/血管紧张素转换酶2（Angiotensin Converting Enzyme 2，ACE2）复合物为筛选靶标，从抑制病毒复制和阻断病毒与宿主细胞ACE2结合2个方面，进行金银花全成分的分子对接研究，以获得抗SARS-CoV-2的潜在活性成分，为揭示金银花发挥防治作用的科学内涵提供参考。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本研究使用数据库包括TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）和蛋白质结构数据库（Protein Data Bank，PDB，https：//www.rcsb.org）;分析软件包括绘制化合物结构的ChemBio Draw Ultra 2014和用于分子对接的Discovery Studio 2019（DS 2019）。
1.2 金银花化学成分库建立 金银花主要化学成分包括有机酸、黄酮、环烯醚萜、三萜皂苷及挥发油等，具有抑菌、抗病毒、抗炎、抗氧化等药理作用[7]。在本课题组长期研究金银花的基础上，结合最新文献报道，整理了金银花中各类别化学成分382个，涵盖TCMSP数据库中215个化合物，增补167个化合物。TCMSP数据库中下载化合物2D结构保存为*mol2格式，新增补的成分利用ChemBio Draw 2014軟件构建2D结构保存为*cdx格式，利用DS 2019软件转换为*dsv格式。见表1，图1。
1.3 靶点蛋白的选择 分子对接用的蛋白晶体结构通过PDB获得，SARS-CoV-2 Mpro晶体结构PDB编号为6LU7，分辨率为2.16 。见图2A。SARS-CoV-S/ACE2复合蛋白晶体结构PDB编号为2AJF，分辨率为2.90 。见图2B。
1.4 分子对接 通过DS 2019的Receptor-Ligand interactions模块定义晶体结构的活性口袋半径及坐标位置。SARS-CoV-2 Mpro由306个氨基酸组成，形成二聚体后产生水解酶活性，其145位的半胱氨酸（CYS）和41位的组氨酸（HIS）是形成催化二聚体的关键位点。根据靶标蛋白6LU7中复合物N3定义活性口袋，活性口袋半径为13.893 ，坐标位置为-10.786、12.536、68.919。见图3A。以SARS-CoV-S/ACE2作为靶标，靶标蛋白2AJF中A链的氨基酸ASP38、GLN42、GLN325和GLU329，E链的氨基酸TYR436和TYR491作为关键氨基酸，以关键氨基酸定义活性口袋，活性口袋半径为17.552 ，坐标位置为9.409、-7.134、70.739。见图3B。金银花化学成分加入立场以及立体化处理，采用DS 2019软件Libdock模块分别与6LU7和2AJF进行分子对接，选取BEST对接模式，每个配体保留最优的构象，其他参数默认设置。计算完毕后，将对接结果按照打分值排序，对于Mpro，以其晶体结构复合物抑制剂N3为阳性对照，保留打分值大于N3的化合物作为潜在抑制剂;对于SARS-CoV-S/ACE2复合物，保留打分值排序前3%的化合物，作为潜在的阻断剂。 2 结果
金银花中三萜皂苷类成分对SARS-CoV-2 Mpro具有较强的亲合力，环烯醚萜类和神经酰胺类成分对SARS-CoV-S/ACE2复合物的阻断较好，共筛选出16个潜在活性化合物。各类型的化合物参与对接和筛选出的潜在结合成分见图4。筛选出的化合物结构式见图5。
2.1 SARS-CoV-2 Mpro潜在抑制剂 金银花化学成分库中，382个化合物参与分子对接，与Mpro结合的有359个，以Mpro抑制剂N3为阳性对照，打分值高于N3的化学成分有7个，潜在活性成分与靶点对接作用情况见表2。三萜皂苷类成分1、2和黄酮类成分4对Mpro结合能力强，打分值最高。化合物1糖链上的羟基与MET165、THR190、GLN192、TYR54、ARG188形成H键，与ALA191、PRO168残基形成烷基-π键，附近也存在一些较弱的C、H键，如GLN189、GLU166。MET165不仅作为H键提供质子，还与配体产生硫-X（Sulfur-X）作用。SER144与皂苷母核上的基团形成H键作用，CYS145、HIS163与配体产生烷基-π键作用。在打分值高的化合物中，能与关键氨基酸CYS145或HIS41形成H键的有4个，提示这4个化合物可能有抑制Mpro二聚体形成的作用，其中化合物4为含有咖啡酰基的黄酮双糖苷，具有较强的抗炎活性[8]，HIS41不仅可以与黄酮糖苷上的羟基形成H键，还可与咖啡酰基上的苯环发生T形π-π键作用，这可能是化合物4与Mpro结合力强的原因。化合物9是含有2个糖的苯并呋喃木脂素，CYS145不仅可以和糖上的酚羟基形成H键，和苯环形成硫-π键，还可与呋喃环形成烷基-π键，多键相互作用可能是化合物9成为潜在Mpro抑制剂的原因。N3和代表性成分与Mpro的相互作用见图6。
2.2 潜在SARS-CoV-S/ACE2复合物结合阻断剂 金银花化学成分库中382个化合物参与分子对接，与SARS-CoV-S/ACE2复合物结合的有331个，保留打分值排序前3%的10个成分作为潜在活性成分，潜在活性成分与靶点对接作用见表3。
