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摘要 以贵妃玫瑰葡萄为试材，研究不同消毒时间、取材部位、外植体大小以及不同浓度植物激素对增殖和生根培养的影响，优化组培快繁技术，以期为优良鲜食葡萄品种的快速繁殖提供依据。结果表明，最适宜的外植体消毒条件是用0.5%的次氯酸钠溶液消毒15 min;外植体的最佳取材部位为中部茎段;选用外植体长度和粗度分别为2～<3 cm和0.5～0.8 cm时，组培快繁的效果最佳;增殖培养过程中，最理想的6-BA浓度为1.0 mg /L;生根培养过程中最适IBA浓度为0.5 mg/L。
关键词 葡萄;组织培养;快繁;技术
Abstract In this experiment，taking the Guifeimeigui grape as the test material，the effects of different disinfection time，sampling position，explants size and different concentrations of plant hormones on the proliferation and rooting culture were studied.Tissue culture and rapid propagation technology were optimized to provide reference for the rapid propagation of excellent fresh grape varieties.The results showed that the best sterilizing condition was to sterilize the explants with 0.5% sodium hypochlorite solution for 15 minutes;the best sampling parts of explants were the middle stem segments;when the length and thickness of explant were 2-<3 cm and 0.5-0.8 cm respectively，the effect of tissue culture and rapid propagation was the best.During the proliferation culture，the optimal concentration of 6-BA was 1.0 mg/L;the optimum IBA concentration during rooting culture was 0.5 mg/L.
Key words Grape;Tissue culture;Rapid propagation;Technology
葡萄作為重要的经济类果树作物之一，具有悠久的栽培历史和丰富多样的品种，是世界第二大水果[1-2]。我国作为世界葡萄 （Vitis vinifera L.）的生产大国之一，葡萄的栽培面积和产量均居世界前列。由于葡萄的遗传背景相对复杂，应用传统的育种方式周期长，且新品种的培育较困难;通过扦插或嫁接等方法进行无性繁殖育苗，受到区域、季节变化的局限，周期也较长且易积累病害[3]。多年来，利用组织培养繁育优良苗木品种一直是葡萄育种的研究重点[4-5]。植物组织培养技术能够不受季节限制，快速繁殖优质葡萄苗木，同时降低成本。因此，建立有效的鲜食葡萄品种组培快繁体系，不仅可满足优质苗木的商业化生产需求，还能为优质葡萄市场提供技术参考。
贵妃玫瑰，欧亚种，原产我国。该品种穗形整齐，果皮薄，无涩味，果肉质地软，充分成熟有淡玫瑰香味，品质中上，产量高，具有较好的品种特性[6]。近年来，葡萄设施栽培壮大，该品种也是一个适合设施栽培的早熟品种。快速扩繁该品种，有助于获得较高的经济价值。由于传统繁殖方式的局限性，需要通过组织离体培养的方法来实现其快速繁殖。植物组织培养作为育种技术，在育种、资源保存和生产等方面已经得到广泛应用[7]。虽然葡萄组培快繁应用广泛，但在贵妃玫瑰葡萄上的研究和应用报道很少。该研究以贵妃玫瑰葡萄的嫩枝为研究对象，以MS作为基本培养基，对贵妃玫瑰组培技术条件进行筛选，从而获得合适的培养体系，为利用组培体系进行快速育苗研究提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料 2018年6月上旬，取自山东省农业科学院济阳试验基地葡萄园贵妃玫瑰葡萄的当年生新梢。
