【摘 要】
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革兰阴性菌脂多糖转运蛋白(Lipopolysaccharide transport,Lpt) LptA和LptC通过稳定的相互作用对脂多糖装配起到重要作用,它们相互作用的阻断会导致脂多糖层缺损和菌体死亡,因此具备成为抗菌药物筛选靶标的可行性.文中应用生物膜干涉(Biolayer interferometry,BLI)技术对LptA/LptC相互作用进行检测,为建立体外的LptA/LptC蛋白相互作用阻断剂筛选方法奠定基础.首先在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行大肠杆菌Lp
【机 构】
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华北理工大学基础医学院河北省慢性疾病基础医学重点实验室唐山市慢性病临床基础研究重点实验室,河北唐山 063210;中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所国家新药(微生物)筛选实验室,北京 10
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革兰阴性菌脂多糖转运蛋白(Lipopolysaccharide transport,Lpt) LptA和LptC通过稳定的相互作用对脂多糖装配起到重要作用,它们相互作用的阻断会导致脂多糖层缺损和菌体死亡,因此具备成为抗菌药物筛选靶标的可行性.文中应用生物膜干涉(Biolayer interferometry,BLI)技术对LptA/LptC相互作用进行检测,为建立体外的LptA/LptC蛋白相互作用阻断剂筛选方法奠定基础.首先在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行大肠杆菌LptA全长、LptA去信号肽和LptC蛋白的表达;纯化的蛋白使用生物素标记后结合到预先稀释液封闭的超级链霉亲和素(Super streptavidin,SSA)生物传感器,然后再检测与未标记蛋白之间的结合信号,同时做无蛋白的稀释液对照;使用同样的方法检测生物素化蛋白与小分子的结合以及相互作用的阻断;空白对照采用未结合生物素化蛋白的传感器,检测上述系列稀释样品.响应信号采用稳态分析(Steady state analysis)方式拟合,计算样品平衡常数(KD)值.本研究成功获得高纯度的LptA和LptC蛋白,并且检测到结合传感器的LptC蛋白与LptA全长蛋白和LptA去信号肽蛋白均具有良好的结合活性,KD值分别为2.9e-7±7.9e-8、6.0e-742.8e-8;结合传感器的LptA去信号肽蛋白与LptC蛋白具有良好的结合活性,KD值为9.6e-7±7.2e-9;所有结合曲线呈现出明显的快结合-快解离形态.小分子化合物IMB-881能够与LptA结合来阻断LptA/LptC之间的相互作用,与LptC之间无结合活性.文中首次建立了基于BLI技术的LptA/LptC相互作用检测方法,并且证实该方法能够用于小分子阻断剂阻断活性的评价,为后续的LptA/LptC蛋白相互作用阻断剂筛选奠定了基础.
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