保留打分值排序前3%的化合物，环烯醚萜类和神经酰胺类化合物与SARS-CoV-S/ACE2复合物有较好亲和力，化合物5和7（神经酰胺类）以及化合物11（环烯醚萜类）的打分值最高。作为潜在的SARS-CoV-S/ACE2复合物阻断剂，化合物11与SER44、ASN394、HIS401发生H键作用，与HIS401残基产生烷基-π键作用，PHE390、热点残基GLU37的正电荷、ARG393的阴离子对配体也存在影响;化合物11还可与ASP350形成电荷吸引力，与ARG393形成盐桥作用。化合物7、10和14均能与热点残基HIS34产生烷基-π键作用，而化合物14不仅能与热点残基GLU37产生电荷吸引力，还可与关键氨基酸TYR491发生H键作用。ACE2中LYS353残基在与病毒S蛋白结合过程中起非常关键的作用，是核心位点[9]，既可以与化合物8形成烷基-π键，还能与化合物16形成H键。代表性活性成分与SARS-CoV-S/ACE2蛋白质的相互作用见图7。
3 讨论
现代研究表明金银花具有多种抗病毒作用，其单味药材的口服液能较好改善COVID-19普通型患者的肺部功能，并能显著缩短住院天数及病毒核酸转阴时长，具有广阔的COVID-19治疗前景[10]。鉴于中药多成分、多靶点的作用特点，以及开展SARS-CoV-2活性成分筛选工作的难度和时效性，分子对接技术已成为揭示中医药抗击COVID-19作用科学性的重要手段，并可快速挖掘具有潜在抗SARS-CoV-2的类药小分子。SARS-CoV-2 Mpro和ACE2是当前抗SARS-CoV-2药物筛选的关键靶标，因此，本研究在自建金银花化学成分库的基础上，采用分子对接技术，从抑制Mpro和阻断S-蛋白和宿主ACE2结合2个环节，筛选出金银花中16个潜在抗SARS-CoV-2的活性化合物，其中Mpro潜在抑制剂7个，主要为三萜皂苷类;潜在SARS-CoV-S/ACE2复合物结合阻断剂10个，多为环烯醚萜和神经酰胺类成分，其中神经酰胺类成分Lonijaposide A1（5）既能够抑制Mpro，又可阻断S-蛋白和宿主ACE2结合。金银花中三萜皂苷类成分抗病毒作用鲜有研究，后续可针对该类成分开展药理活性验证，以发现新的先导化合物。
以SARS-CoV-2 Mpro为靶标，通过结合模式分析，活性成分与N3发生作用的关键氨基酸重合，预测的活性成分与N3有相似的生物活性，形成相互作用主要是CYS145、HIS41和GLU166残基等。从化合物类别来看，主要是三萜皂苷类与靶点的亲和力相对较强，特别是其中糖上羟基容易和Mpro的氨基酸杂原子形成H键。此外，皂苷与蛋白质能以H键、疏水相互作用、范德华力等方式进行结合，从而更好地发挥生物活性[11]，这可能是三萜皂苷类成分与Mpro结合力相对较强的原因。以SARS-CoV-S/ACE2復合物为靶标，筛选出的潜在阻断剂主要是环烯醚萜类和神经酰胺类成分。通过结合模式分析，潜在活性成分多与SARS-CoV-S/ACE2复合物蛋白的热点残基发生作用。环烯醚萜类Lonijaposide W（11）和Lonijaposide R（12）与ARG393残基间盐桥作用，从而阻断SARS-CoV-S/ACE2复合物，这与之前研究认为冠状病毒S-蛋白与宿主细胞受体的特异性识别和结合主要通过氨基酸分子间电性、极性差异形成的盐桥结果一致[12-13]。神经酰胺类化合物Lonijaposide A3-A4（7-8）、Lonijaposide A1（5）与SARS-CoV-S/ACE2复合物靶点蛋白亲和力较好，而化合物5既是潜在的Mpro抑制剂，又是SARS-CoV-S/ACE2复合物阻断剂。
除了上述靶点，文献报道金银花三萜皂苷和环烯醚萜部位具有抑菌作用，尤其是对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌敏感[14-15]，可以辅助治疗COVID-19患者后期感染问题。在临床上，有大量COVID-19患者会出现呼吸系统症状外的肝受损现象[16]，金银花总皂苷能降低血清中丙二醛含量和天冬氨酸转氨酶活力，提高超氧化物歧化酶活力从而起到保肝作用[17]。此外，需要说明的是，COVID-19危重型患者病情加重与“细胞因子风暴”密切相关，多项研究从炎症-氧化应激-细胞因子风暴角度阐明了中医药治疗COVID-19与抗炎、抗氧化作用有关[18]。金银花可能通过酚酸或黄酮类成分发挥抗炎、免疫调节、抗氧化等其他药理作用，实现多成分、多途径、多靶点防治COVID-19的作用，比如金银花醇提物可显著抑制NO释放，降低IL-1β、TNF-α、IL-6等炎症介质的释放[19];有机酸类成分绿原酸、隐绿原酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸等对LPS刺激的巨噬细胞炎症介质均具有不同程度的抑制作用[20];黄酮类成分如金丝桃苷、忍冬苷和木犀草素可通过抑制核因子κB信号通路显著发挥抗氧化和抗炎作用[21];金银花汤剂中MIR-2911可通过饮用被人体有效吸收，并在体内有效抑制SARS-CoV-2复制，加速COVID-19患者康复[22]。 参考文献
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（2021-01-26收稿 責任编辑：王明）