1.2 方法
1.2.1 培养基及配制。基本培养基采用 MS和1/2MS，添加6-BA和IBA，调整 pH 至 5.8～6.0，121 ℃高压灭菌 20 min。
1.2.2 试材消毒。
选取半木质化的枝条茎段为外植体，剪掉病、虫、长势弱的枝和叶片，首先用流水冲洗2 h后，用75%酒精消毒10 s，无菌水冲洗 2～3 次，再用0.5 %次氯酸钠分别消毒5、10、15和20 min，无菌水冲洗 4～5 遍，最后用灭菌的滤纸吸去表面多余水分，分别接种于MS 培养基上，每个处理接种20个茎段，重复3次。设置如下培养条件：光照时间16 h/d，光照强度2 000 Lx，温度25 ℃，空气相对湿度 40%～60%。并在1个月后统计芽的成活率。
1.2.3 单芽茎段的处理。
外植体消毒后，分别选取处于顶梢、中上部和基部的单芽茎段各30个接种于MS 培养基上，重复3次，并在1个月后统计芽的成活率。
选择消毒外植体茎，将其剪成长度为 2～<3、3～<4、4～<5 cm，再按粗细分为直径小于 0.5 cm、0.5～0.8 cm、大于0.8 cm 的单芽茎段，分别接种于MS 培养基上，每个处理接种30个茎段，重复 3 次。观察其生长情况，并在1个月后统计芽的萌发率。 1.2.4 增殖和生根培养基的选择。
选择培养获得的无菌单芽茎段芽（长度1.5cm 左右），分别接种于添加6-BA和IAA 2种植物激素的增殖培养基中，并设定3个浓度梯度的6-BA，分别为0.5、1.0和2.0 mg/L，IAA浓度为0.1 mg/L。每种培养基中接种20个茎段，重复3次，1个月后观察并统计生长和增殖情况。
将长势健壮的无菌组培苗接种于含有不同浓度（0、0.2、0.5和1.0 mg/L）IBA的1/2MS培养基上，1个月后观察并统计生根率和生根情况。
1.2.5 炼苗和移栽。
待组培苗长至5～7 cm，带有5片左右叶片时，将幼苗连瓶子一起置于20～28 ℃的温室中炼苗2～3 d，再去掉瓶塞，然后在自然光下炼苗4～7 d（需从室内到室外慢慢过渡），当试管苗不再萎蔫即可出瓶。用镊子小心夹取植株，用干净的温水洗净组织培养苗植株根部的培养基，移栽于准备好的基质中，控制移栽时空气湿度95%以上、温度25 ℃左右。
2 结果与分析
2.1 消毒时间对成活率的影响
不同消毒时间处理下，统计外植体的成活率、污染率和褐死率。结果显示，消毒15 min时，外植体成活率最高，达到86.67%，污染率和褐死率分别为5.00%和8.33%（图1）。表1还表明，随着消毒时间的延长，外植体的污染率逐渐降低，而褐死率逐渐升高。综上表明，消毒15 min时，更适宜于外植体的成活。
2.2 取材部位对发芽率的影响
分别对取于顶梢、中部和基部茎段的外植体发芽率进行统计分析，发现基部部位的外植体发芽率达63.33%，中部部位和顶梢的外植体发芽率分别达87.78%和53.33%（图2）。结果表明，处于中部部位的外植体发芽率最高。因此，外植体的取材部位为中部茎段时最有利于贵妃玫瑰葡萄的离体组织培养。
2.3 外植体长度和粗度对发芽率的影响
将不同外植体长度在 2～5 cm 的茎段接种后统计发芽率，结果如图3所示，当外植体长度在 2～<3、3～<4、4～<5 cm 时，萌芽率分别为 90.00 %、77.78 %和67.78%。由此表明，随着外植体长度的增加，其发芽率降低。上述结果表明，外植体长度处于2～<3 cm 时发芽最好。
同时对处于不同粗度外植体的发芽率也进行了统计。发现小于0.5、0.5～0.8 cm、大于0.8 cm的外植体的发芽率分别是66.67%、88.89%和62.22%（图4）。处于中间粗度的外植体发芽率明显高于另2种粗度。由此说明，当外植体的粗度处于0.5～0.8 cm时，其发芽率最高。
2.4 激素6-BA浓度影响贵妃玫瑰增殖的分析
将单芽茎段芽分别接种于含不同浓度6-BA的3种增殖培养基（MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.1 mg/L，MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L，MS+6-BA 2.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L）中，40 d左右后统计其增殖系数，结果如图5所示。6-BA浓度为0.5、1.0和2.0 mg/L 时，贵妃玫瑰的增殖系数分别是1.85、2.92和2.98，由此表明，随着6-BA浓度的增加，贵妃玫瑰的增殖率呈上升趋势，但浓度为1.0和2.0 mg/L时，其增殖系数相差较小，且前者植株长势的整齐度高于后者。因此，建议选择1.0 mg/L 6-BA的浓度用于贵妃玫瑰的增殖培养。
2.5 激素IBA浓度对贵妃玫瑰生根培养的影响
以贵妃玫瑰无菌组培苗为材料，将其接种于含有不同浓度IBA的生根培养基（A：1/2MS，B：1/2MS+IBA 0.2mg/L，C：1/2MS+IBA 妃玫瑰组培苗生根的影响。由表1和图6可知，生根培养基中加入IBA后，组培苗的生根率得到提高。当IBA浓度为0.2 mg/L，组培苗的叶片和根的生长情况较好，且生根率也较高，当IBA浓度为0.5 mg/L时，组培苗达到最优生长和生根状况。当IBA浓度达到1.0 mg/L时，虽然叶片和根的生长情况较好，但是生根率明显下降。由此表明，最适宜贵妃玫瑰生根的IBA浓度为0.5 mg/L。
3 讨论
外植体的生长发育情况及对其消毒时间的长短，對组培繁育有很大影响[8-9]。外植体消毒作为组织培养的第一步，具有重要作用，不同的消毒处理时间对发芽率尤为重要[10]。该试验中，0.5%次氯酸钠消毒15 min，对无菌培养具有良好
的促进作用。外植体的生长情况也取决于取材的时间。取培养基类型Medium type每株叶片数Number of leaves per plant∥片株高Plant height∥cm每株根数Number of roots per plant∥条平均根长Average root lergth∥cm生根率Rooting rate∥%材时间过早，外植体的半木质化程度低，消毒时容易发生褐化;取材时间过晚，雨季天气来临，病菌种类变多且繁殖活跃，新稍的增殖减慢，不利于快繁体系的建立。
营养物质直接影响组培苗的生长状况[11]，因此培养基组分对增殖和生根培养的作用尤为显著。植物激素作为调控植物生长的活性物质，在细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花与结实、成熟与衰老、休眠与萌发以及离体组织培养等方面都具有重要作用[12-14]。研究表明，外源和内源激素能够相互平衡，更好地调节植物生长和发育，由此在组培过程中有必要在培养基中添加一定量的植物激素来调控生长和分化[15]。该试验的增殖和生根过程中，分别选用MS和1/2MS作为基础培养基，分别选用6-BA和IBA作为生长调节剂。研究发现，加入1.0 mg/L 6-BA时，外植体生长状况良好，但当6-BA 浓度增大到2.0 mg/L时，增殖培养的外植体虽然增殖系数较好，但是易出现畸形，添加活性炭也可以明显减轻褐变，有利于外植体生长，浓度一般为0.1%～0.3%[16]。研究表明，单独使用IBA 可促进组培苗的生根。白瑞兴等[17]选用大量元素减半的B5培养基中添加0.2～0.5 mg/L IAA，成苗率高且植株生长健壮。该试验中，加入不同浓度的IBA均可促进组培苗的生根，且浓度为0.5 mg/L最佳。另外，齐永顺等[18-19]研究表明，内源激素水平对植物生根发育也具有重要作用，在生根诱导过程中，根的伸长、加粗均受到IAA、ABA等内源激素的调控。该研究在贵妃玫瑰的生根诱导过程中，发现IBA浓度增加至1.0 mg/L时，生根数和生根率都很好，但形成大量的愈伤组织且生根分布不均，其原因还需进一步研究。
4 总结
该研究主要对贵妃玫瑰组织培养过程中外植体的选择和继代培养的激素浓度进行了探讨，初步确定了贵妃玫瑰组织培养的技术体系。但是，试验中增殖生根诱导时关于激素配比还需要进一步探究，以期为葡萄苗木的标准化生产提供更多的依据。
参考文献
[1] 金万梅，董静，闫爱玲，等.葡萄器官离体再生和遗传转化体系的建立[J].园艺学报，2008，35（1）：27-32.
[2] 杨晓明.葡萄体胚发生、遗传稳定性及其多倍体植株再生研究[D].兰州：兰州大学，2007.
[3] SIM S T，AL RWAHNIH M，ROWHANI A，et al.Virus elimination from grape selections using tissue culture at Foundation Plant Services，University of California，Davis[C]//Proceedings of the 17th Congress of ICVG.Davis，USA：University of California Davis，2012：262-263.
[4] 李国树，邱璐，徐成东，等.葡萄组织培养快速繁殖体系研究[J].北方园艺，2011（9）：134-136.
关键词 葡萄;组织培养;快繁;技术
Abstract In this experiment，taking the Guifeimeigui grape as the test material，the effects of different disinfection time，sampling position，explants size and different concentrations of plant hormones on the proliferation and rooting culture were studied.Tissue culture and rapid propagation technology were optimized to provide reference for the rapid propagation of excellent fresh grape varieties.The results showed that the best sterilizing condition was to sterilize the explants with 0.5% sodium hypochlorite solution for 15 minutes;the best sampling parts of explants were the middle stem segments;when the length and thickness of explant were 2-<3 cm and 0.5-0.8 cm respectively，the effect of tissue culture and rapid propagation was the best.During the proliferation culture，the optimal concentration of 6-BA was 1.0 mg/L;the optimum IBA concentration during rooting culture was 0.5 mg/L.
Key words Grape;Tissue culture;Rapid propagation;Technology
葡萄作為重要的经济类果树作物之一，具有悠久的栽培历史和丰富多样的品种，是世界第二大水果[1-2]。我国作为世界葡萄 （Vitis vinifera L.）的生产大国之一，葡萄的栽培面积和产量均居世界前列。由于葡萄的遗传背景相对复杂，应用传统的育种方式周期长，且新品种的培育较困难;通过扦插或嫁接等方法进行无性繁殖育苗，受到区域、季节变化的局限，周期也较长且易积累病害[3]。多年来，利用组织培养繁育优良苗木品种一直是葡萄育种的研究重点[4-5]。植物组织培养技术能够不受季节限制，快速繁殖优质葡萄苗木，同时降低成本。因此，建立有效的鲜食葡萄品种组培快繁体系，不仅可满足优质苗木的商业化生产需求，还能为优质葡萄市场提供技术参考。
贵妃玫瑰，欧亚种，原产我国。该品种穗形整齐，果皮薄，无涩味，果肉质地软，充分成熟有淡玫瑰香味，品质中上，产量高，具有较好的品种特性[6]。近年来，葡萄设施栽培壮大，该品种也是一个适合设施栽培的早熟品种。快速扩繁该品种，有助于获得较高的经济价值。由于传统繁殖方式的局限性，需要通过组织离体培养的方法来实现其快速繁殖。植物组织培养作为育种技术，在育种、资源保存和生产等方面已经得到广泛应用[7]。虽然葡萄组培快繁应用广泛，但在贵妃玫瑰葡萄上的研究和应用报道很少。该研究以贵妃玫瑰葡萄的嫩枝为研究对象，以MS作为基本培养基，对贵妃玫瑰组培技术条件进行筛选，从而获得合适的培养体系，为利用组培体系进行快速育苗研究提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料 2018年6月上旬，取自山东省农业科学院济阳试验基地葡萄园贵妃玫瑰葡萄的当年生新梢。
1.2 方法
1.2.1 培养基及配制。基本培养基采用 MS和1/2MS，添加6-BA和IBA，调整 pH 至 5.8～6.0，121 ℃高压灭菌 20 min。
1.2.2 试材消毒。
选取半木质化的枝条茎段为外植体，剪掉病、虫、长势弱的枝和叶片，首先用流水冲洗2 h后，用75%酒精消毒10 s，无菌水冲洗 2～3 次，再用0.5 %次氯酸钠分别消毒5、10、15和20 min，无菌水冲洗 4～5 遍，最后用灭菌的滤纸吸去表面多余水分，分别接种于MS 培养基上，每个处理接种20个茎段，重复3次。设置如下培养条件：光照时间16 h/d，光照强度2 000 Lx，温度25 ℃，空气相对湿度 40%～60%。并在1个月后统计芽的成活率。
1.2.3 单芽茎段的处理。
外植体消毒后，分别选取处于顶梢、中上部和基部的单芽茎段各30个接种于MS 培养基上，重复3次，并在1个月后统计芽的成活率。
选择消毒外植体茎，将其剪成长度为 2～<3、3～<4、4～<5 cm，再按粗细分为直径小于 0.5 cm、0.5～0.8 cm、大于0.8 cm 的单芽茎段，分别接种于MS 培养基上，每个处理接种30个茎段，重复 3 次。观察其生长情况，并在1个月后统计芽的萌发率。 1.2.4 增殖和生根培养基的选择。
选择培养获得的无菌单芽茎段芽（长度1.5cm 左右），分别接种于添加6-BA和IAA 2种植物激素的增殖培养基中，并设定3个浓度梯度的6-BA，分别为0.5、1.0和2.0 mg/L，IAA浓度为0.1 mg/L。每种培养基中接种20个茎段，重复3次，1个月后观察并统计生长和增殖情况。
将长势健壮的无菌组培苗接种于含有不同浓度（0、0.2、0.5和1.0 mg/L）IBA的1/2MS培养基上，1个月后观察并统计生根率和生根情况。
1.2.5 炼苗和移栽。
待组培苗长至5～7 cm，带有5片左右叶片时，将幼苗连瓶子一起置于20～28 ℃的温室中炼苗2～3 d，再去掉瓶塞，然后在自然光下炼苗4～7 d（需从室内到室外慢慢过渡），当试管苗不再萎蔫即可出瓶。用镊子小心夹取植株，用干净的温水洗净组织培养苗植株根部的培养基，移栽于准备好的基质中，控制移栽时空气湿度95%以上、温度25 ℃左右。
2 结果与分析
2.1 消毒时间对成活率的影响
不同消毒时间处理下，统计外植体的成活率、污染率和褐死率。结果显示，消毒15 min时，外植体成活率最高，达到86.67%，污染率和褐死率分别为5.00%和8.33%（图1）。表1还表明，随着消毒时间的延长，外植体的污染率逐渐降低，而褐死率逐渐升高。综上表明，消毒15 min时，更适宜于外植体的成活。
2.2 取材部位对发芽率的影响
分别对取于顶梢、中部和基部茎段的外植体发芽率进行统计分析，发现基部部位的外植体发芽率达63.33%，中部部位和顶梢的外植体发芽率分别达87.78%和53.33%（图2）。结果表明，处于中部部位的外植体发芽率最高。因此，外植体的取材部位为中部茎段时最有利于贵妃玫瑰葡萄的离体组织培养。
2.3 外植体长度和粗度对发芽率的影响
将不同外植体长度在 2～5 cm 的茎段接种后统计发芽率，结果如图3所示，当外植体长度在 2～<3、3～<4、4～<5 cm 时，萌芽率分别为 90.00 %、77.78 %和67.78%。由此表明，随着外植体长度的增加，其发芽率降低。上述结果表明，外植体长度处于2～<3 cm 时发芽最好。
同时对处于不同粗度外植体的发芽率也进行了统计。发现小于0.5、0.5～0.8 cm、大于0.8 cm的外植体的发芽率分别是66.67%、88.89%和62.22%（图4）。处于中间粗度的外植体发芽率明显高于另2种粗度。由此说明，当外植体的粗度处于0.5～0.8 cm时，其发芽率最高。
2.4 激素6-BA浓度影响贵妃玫瑰增殖的分析
将单芽茎段芽分别接种于含不同浓度6-BA的3种增殖培养基（MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.1 mg/L，MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L，MS+6-BA 2.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L）中，40 d左右后统计其增殖系数，结果如图5所示。6-BA浓度为0.5、1.0和2.0 mg/L 时，贵妃玫瑰的增殖系数分别是1.85、2.92和2.98，由此表明，随着6-BA浓度的增加，贵妃玫瑰的增殖率呈上升趋势，但浓度为1.0和2.0 mg/L时，其增殖系数相差较小，且前者植株长势的整齐度高于后者。因此，建议选择1.0 mg/L 6-BA的浓度用于贵妃玫瑰的增殖培养。
2.5 激素IBA浓度对贵妃玫瑰生根培养的影响
以贵妃玫瑰无菌组培苗为材料，将其接种于含有不同浓度IBA的生根培养基（A：1/2MS，B：1/2MS+IBA 0.2mg/L，C：1/2MS+IBA 妃玫瑰组培苗生根的影响。由表1和图6可知，生根培养基中加入IBA后，组培苗的生根率得到提高。当IBA浓度为0.2 mg/L，组培苗的叶片和根的生长情况较好，且生根率也较高，当IBA浓度为0.5 mg/L时，组培苗达到最优生长和生根状况。当IBA浓度达到1.0 mg/L时，虽然叶片和根的生长情况较好，但是生根率明显下降。由此表明，最适宜贵妃玫瑰生根的IBA浓度为0.5 mg/L。
3 讨论
外植体的生长发育情况及对其消毒时间的长短，對组培繁育有很大影响[8-9]。外植体消毒作为组织培养的第一步，具有重要作用，不同的消毒处理时间对发芽率尤为重要[10]。该试验中，0.5%次氯酸钠消毒15 min，对无菌培养具有良好
的促进作用。外植体的生长情况也取决于取材的时间。取培养基类型Medium type每株叶片数Number of leaves per plant∥片株高Plant height∥cm每株根数Number of roots per plant∥条平均根长Average root lergth∥cm生根率Rooting rate∥%材时间过早，外植体的半木质化程度低，消毒时容易发生褐化;取材时间过晚，雨季天气来临，病菌种类变多且繁殖活跃，新稍的增殖减慢，不利于快繁体系的建立。
营养物质直接影响组培苗的生长状况[11]，因此培养基组分对增殖和生根培养的作用尤为显著。植物激素作为调控植物生长的活性物质，在细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花与结实、成熟与衰老、休眠与萌发以及离体组织培养等方面都具有重要作用[12-14]。研究表明，外源和内源激素能够相互平衡，更好地调节植物生长和发育，由此在组培过程中有必要在培养基中添加一定量的植物激素来调控生长和分化[15]。该试验的增殖和生根过程中，分别选用MS和1/2MS作为基础培养基，分别选用6-BA和IBA作为生长调节剂。研究发现，加入1.0 mg/L 6-BA时，外植体生长状况良好，但当6-BA 浓度增大到2.0 mg/L时，增殖培养的外植体虽然增殖系数较好，但是易出现畸形，添加活性炭也可以明显减轻褐变，有利于外植体生长，浓度一般为0.1%～0.3%[16]。研究表明，单独使用IBA 可促进组培苗的生根。白瑞兴等[17]选用大量元素减半的B5培养基中添加0.2～0.5 mg/L IAA，成苗率高且植株生长健壮。该试验中，加入不同浓度的IBA均可促进组培苗的生根，且浓度为0.5 mg/L最佳。另外，齐永顺等[18-19]研究表明，内源激素水平对植物生根发育也具有重要作用，在生根诱导过程中，根的伸长、加粗均受到IAA、ABA等内源激素的调控。该研究在贵妃玫瑰的生根诱导过程中，发现IBA浓度增加至1.0 mg/L时，生根数和生根率都很好，但形成大量的愈伤组织且生根分布不均，其原因还需进一步研究。
4 总结
该研究主要对贵妃玫瑰组织培养过程中外植体的选择和继代培养的激素浓度进行了探讨，初步确定了贵妃玫瑰组织培养的技术体系。但是，试验中增殖生根诱导时关于激素配比还需要进一步探究，以期为葡萄苗木的标准化生产提供更多的依据。
参考文献
[1] 金万梅，董静，闫爱玲，等.葡萄器官离体再生和遗传转化体系的建立[J].园艺学报，2008，35（1）：27-32.
[2] 杨晓明.葡萄体胚发生、遗传稳定性及其多倍体植株再生研究[D].兰州：兰州大学，2007.
[3] SIM S T，AL RWAHNIH M，ROWHANI A，et al.Virus elimination from grape selections using tissue culture at Foundation Plant Services，University of California，Davis[C]//Proceedings of the 17th Congress of ICVG.Davis，USA：University of California Davis，2012：262-263.
[4] 李国树，邱璐，徐成东，等.葡萄组织培养快速繁殖体系研究[J].北方园艺，2011（9）：134-136.